1-qism: Per1 sirkadiyalik genining epigenetik regulyatsiyasi Hipokampal xotiradagi yoshga bog'liq o'zgarishlarga yordam beradi
Mar 19, 2022
Aloqa: Audrey Xuaudrey.hu@wecistanche.com
Janine L. Kwapis1,2,3, Yasaman Alaghband1,2, Enikö A. Kramár1,2, Alberto J. López1,2, Enni Vogel Ciernia4, André O. White5, Guanhua Shu1,2, Diane Rhee1,2,
Kristina M. Maykl1,2, Emilie Montelye6, Yu Liu7,8, Kristof N. Magnan7,8, Sivey Chen7,8, Paolo Sassone-Korsi6, Per Baldi7,8, Dina P. Matheos1,2 va Marselo A. Vud1,2 ,3
Qarish ham sirkadiyalik ritmiklik, ham uzoq muddatli buzilishlar bilan birga keladi.xotira. Bu aniq bo'lsa-daxotiraishlash sirkadiyalik velosipedda ta'sir qiladi, sirkadiyalik soatning yoshga bog'liq buzilishi hipokampalning buzilishiga olib keladimi yoki yo'qmi noma'lum.xotira. Bu erda biz HDAC3 repressiv giston deasetilazasi uzoq muddatli xotirani, sinaptik plastisiyani va ritmik sirkadiyalik faollik naqshlariga ta'sir qilmasdan qarigan hipokampusdagi Perlin sirkadiyalik genining tajribaga asoslangan ifodasini cheklashini ko'rsatamiz. Shuningdek, biz hipokampal Per] uzoq muddat uchun juda muhim ekanligini ko'rsatamizxotirashakllanishi. Birgalikda bizning ma'lumotlarimiz asosiy sirkadiyalik soatdagi o'zgarishlar sirkadiyalik bilan bog'liq o'zgarishlarni boshqaradi degan an'anaviy g'oyaga qarshi chiqadi.xotirashakllanishi va buning o'rniga, uzoq muddatli xotira shakllanishi ehtimolini yo'qotish uchun hipokampal hujayralardagi sirkadiyalik soat geni funktsiyasi uchun ko'proq avtonom rol o'ynaydi.
Cistanche xotirani yaxshilashi mumkin
Hayvonlar har 24 soatda biologik jarayonlarning ritmik aylanishini boshqaradigan ichki sirkadiyalik soatga ega. Sirkadiyalik ritmlar ko'plab fiziologik hodisalarni, jumladan uyqu-uyg'onish siklini, ovqatlanish harakati, tana harorati va metabolizmni boshqaradi. Asosiy sirkadiyalik soatda, supraxiazmatik yadroda (SCN) bir guruh yadro soati genlari har 24 soat 1,2 da bir marta aylanadigan salbiy teskari aloqa zanjirida tebranadi. Asosiy biologik jarayonlarni tartibga solishdan tashqari, sirkadiyalik soat ham kuchli ta'sirga ega.xotira. Transkripsiyaga bog'liq bo'lgan uzoq muddatli xotira kunning kuchli ta'sirini ko'rsatadi, sichqonlarda kun davomida xotiraning eng yuqori ko'rsatkichlari (faol bo'lmagan faza) 3,4. Ta'kidlash joizki, ikkalasi ham uzoq muddatlixotirava sirkadiyalik ritmiklik 5 yoshga kelib buziladi, bu ikkala jarayonning asosida umumiy molekulyar mexanizmlar yotishi mumkinligini ko'rsatadi. Bir fikr shundaki, soat genlari joylashganxotira-dorsal gippokamp kabi tegishli tuzilmalar hayvonning uzoq muddatli shakllanish qobiliyatiga ega bo'lishi mumkin.xotirakun vaqtiga qarab 6. Shunga mos ravishda, miya bo'ylab bir nechta individual soat genlarining buzilishi yosh hayvonlarda hipokampal uzoq muddatli xotirani buzishi mumkin. Bugungi kunga qadar hech qanday tadqiqot dorsal hipokampusdagi sirkadiyalik gen funktsiyasini tanlab buzmaganligi sababli, soat genlari hipokampus hujayralarida uzoq muddatli ta'sir qilish uchun harakat qiladimi yoki yo'qmi, aniq emas.xotirashakllanishi yoki bu xotira tanqisligi miyaning boshqa hududlarida, masalan, sirkadiyalik ritmlarning buzilishi, uyqu tanqisligi yoki hatto rivojlanish anomaliyalari kabi maqsaddan tashqari ta'sirlardan kelib chiqadimi.
Keksayib qolgan miyada gen ekspressiyasi pasayadi, bu esa kromatinning yanada repressiv tuzilishining natijasi bo'lishi mumkin. Transkripsiya qisman xromatin strukturasidagi o'zgarishlar orqali nazorat qilinadi, bu o'rganish hodisasidan keyin neyron DNKga kirishni dinamik ravishda oshirishi yoki cheklashi mumkin. Barns va Sweatt tomonidan ilgari surilgan gipotezalardan biri epigenomning qarish neyronlarida o'zgarishini, natijada uzoq muddatli xotira shakllanishi uchun zarur bo'lgan normal gen ekspressiyasiga to'sqinlik qiluvchi repressiv xromatin tuzilishini ta'kidlaydi7. Bir nechta tadqiqotlar qarigan miyada histonni o'zgartirish mexanizmlarining o'zgarishini ko'rsatadigan bu fikrni qo'llab-quvvatlaydi8-10. Biroq, xromatinni o'zgartirish mexanizmlari sirkadiyalik gen ekspressiyasini g'ayritabiiy tarzda tartibga soladimi yoki yo'qmi?xotiramiya hududi noma'lum. Bu erda biz giston deasetilaza 3 (HDAC3) ga bog'liq bo'lgan yoshga bog'liq xotira va gen ekspressiyasini tartibga solishga e'tibor qaratish orqali ushbu imkoniyatni ko'rib chiqdik. Dorsal gipokampusdagi HDAC3 ning yo‘q qilinishi yoki buzilishi 18-oylik sichqonlarda uzoq muddatli xotiradagi yoshga bog‘liq buzilishlarni va sinaptik plastisiyani yaxshilashini aniqladik. gen davri 1 (Per1). Keng ma'noda, bu ish Per1 uzoq muddatda yoshga bog'liq buzilishlarga yordam beradigan mexanizm bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.xotirava tuzilishiga qarab sirkadiyalik ritmiklik.
Natijalar
HDAC3 yoshga bog'liqxotirabuzilishlar. Biz birinchi navbatda repressiv giston deasetilaz HDAC3 yoshga bog'liq rol o'ynaydimi yoki yo'qligini sinab ko'rdik.xotirapasayish. HDAC3 xotira shakllanishining kuchli salbiy regulyatori bo‘lib, yosh hayvonlarda HDAC3 ning buzilishi poldan past o‘rganish hodisasini bir nechta vazifalar uchun doimiy uzoq muddatli xotira hosil qiluvchi bittaga aylantirishi mumkin11-14. Biz qarigan (18-oylik) sichqonlarning dorsal hipokampusida HDAC3 ni buzishning ikkita usulidan foydalandik. Birinchidan, AAV2.1-CaMKII-Cre rekombinazini (har bir tomon uchun 1 mkl) HDAC3flox/flox sichqonlarining dorsal gippokampiga quyish orqali HDAC3 ning fokal homozigotli delektsiyalarini yaratdik (Qo'shimcha rasm. 1a). Ikkinchidan, HDAC3 ning fermentativ faolligini tanlab blokirovka qilish uchun biz dominant-salbiy nuqta mutant virusi AAV2 dan foydalandik.1-CMV- HDAC3(Y298H)-v5 u HDAC3 deasetilaz faolligini oqsil-oqsil o‘zaro ta’siriga ta’sir qilmasdan bloklaydi (qarang. 12,15–17 qo'shimcha rasm 1b). Viruslar ikkitadan kiritildiTreningdan bir necha hafta oldin, bu HDAC3 manipulyatsiyalari ustidan qattiq fazoviy va vaqtinchalik nazorat qilish imkonini beradi, bu esa ishlab chiqish jarayonida uzoq vaqt davomida HDAC3 buzilishi natijasida yuzaga kelishi mumkin bo'lgan nojo'ya ta'sirlarni oldini oladi18,19. AAV-CaMKII-Cre infuzionidan ikki hafta o'tgach (Qo'shimcha 1c-rasm), biz Hdac3 mRNK ifodasi ob'ektning joylashishini o'rgatish bilan ta'sir qilmaganini kuzatdik.xotira(OLM), ammo hipokampal Hdac3 ning genetik yo'q qilinishi HDAC3 oqsiliga qo'shimcha ravishda Hdac3 mRNK (qo'shimcha 1d-rasm) ifodasini buzdi (qo'shimcha rasm 1a).
HDAC3-ni o'chirish yaxshilanganligini aniqlash uchunxotiraqarigan sichqonlarda biz hipokampal HDAC3 o'chirish (HDAC3flox/flox) yoki faoliyatning buzilishi (HDAC3 (Y298H)) OLM uchun uzoq muddatli xotiraga ta'sirini sinab ko'rdik (1a-rasm). Yoshga bog‘liq gippokampal xotira yetishmovchiligi haqidagi ko‘plab hisobotlarga muvofiq, biz qarigan 18-mo yovvoyi tipdagi (HDAC3 plus / plus) sichqonlar 10-daqiqalik mashg‘ulotdan so‘ng OLM uchun yomon xotirani ko‘rsatishini aniqladik va bunda sezilarli o‘sish kuzatilmadi. Trening va test o'rtasidagi DI (1b-rasm, kulrang chiziqlar). Muhimi, 10-daqiqalik mashg‘ulot.
2 TABIAT ALOQASI|(2018)9:3323 |DOI: 10.1038/s41467-018-05868-0 |www.nature.com/naturecommunications
1-rasm HDAC3 ni yo'q qilish yoki buzish hipokampal xotirada yoshga bog'liq buzilishlarni yaxshilaydi. OLM protsedurasi. AAV mashg'ulotdan 2 hafta oldin yuborilgan. b 18-mo HDAC3flox/flox sichqonlari yovvoyi tipdagi (HDAC3 plus/plus) yalang'och hayvonlarga nisbatan OLM uchun sezilarli darajada yaxshi xotirani ko'rsatdi (Ikki tomonlama ANOVA: Muhim Genotip x Sessiya o'zaro ta'siri (F(1,29) {{1{) {12}}}}.96, p < 0.001),="" sidakning="" posthoc="" testlari,="" ***p="">< 0.001,="" n="" {{="" 16}}(5f),="" 17(6f)).="" c="" sinovda="" ikkala="" guruh="" uchun="" jami="" tadqiqot="" o'xshash="" edi="" (t(29)="1.67," ***p="0.11)." d="" aav-hdac3="" (y298h)-v5="" bilan="" dorsal="" gipokampusdagi="" hdac3="" faolligini="" buzish,="" shuningdek,="" 18-="" oylik="" sichqonlarda="" hipokampal="" xotira="" buzilishlarini="" yaxshiladi="" (ikki="" tomonlama="" anova:="" sessiyaning="" asosiy="" effekti="" (f(1,16)="" {{35)="" }}.96,="" p=""><0.001), sidakning="" post="" hoc="" testlari,="" ***p=""><0.001, *p=""><0.05, n="9,10;" barcha="" erkaklar).="" e="" umumiy="" tadqiqot="" vaqti="" testda="" ikkala="" guruh="" uchun="" ham="" o'xshash="" edi="" (t(16)="0.28," p="0.78)." f="" orm="" eksperimental="" protsedurasi,="" olm="" tugagandan="" 2="" hafta="" o'tgach.="" g="" 18-mo="" hdac3flox/flox="" sichqonlari="" va="" hdac3="" plus/plus="" sichqonlar="" yangi="" ob'yektga="" unchalik="" afzal="" emas="" (ikki="" tomonlama="" anova,="" asosiy="" effektlar="" yoki="" o'zaro="" ta'sir="" yo'q,="" n="14(5" f),="" 17(="" 6="" f)).="" h="" umumiy="" tadqiqot="" vaqti="" sinovda="" ikkala="" guruh="" uchun="" ham="" o'xshash="" edi="" (t(29)="0.59," p="0.56)." i="" aav-hdac3(y298h)="" yordamida="" dorsal="" gipokampusdagi="" hdac3="" faolligini="" buzish="" ormga="" ham="" ta'sir="" ko'rsatmadi,="" hech="" bir="" guruh="" yangi="" ob'ektni="" afzal="" ko'rmadi="" (ikki="" tomonlama="" anova,="" asosiy="" effektlar="" yoki="" o'zaro="" ta'sir="" yo'q,="" n="9" ,10;="" barcha="" erkaklar).="" j="" guruhlar="" sinovda="" xuddi="" shunday="" umumiy="" tadqiqot="" vaqtini="" ko'rsatdi="" (t(16)="0.28," p="0.78)." ma'lumotlar="" o'rtacha="" ±="" sem="" sifatida="" taqdim="" etiladi;="" qora="" doiralar,="" erkaklar;="" kulrang="" kvadratchalar,="" urg'ochilar="" odatda="" yosh="" sichqonlarda="" kuchli="" uzoq="" muddatli="" xotira="" hosil="" qiladi20.="" bundan="" farqli="" oʻlaroq,="" 18-mo="" hdac3flox/flox="" littermates="" mustahkam="" uzoq="" muddatli="" xotirani="" shakllantirdi="" (1b-rasm,="" choyshablar),="" mashgʻulotlarga="" nisbatan="" harakatlanuvchi="" obʼyektni="" dam="" olishda="" afzal="" koʻrish="" sezilarli="" darajada="" oshdi.="" hdac3flox/flox="" sichqonlari="" sinov="" seansi="" davomida="" umumiy="" tadqiqotning="" o‘xshash="" darajalariga="" qaramasdan="" hdac3="" plus/plus="" sichqonlarga="" qaraganda="" testda="" sezilarli="" darajada="" yuqori="" di="" ko‘rsatdi="" (1c-rasm).="" biz="" faoliyatga="" xos="" aav-hdac3="" (y298h)="" virusi="" bilan="" o'xshash="" ta'sirlarni="" kuzatdik.="" qarish,="" 18-mo="" boʻsh="" vektor="" (ev)="" nazorat="" qiluvchi="" sichqonlar="" olm="" uchun="" xotiraning="" yomonligini="" koʻrsatdi,="" aav-hdac3(y298h)="" dh="" ga="" kiritilgan="" sichqonlar="" esa,="" umumiy="" tadqiqotda="" oʻzgarmagan="" holda="" harakatlanuvchi="" obʼyektga="" nisbatan="" ancha="" yuqori="" afzallik="" koʻrsatdi="" (1-rasm).="" 1d,="" e).="" yovvoyi="" turdagi="" sichqonlarda="" kuzatilgan="" zaif="" uzoq="" muddatli="" xotiradan="" farqli="" ravishda="">
(Fig. 1b, d), OLM uchun qisqa muddatli xotira (60 m keyin sinovdan o'tgan
sotib olish; Qo'shimcha rasm 2a) HDAC3 plus/plus va HDAC3flox/flox sichqonlari uchun buzilmagan (Qo'shimcha rasm 2b, c) va bu guruhlar o'rtasida tashvishda sezilarli farq yo'q (Qo'shimcha rasm 2d). Shuningdek, biz odatlanish paytida guruhlar o'rtasidagi harakatda sezilarli farqni kuzatmadik (Qo'shimcha shakllar 2e, f, 8a, b). Birgalikda, bu natijalar OLMdagi yoshga bog'liq buzilishlar dorsal hipokampusdagi HDAC3 ni yo'q qilish yoki buzish orqali yaxshilanishini ko'rsatadi.
Keyinchalik biz HDAC3 fokal manipulyatsiyasi ob'ektni aniqlashga ta'sir qiladimi yoki yo'qligini sinab ko'rdikxotira(ORM), bu olish uchun dorsal gippokampusni talab qilmaydi20. Bu vazifada bitta tanish ob'ekt yangi narsa bilan almashtiriladi (1f-rasm). Dorsal hipokampusdagi HDAC3 ni yo'q qilish yordam bermadixotiraORM uchun HDAC3 plus/plus va HDAC3flox/flox sichqonlari o'qitish bilan solishtirganda sinovda yangi ob'ektni afzal ko'rmaydi (1g-rasm). Shunga qaramay, test sessiyasi davomida guruhlar umumiy qidiruv darajalarida farq qilmadi (1h-rasm). Xuddi shunday, hipokampusdagi HDAC3 ning faoliyatga xos bo'lgan buzilishi yoshga bog'liq ORM buzilishlarini yaxshilay olmadi (1i, j-rasm). Shunday qilib, uzoq muddatli ORMdagi yoshga bog'liq buzilishlar HDAC3 ning hippokampal o'chirilishi yoki buzilishi bilan yaxshilanmagan.
Birgalikda, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, dorsal hipokampusdagi HDAC3 ning yo'q qilinishi yoki buzilishi yoshga bog'liq uzoq muddatli vaziyatni yaxshilashi mumkin.xotirahipokampusga bog'liq bo'lgan vazifa (OLM; 1a-e-rasm) hipokampusdan mustaqil vazifa uchun xotiraga ta'sir qilmasdan (ORM; 1f-j-rasm). Muhimi, barcha sichqonlar qisqa muddatli buzilmaganligini ko'rsatdixotiraOLM uchun (Qo'shimcha 2-rasm), bu hayvonlar odatda xotiraga ega bo'ladi, lekin bu ma'lumotni uzoq muddatli kuzatilishi mumkin bo'lgan ma'lumotlarni birlashtira olmaydi.xotira. Qisqa muddatli xotira transkripsiyadan mustaqil bo'lganligi sababli (ko'rib chiqish uchun21), bu topilma qarigan sichqonlarda o'rganish bilan bog'liq gen ekspressiyasi o'zgarib, uzoq muddatli xotirada yoshga bog'liq buzilishlarga olib keladi degan fikrga mos keladi.
HDAC3 buzilishi LTPdagi yoshga bog'liq buzilishlarni bartaraf qiladi.
HDAC3 ning yoshga bog'liq sinaptik plastisiyaning buzilishiga ham hissa qo'shishini tekshirish uchun biz HDAC3 ning o'chirilishi yoki buzilishidan keyin o'tkir hipokampal bo'laklarda uzoq muddatli potentsiallanishni (LTP) ko'rib chiqdik. LTP ham yosh bilan buziladi, ayniqsa stimulyatsiya protokoli LTP induksiya chegarasiga yaqin bo'lsa22. Virusli infuziondan ikki hafta o'tgach, biz gippokampal bo'laklarni tayyorladik va Schafferning garov kirishiga 5 teta portlashdan iborat bitta poezd bilan LTP ni qo'shdik va CA1b apikal dendritlaridan dala EPSPlarini qayd etdik. Rag'batlantirishning bu nisbatan engil shakli yosh HDAC3 plyus / plyus bo'laklarida barqaror LTP darajasini hosil qildi (2a-rasm). HDAC3 ni hipokampusda yaxshilangan LTPda yo'q qilish, HDAC3flox/flox sichqonlari yovvoyi turdagi boshqaruvlarga qaraganda sezilarli darajada yuqori potentsiyani ko'rsatadi. Bashorat qilinganidek, qarish-18-oy HDAC3 plus/plus sichqonlarida LTP buzilgan va HDAC3 oʻchirilsa, bu kamchilik yaxshilanib, yosh yovvoyi tipdagi sichqonlar bilan taqqoslanadigan LTP hosil boʻldi (2b, c-rasm) boshlangʻich sinaptik taʼsirga ega emas. uzatish (2g-rasm, h).
Biz shunga o'xshash natijalarni faoliyatga xos buzilish bilan kuzatdik. Bu erda biz sub'ektlar ichidagi dizayndan foydalandik, unda yosh va qari yovvoyi tipdagi sichqonlar nazorat virusi (AAV-EV) bilan bitta gippokampga va AAV-HDAC3 (Y298H) qarama-qarshi gipokampusga kiritildi. Avvalgidek, biz HDAC3 faolligini buzish yosh sichqonlarning bo'laklarida LTPni kuchaytirganini aniqladik (2d-rasm) va qarigan sichqonlarning tilimlarida yoshga bog'liq LTP buzilishlarini yaxshiladi (2e, f-rasm) asosiy sinaptik uzatishga xalaqit bermasdan (2i-rasm). , j). Shuning uchun HDAC3 ning yo'q qilinishi yoki buzilishi hipokampal LTPdagi yoshga bog'liq buzilishlarni yaxshilashi mumkin.
Yoshi buzilgan genlarning bir qismi HDAC3 yo'q qilinishi bilan yaxshilanadi. Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, HDAC3-ni yo'q qilish yoki buzish uzoq muddatli xotira va sinaptik plastisiyadagi yoshga bog'liq buzilishlarni yaxshilaydi. Keyinchalik biz HDAC3 ni yo'q qilish orqali hipokampal gen ekspresyonidagi yoshga bog'liq kamchiliklarni ham yaxshilash mumkinligini so'radik. Biz eski miyada HDAC3 faolligining buzilishi g'ayrioddiy repressiv xromatin tuzilishiga olib keladi, bu gen ekspressiyasini cheklaydi, bu esa oxir-oqibat uzoq muddatli ta'sirga olib keladi.xotira. Yosh va qarigan miyada HDAC3 tomonidan qaysi o'ziga xos genlar boshqarilishini aniqlash uchun biz RNK ketma-ketligi bo'yicha tajriba o'tkazdik, unda yosh (3- oy) yovvoyi tipdagi sichqonlar, qarish (18- oy) HDAC3 ni solishtirdik. plus / plus sichqonlar va qarish (18-oy) HDAC3flox/flox axlatlari. davomida gen ifodasi o'zgarishlar aniqlash uchunxotirakonsolidatsiyada, har bir guruhdagi hayvonlar OLM mashqlaridan 10-daqiqa keyin 60 m o'ldirilgan va uy qafasi (HC) nazorati bilan solishtirilgan. Xaploid genomni xaritalash va ko'rib chiqishdan so'ng 23,24, ketma-ketlik sifati baholandi (Qo'shimcha shakl 3a, b) va ifoda profilidagi sezilarli farqlar p <0,0520 uchun="" barcha="" juftlik="" namunalari="" o'rtasida="">
Tajribadan kelib chiqqan gen ekspressiyasi, avval aytib o'tilganidek, eski miyada o'zgarishini kutgan edik, genlarning bir qismi o'rganishdan keyin ifoda eta olmaydi. Shuning uchun biz uy qafasi nazorati bilan solishtirganda o'qitilgan guruhlarda sezilarli darajada yuqori darajada ifodalangan genlarga e'tibor qaratdik. Har bir guruh (Young WT, Old WT, Old HDAC3flox/flox) OLM treningi natijasida paydo bo'lgan ko'p sonli genlarni ko'rsatgan bo'lsa-da, har bir guruh o'ziga xos gen ekspresyon profilini ko'rsatdi (3a-rasm, qo'shimcha jadvallar 1-3). Eski miyalaryosh yovvoyi tipda ham, eski HDAC3flox/flox guruhlarida ham yuqori tartibga solingan, bu eski yovvoyi tipdagi gippokampda tajribaga bog'liq o'sishni ko'rsatmaydi. Bular OLM ta'limidan so'ng eski miyada odatda ifoda eta olmaydigan genlardir, lekin HDAC3 o'chirish orqali qutqariladi va shuning uchun HDAC3 o'chirilishi yoshga bog'liq xotira buzilishlarini yaxshilaydigan mexanizm sifatida ishlashi mumkin. Ushbu guruhda to'rtta gen aniqlangan: Nr4a1, Egr1, Tsc22d3 va Per1. Bu genlarning barchasi xotira shakllanishiga keng ta'sir ko'rsatgan6,26,27, garchi bu ushbu genlarning tajribaga asoslangan ifodasi yosh bilan buzilganligini va HDAC3 yo'q qilinishi bilan qutqarilganligini ko'rsatadigan birinchi tadqiqotdir.
HDAC3 ni o'chirish Per1 dagi yoshga bog'liq kamchiliklarni yaxshilaydi. Bizning RNK-seqimiz orqali aniqlangan genlardan Period1 (Per1) HDAC3flox/flox guruhidagi OLM ta'limi tomonidan eng kuchli induktsiya qilingan (3c-rasm). Bu maqsad ayniqsa qiziq, chunki Per1 odatda sirkadiyalik ritmlar kontekstida o'rganiladi, lekin u hipokampalda ham qo'llaniladi.xotirashakllantirish6,28,29. Qarish sirkadiyalik ritmlardagi buzilishlar5 bilan kechishi va xotira kunning vaqtiga bog'liqligi ma'lum bo'lganligi sababli, HDAC3 ning ushbu maqsadi qarish, xromatin o'zgarishi va sirkadiyalik soat o'rtasidagi muhim va to'liq o'rganilmagan interfeysni ko'rsatishi mumkin.
Eski HDAC3 plus/plus va eski HDAC3flox/flox hayvonlarida Per1 ifodasini qo'shimcha tekshirish uchun biz RT-qPCR va ChIP-qPCR dan foydalandik. Biz OLM treningi 18-mo HDAC3 plus/plus sichqonlarning dorsal hipokampusida Per1 ning yuqori regulyatsiyasini keltirib chiqara olmaganligini aniqladik, ammo HDAC3 (HDAC3flox/flox) yo‘qligida OLM mashg‘ulotlari Per1 mRNKning sezilarli o‘sishiga sabab bo‘ldi. 3f-rasm). Shuningdek, biz uzoq muddatda yaxshi hujjatlashtirilgan rol o'ynaydigan ikkita qo'shimcha genning ifodasini o'lchadikxotirashakllanishi: Arc va cFos31. Tajriba natijasida paydo bo'lgan Ark ifodasi qarigan yovvoyi tipdagi miyada saqlanib qolgan va HDAC3 o'chirilishiga ta'sir qilmagan (qo'shimcha 3c-rasm). Boshqa tomondan, cFos ifodasi eski HDAC3 plus/plus gipokampusda OLM ta'limi bilan induktsiya qilinmadi, ammo HDAC3 ni o'chirish bu muvaffaqiyatsiz induksiyani tiklash uchun etarli emas edi (Qo'shimcha rasm 3d). Shuning uchun HDAC3-ni o'chirish faqat qarigan miyada tajribaga bog'liq genlar to'plamining, shu jumladan Per1ning ifodasini tiklaydi.
HDAC3-ni o'chirish Per1 ifodasini uning promotori bilan birga histon asetilatsiyasini rag'batlantirish orqali tiklash yoki yo'qligini aniqlash uchun biz xromatin immunoprecipitatsiyasi (ChIP-qPCR) yordamida Per1 CRE promotor saytida keyingi giston 4, lizin 8 (H4K8Ac) asetilatsiyasini o'lchadik. H4K8Ac transkripsiya faollashuvining belgisidir32 va HDAC311,12 nishoni hisoblanadi. OLM treningi eski yovvoyi tipdagi miyadagi Per1 promouteridagi H4K8Ac darajasini o'zgartirmadi, ammo HDAC3 yo'qligi sababli Per1 promouteridagi H4K8Ac darajalari OLM ta'limiga javoban sezilarli darajada oshdi (3g-rasm). Arc va cFos uchun biz guruhlar bo'ylab H4K8Ac bandligi o'zgarmasligini ko'rdik (Qo'shimcha rasm 3e, f). Birgalikda, bu natijalar HDAC3-ni yo'q qilish Per1 promouterida atsetilatsiyani va o'rganishga javoban Per1 mRNK ifodasini oshiradi.
Muhim savoldan biri shundaki, Per1da kuzatilgan o'zgarishlar HDAC3flox/flox sichqonlarining sirkadiyalik ritmidagi o'zgarishlarga bog'liqmi? Agar dorsal hipokampusdagi HDAC3 ning yo'q qilinishi sirkadiyalik ritmiklikni o'zgartirsa, bu Per1 ifodasida ham, uzoq muddatli ham kuzatilgan o'zgarishlarni tushuntirishi mumkin.xotirashakllanishi. Buni istisno qilish uchun biz AAV-CaMKII-Cre infuziyasidan keyin yosh (3-oy) va qarigan (18-oy) HDAC3flox/flox sichqonlari va ularning HDAC3 plus/plus yalang'och hayvonlarining sirkadiyalik ritmikligini baholadik. 2 haftalik 12 soatlik yorug'lik / qorong'u tsiklga (LD) kiritilgandan so'ng, sichqonlar endogen sirkadiyalik ritmlarni o'lchash uchun doimiy qorong'ilikka (DD) joylashtirildi (Qo'shimcha rasm 4a). Biz har ikkala yosh guruhida HDAC3 plus/plus va HDAC3flox/flox sichqonlari o'rtasida sirkadiyalik faollik namunalarida hech qanday farqni kuzatmadik (Qo'shimcha rasm 4b-f), bu hipokampal HDAC3 ning sirkadiyalik ritmiklikka ta'siri yo'qligini ko'rsatadi. Shunday qilib, HDAC3 o'chirilishidan keyin Per1 ifodasi va uzoq muddatli xotira shakllanishida kuzatilgan o'zgarishlarni sirkadiyalik ritmiklikdagi o'zgarishlar bilan izohlab bo'lmaydi.
Per1 OLM treningi tomonidan induktsiya qilinadi va HDAC3 tomonidan tartibga solinadi.
Keyinchalik, biz hipokampal Per1 uzoq muddatga kerak yoki yo'qligini aniqlamoqchi edikxotirashakllanishi. Birinchidan, biz hipokampusga bog'liq o'rganish odatda Per1 mRNK ifodasini keltirib chiqaradimi yoki yo'qligini baholadik. Biz yosh (3-oy) yovvoyi turdagi sichqonlarni OLM yoki kontekstdan qo'rqish konditsionerini (CFC) sotib olgandan keyin 60 m o'tgach qurbon qildik12. Per1 mRNK ifodasi OLM (4a-rasm) yoki CFC (4b-rasm) bilan o'qitilgan hayvonlarda uy qafasi nazorati bilan solishtirganda sezilarli darajada ko'tarildi, bu Per1 mRNK ifodasi odatda bir nechta vazifalar uchun xotira konsolidatsiyasi paytida hipokampusda paydo bo'lishini ko'rsatadi.
Per1 ning ushbu tajriba natijasida paydo bo'lgan o'sishi HDAC3 orqali vositachilik qilishi mumkinligini aniqlash uchun biz yosh hipokampusdagi Per1 promouteri bilan birga turli saytlarda OLM mashg'ulotlaridan so'ng HDAC3 bandligini o'lchash uchun ChIP-qPCR dan foydalandik (4c-rasm, tepa). Biz Per1 promouterida HDAC3 bandligi OLM treningidan so'ng barcha uchta sinovdan o'tgan saytlarda kamayganini aniqladik (4c-rasm, pastki). HDAC3ni yo'q qilish Per1 va Per1 mRNK ifodalarida ikkala atsetilatsiyani tiklaydi (3-rasm), bu HDAC3 dorsal hipokampusdagi Per1 ifodasini tartibga solishini va HDAC3 ning disregulyatsiyasi tajribaga bog'liq bo'lgan yoshga bog'liq buzilishlarga yordam berishi mumkinligini aniq ko'rsatadi. Per1 ifodasi. Shuning uchun PER1 asosiy mexanizmning bir qismi bo'lishi mumkin, bu orqali HDAC3ni yo'q qilish uzoq muddatli hipokampalda yoshga bog'liq buzilishlarni yaxshilaydi.xotirashakllanishi.