2-qism ERCC1 mutatsiyalari DNKning shikastlanishini tiklashga to'sqinlik qiladi va bemorlarda jigar va buyrak disfunktsiyasini keltirib chiqaradi

Aloqa:ali.ma@wecistanche.com

1-qism uchun shu yerni bosing

2-qism

Buyrak kasalligi uchun Cistanche NZ-ga bosing

Munozara

Bi-allelning yangi holatiERCC1Mutatsiyalar bi-alelli faqat ikkita odamERCC1Bugungi kunga qadar mutatsiyalar haqida xabar berilgan, ularning ikkalasi ham CS-ga o'xshash xususiyatlarga ega edi. Eng og'ir ta'sirlangan shaxs (165TOR) ERCC1 ning (HhH)2 motifida bema'ni variant (Q158X) va F231L noto'g'ri variantiga ega edi (S5 F-rasm), o'sishda kechikish, rivojlanish etishmovchiligi va kontrakturalarni ko'rsatdi va keyin vafot etdi. pnevmoniya tufayli hayotning birinchi yili (Jaspers va boshq., 2007). Ikkinchi ta'sirlangan shaxs (CS20LO) kontrakturalar, mikrosefaliya va gipertoniyaga ega edi va F231L missense varianti uchun homozigot edi va hayotning ikkinchi yilida vafot etdi (Kashiyama va boshq., 2013).

Biz ikki aka-uka haqida xabar beramizERCC1mutations—a paternally inherited missense variant (p.R156W; c.466C>T) va onadan irsiy intragenik deletsiya tufayli nol-allel. Ushbu bemorlarning hujayralarida ifodalangan qolgan barcha ERCC1 oqsili R156W aminokislota o'rnini egallaydi, bu esa musbat zaryadlangan R156 qoldig'i va markaziy domendagi XPA-bog'lovchi cho'ntak ostida joylashgan qarama-qarshi manfiy zaryadlangan D129 qoldig'i o'rtasidagi tuz ko'prigini buzadi.ERCC1. Ushbu almashtirishning ta'siri ikki xil: (1) u ERCC1 va uning majburiy hamkori XPF ning umumiy barqarorligini keskin pasaytiradi va (2) XPA bilan o'zaro ta'sirga ayniqsa ta'sir qiladi (9-rasm).

Qisman noto'g'ri qatlam tufayli ERCC1 yadro oqsili darajasining pasayishi

Western blot va immunofluoressensiya tahlillari shuni ko'rsatdiki, umumiyERCC1and XPF protein levels are dramatically reduced to below 20% of WT levels in the fibroblasts from both siblings. This effect is also recapitulated by the bi-allelic KI of the missense mutation (p.R156W; c.466C>T) endogendaERCC1RPE1-hTERT hujayralari joylashuvi. Qizig'i shundaki, sichqonlarda ERCC1 ning to'liq yo'qolishi 4 hafta ichida o'limga olib keldi, WT sichqonlarida protein miqdorini taxminan 15 foizga oshirish hayot davomiyligini besh baravar oshirdi (Weeda va boshq., 1997), bu ERCC1 ning past darajalari ham bo'lishini ko'rsatadi. hayotiylik salohiyatini sezilarli darajada oshiradi. Bizning topilmalarimizga muvofiq, oldingi tadqiqotlar markaziy domenda noto'g'ri mutatsiyalar mavjudligini ko'rsatdiERCC1odatda beqarorlikka olib keladi (Sijbers va boshq., 1996b), bu mintaqa protein barqarorligi uchun muhim ekanligini ko'rsatadi.

To'liq uzunlikdagi yaqinda xabar qilingan kriogen elektron mikroskop tuzilishiERCC1-XPF heterodimeri (Jones va boshq., 2020) shuni ochib beradiERCC1R156qoldiq geterodimerning eng chekkasida joylashgan. Biz taxmin qilamizki, argininni triptofan bilan almashtirishning kattalashishi va elektron tuzilishining o'zgarishi nafaqat XPA-bog'lovchi cho'ntagini, balki ERCC1 markaziy domeni va XPF yadroviy domeni o'rtasidagi dimerizatsiya interfeysini ham bezovta qiladi va bu umumiy beqarorlikni keltirib chiqaradi (2-rasm). S5 F). Qizig'i shundaki, XPFR799W missense varianti XPF tomonidagi bir xil interfeysda joylashgan (S5 F-rasm) va shuningdek, beqarorlikka olib keladi va XPF oqsillari darajasining keskin pasayishiga olib keladi (Mori va boshq., 2018). CS-ga o'xshash va segmental progeroid xususiyatlariga ega bo'lgan ta'sirlangan bir odamda (CALIF1010) XPFR799W varianti boshqa XPF allelidagi intergenik delektsiya bilan birga meros bo'lib o'tdi, natijada kuchli NER nuqsoni va engil ICL tuzatish nuqsoni (Mori va boshqalar) al., 2018), ushbu tadqiqotda xabar qilingan birodarlar kabi.

ning induktiv versiyasining ektopik ifodasiERCC1R156W24 soat davomida ushbu mutant oqsilning WT darajasiga erishishga imkon berdi, bu esa sitoplazmada noto'g'ri joylashishga olib keldi, XPF bilan o'zaro ta'sirni kamaytirdi va MS tomonidan aniqlangan oqsillarni katlamali chaperonlar bilan o'zaro ta'sirini kuchaytirdi. Bu topilmalarning barchasi bu fikrni qo'llab-quvvatlaydiERCC1R156Wqisman noto'g'ri katlanmış va bemor hujayralarida parchalanadi, buning natijasida ERCC1 yadro oqsili darajasi -80 foizga kamayadi. RPE1-hTERT hujayralaridagi ERCC1R156W KI bu xulosani tasdiqlaydi.

ni solishtirgandaERCC1va PV46LD va PV50LD hujayralaridagi XPF oqsillari darajasi, og'irroq ta'sirlangan odamlarning hujayralaridagi (165TOR va CS20LO) bilan, biz ushbu tadqiqotda tasvirlangan birodarlar hujayralarida bu darajalar solishtirish mumkin yoki ehtimol undan ham pastroq ekanligini ta'kidladik (3-rasm). C va S3, E va F-rasm; Jaspers va boshqalar, 2007; Kashiyama va boshqalar, 2013). E'tibor bering, CS20LO ERCC1F231L uchun homozigot, 165TOR esa heterozigot va boshqa tomondan qo'shimcha erta to'xtash xususiyatiga ega.ERCC1allel (Q158X). Ushbu topilmalar shuni ko'rsatadiki, oqsil darajasining pasayishiga qo'shimcha ravishda, hali ham ifodalangan mutant oqsilining funksionalligi va ikkita mutatsiyaga uchragan allellarning kombinatsiyasi fenotipik zo'ravonlik va ekspressivlikning potentsial modulyatori sifatida hisobga olinishi kerak.

ERCC1R156W: ERCC{2}}bog'liq DNKni tiklash yo'llariga differentsial ta'sir

ERCC1R156W-GFP ning ERCC1-KO hujayralarida ERCC1WTga o'xshash darajada ifodalanishi bizga aminokislotalarni almashtirishning oqsil barqarorligiga ta'sirini oqsil funksionalligiga ta'siridan ajratish imkonini berdi. Mutant ERCC1R156W oqsili XPA va baliqlar bilan ultrabinafsha nurlar ta'sirida o'zaro ta'sirida jiddiy buzilgan bo'lsa-da va UV-induktsiyali DNK lezyonlari joylariga samarali joylasha olmagan bo'lsa-da, biz hali ham UDS tahlillarida sezilarli (~ 40 foiz) ta'mirlash faolligini aniqladik, klonogen omon qolish, va in vitro NER tahlillari. Ushbu topilmalar NER kompleksi bilan juda zaif o'zaro ta'sir qiluvchi mutant ERCC1 oqsili hali ham hujayralar ichidagi NER (~40 foiz) faolligini sezilarli darajada qo'llab-quvvatlashi mumkinligini ko'rsatadi. Birgalikda, bu topilmalar shuni ko'rsatadiki, ERCC1 ning past ifoda darajasi (~ 20 foiz) hali ham ifodalangan mutant oqsillarning qoldiq GGR faolligi bilan birgalikda PV46LD va PV50LD ning to'liq rivojlangan XP rivojlanishining oldini olish uchun etarli darajada himoya qiladi. Haqiqatan ham, qoldiq GGR faolligi og'ir ta'sirlangan va saratonga moyil XP-A bemorining fibroblastlari bilan solishtirganda, UDS tahlillarida sezgirroq sharoitlarda hali ham aniqlangan. Shunga qaramay, ikkala bemor ham teri saratoni rivojlanish xavfi ostida bo'lishi mumkin va shuning uchun quyosh nurlaridan himoyalanish tavsiya etiladi. PV46LD va PV50LD hujayralaridagi qoldiq faollik 165TOR yoki CS20LO hujayralarida biz aniqlagan ta'mirlash faolligiga o'xshash yoki undan past edi (6-rasm J; Jaspers va boshq., 2007; Kashiyama va boshq., 2013). Shuning uchun klinik zo'ravonlik NER faolligi bilan bog'liq emas, balki rivojlanish jarayonida muhim bo'lgan ERCC1 ning NERdan tashqaridagi roli bilan bog'liq.

Bizning topilmalarimiz ERCC1R156W SLX4 bilan oʻzaro taʼsirini kamaytirgani va mahalliy ICL induksiyasi joylariga kamroq samarali jalb qilinganiga qaramay, keyingi tahlillar shuni koʻrsatdiki, ERCC1R156W mutant oqsili ERCCda ektopik tarzda ifodalanganida ICL taʼmirini qoʻllab-quvvatlashga ozgina taʼsir qilgan{{5} KO hujayralari. Biroq, ICL ta'miriga ta'siri R156W almashtirishning NERga ta'siridan ancha engilroq edi, bu ICLlarni ta'mirlash NERga xos DNK lezyonlarini tuzatishga qaraganda ancha kam ERCC1 proteinini talab qiladigan oldingi topilmalar bilan birlashtirildi (Jaspers va boshq. , 2007; Sijbers va boshq., 1996b), ICL ta'mirlashga engil ta'sirni juda yaxshi tushuntirishi mumkin. ERCC1 darajasi keskin pasaygan bemor fibroblastlarida biz o'rtacha sezuvchanlikni, shuningdek, parallel ravishda kiritilgan FA bemorining hujayralariga qaraganda ancha yumshoqroq bo'lsa-da, ICL qo'zg'atuvchi birikma MMC ta'sirida xromosoma sinishi kuchayganini aniqladik. Muhimi shundaki, na PV46LD, na PV50LD FAga o'xshash klinik belgilarning aniq belgilarini ko'rsatmadi, bu ERCC1R156W mutant oqsili bu bemorlarda past endogen ICL yukiga qarshi etarli darajada himoya qilishni ta'minlaydi.

ERCC1 etishmovchiligi jigar va buyraklarning buzilishiga olib keladi

ERCC1 yoki XPF uchun KO bo'lgan sichqonlar qattiq yugurish (ya'ni, WT sichqonlariga qaraganda kichikroq va kuchsizroq) va og'ir jigar etishmovchiligi tufayli hayotning birinchi 4 haftasidan oldin o'lishadi (McWhir va boshq., 1993; Sijbers va boshq., 1996b; Tian va boshqalar, 2004; Weeda va boshqalar, 1997). Ushbu sichqonlarda ERCC1 ning jigarga xos ifodasi kichikroq hajmni qisman tuzatdi va umr ko'rish muddatini 12 haftagacha uzaytirdi, lekin ayni paytda jiddiy niqobni ochdi.buyrak funktsiyasining buzilishiva buyrak etishmovchiligi o'limning ikkinchi darajali sababi sifatida (Selfridge va boshq., 2001). XP yoki FA uchun xos bo'lgan KO sichqonlari jigar kasalligini ko'rsatmaydi, bu fenotip NER yoki ICL ta'mirlash nuqsoni tufayli kelib chiqmaganligini ko'rsatadi. Ikkala yo'lda ham etishmayotgan ERCC{1}}KO sichqonlarida yo'qolgan bu ikki yo'l orasidagi qisman ortiqchalik bu fenotipni tushuntirishi mumkin. Ushbu fikrga muvofiq, gepatotsit vabuyrak-proksimal tubula hujayralariERCC1-KO sichqonlarida poliploidga aylandi va p53 ning yuqori miqdorini to'pladi (McWhir va boshq., 1993; Selfridge va boshq., 2001; Weeda va boshq., 1997), bu organlarda endogen DNK shikastlanishining to'planishini ko'rsatadi. yuzaga kelishi mumkin. Biroq, bu endogen DNK lezyonining aniq tabiati noaniqligicha qolmoqda.

Qizig'i shundaki, NER va ICL ta'mirini birgalikda inaktivatsiya qilgan sichqonlar jigar disfunktsiyasini ko'rsatmaydi, bu DNKni tiklash yo'llari orasidagi ortiqchalik yagona tushuntirish emasligini va ERCC{0}}XPF ning DNKni tiklash yo'llaridan tashqaridagi qo'shimcha funktsiyasi hissa qo'shishini ko'rsatadi. jigar etishmovchiligi (Mulderrig va Garaycoechea, 2020). ERCC{2}}XPF endogen DNK shikastlanishi bilan shug'ullanadigan qo'shimcha DNK ta'mirlash yo'llarida ishtirok etishi mumkin. Masalan, ERCC{3}}XPF yaqinda Z-DNK kabi muqobil DNK tuzilmalariga ta'sir qilishi ko'rsatildi, bunda u NER yoki ICL ta'mirlash omillari bilan emas, balki mos kelmaydigan tuzatuvchi oqsillar bilan hamkorlik qiladi (McKinney va boshq., 2020). Bundan tashqari, ERCC{6}}XPF RECQ1 spiral bilan birga asosiy eksizyonni ta'mirlashning pastki yo'lida ishtirok etishi ko'rsatilgan (Woodrick va boshq., 2017).

Ushbu tadqiqotda ikki aka-uka (PV46LD va PV50LD) rivojlanishda muvaffaqiyatsizlik, qisqa bo'y va teri osti yog 'etishmasligini ko'rsatdi, bu ERCC1-KO sichqonlarida kuzatilgan kichik hajmni eslatadi (McWhir va boshq., 1993; Selfridge va boshqalar, 2001; Weeda va boshqalar, 1997). Bundan tashqari, aka-uka va opa-singillar asosan xolestatik rasm bilan jigar buzilishlarini rivojlantirdilar, bu esa 9 yoshdan oldin ortotopik jigar transplantatsiyasiga olib keldi. Ushbu aralashuv erta o'limni aniq oldini oldi, ammo rivojlanishning muvaffaqiyatsizligini yaxshilamadi, bu transplantatsiyadan keyingi vazn, bo'y va bosh atrofi uchinchi tsentildan ancha past o'sishidan ma'lum bo'ldi.

Qizig'i shundaki, xolestatik jigar kasalligi Misrlik CS bilan og'rigan bemorlarda keng tarqalgan xususiyat sifatida qayd etilgan, bu boshqa etnik kelib chiqishi bo'lgan CS bilan kasallangan bemorlarda bu ilgari tan olinganidan ko'ra keng tarqalgan xususiyat yoki yo'qligini aniqlash uchun buni diqqat bilan kuzatib borish kerakligini ko'rsatadi (Abdel Ghaffar va boshq. , 2011). XP bilan og'rigan bemorlarda jigar anomaliyalari tasvirlanmagan bo'lsa-da, FA bemorlarida jigar sitolizi (hujayra parchalanishi yoki yorilishi) holatlari mavjud (Masserot-Lureau va boshq., 2012), bu ERCCda kuzatilgan jigar anormalliklaridan farq qilishi mumkin. 1- kam aka-uka. Katta birodarning jigar biopsiyasining gistologik tekshiruvi (PV50LD) gepatotsitlar morfologiyasida yadro kengayishi va o'zgaruvchanligi bilan o'zgarishlarni aniqladi, bu ERCC1-kam sichqonlarda qayd etilgan (rasm S1 D; N´uñez va boshq., 2000). ).

ERCC1 ning jigarga xos ifodasi bo'lgan ERCC1-KO sichqonlarida o'limning ikkinchi sababi og'ir edi.buyrak etishmovchiligi(Selfridge va boshqalar, 2001). Ikkala aka-uka ham buyrak disfunktsiyasini ko'rsatadi, bu esa proksimal tubulyar disfunktsiyani ko'rsatadigan progressivlikka olib keladi.buyrakbuzilish. Biroq, jigar transplantatsiyasidan keyin quvur funktsiyasi barqarorlashdi, ammobuyrakfunktsiyasidoimiy monitoringni talab qiladi. ERCC{0}} KO sichqonlarining buyrak fenotipi - tubulopatiyaga mos keladigan oqqan oqsilli moddasi bo'lgan kengaygan kanalchalari bilan (McWhir va boshq., 1993; Selfridge va boshq., 2001; Weeda va boshq., 1997) - xuddi shunday. tadqiqotimizda tasvirlangan bemorlarga. Bundan tashqari, birgalikda XP/CS (Ben Chehida va boshq., 2017; Kondo va boshq., 2016; Kralund va boshq., 2013), shuningdek, CS (Funaki va boshq. ., 2006; Reiss va boshq., 1996; Sato va boshq., 1988), shu bilan birga, FA va strukturaviy anomaliyalar o'rtasidagi bog'liqlik.buyrakhas also been reported (Sathyanarayana et al., 2018). The phenotype in these siblings is distinct from prior reports of individuals with biallelic ERCC1 mutations and also distinct from the known phenotypic entities, CS and XP. Neither individual had features suggestive of FA. There may be parallels between the phenotype of these siblings and a previously reported individual with biallelic ERCC1 mutations (XP2020DC; p.K266X; IVS6-26G>A) 37 yoshida vafot etgan (Gregg va boshq., 2011; Imoto, K., va boshq. 2007. ERCC1 yoki XPF nukleotidlarining o'zaro ta'sirini tiklash oqsillarida nuqsonlari bo'lgan bemorlarda kech boshlangan og'ir nevrologik degeneratsiya bilan kseroderma pigmentosum namoyon bo'ladi. [Referat] J. Invest.Dermatol.127:S92). Jigarning buzilishi haqida xabar berilmagan bo'lsa-da, bu bemorda 15 yoshida miyaning og'ir atrofiyasi rivojlanib, demans bilan progressiv neyrodegeneratsiyaga aylandi. 13 va 11 yoshdagi ikkala aka-ukada ham engil miya atrofiyasi qayd etilgan, bu ikkala aka-ukaning nevrologik rivojlanishini diqqat bilan kuzatib borish kerakligini ko'rsatadi.

A previously reported 15-yr-old boy with bi-allelic XPF mutations (XP51RO; p.R153P; c.458G>C; Jaspers va boshqalar, 2007; Niedernhofer va boshq., 2006) teri saratonisiz fotosensitivlik, past bo'yli, teri osti yog'ining etishmasligi, rivojlanish kechikishi va buyrak etishmovchiligi, shu jumladan, bu erda xabar qilingan birodarlar bilan bir-biriga mos keladigan fenotipni taqdim etdi (Niedernhofer va boshq., 2006). Bu yerda qayd etilgan aka-uka va opa-singillardan farqli o'laroq, bu bolada aniq segmental progeroid xususiyatlar namoyon bo'ldi, ammo xolestazsiz jigar rasmi ancha yumshoqroq. Bu yerda xabar qilingan birodarlar, bi-allelik ERCC1 mutatsiyalari fenotiplar spektrini keltirib chiqarishi mumkinligini ko'rsatadi, odatda CSda ko'rinadiganidan tortib, engilroq bo'y, fotosensitivlik va og'ir jigarni o'z ichiga olgan fenotipgacha.buyrakbuzilish, potentsial NERga kuchli ta'sir ko'rsatishi va ICL ta'miriga bir vaqtning o'zida ta'siri tufayli, ayniqsa, bu organlarga ta'sir qilishi mumkin.

Materiallar va uslublar

Ushbu tadqiqotda amalga oshirilgan barcha protseduralar axloqiy me'yorlarga mos keladi va Qirollik bolalar kasalxonasi, Melburn, Viktoriya, Avstraliya (HREC36291C) va Buyuk Britaniyaning Shimoliy-Sharqiy Nyukasl va Shimoliy Taynsayddagi Milliy tadqiqot etika xizmati qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan. 2. Bemorlar "etim" deb taxmin qilingan Mendel kasalliklari bo'lgan pediatrik bemorlar uchun tashxis qo'yilmagan kasalliklar dasturlariga jalb qilindi. Bemorlardan va ularning oila a'zolaridan so'lak yoki qon namunalari yozma xabardor qilingan rozilik berilgandan so'ng genomik DNK ekstraktsiyasi uchun to'plangan. Ota-onalar 1 A-rasmda jabrlangan aka-ukalarning tasvirlanmagan fotosuratlarini ko'rsatishga ruxsat berishgan.

Next-generation sequencing (NGS) DNA extracted from the blood of both affected siblings and unaffected parents was subjected to exome capture and sequencing through Oxford Gene Technologies Ltd. Genomic data were analyzed using a custom-made in-house pipeline using an autosomal recessive disease model. A paternally inherited missense variant in NM_202001.2 (ERCC1), g.45922415G>A, c.466C>T ERCC1 genining 8 ta ekzonining 4-eksonida ikkala ta'sirlangan shaxslarda aniqlangan. Ikkala ta'sirlangan shaxsda ekzoma ma'lumotlarini dastlabki so'roq qilishda, bu variant gomozigotli holatda bo'lib ko'rindi, lekin otada geterozigota holatda bo'lgan va onada yo'q, bu ona allelida mumkin bo'lgan o'chirishni ko'rsatadi. Missense varianti gnomAD maʼlumotlar bazasida 0.01 foiz (22 heterozigot, homozigotlar yoʻq) chastotada mavjud va bundan oldin zararlangan shaxslarda qayd etilmagan. Missense varianti LOVD ma'lumotlar bazasiga (http://www.LOVD.nl/ERCC1_000020 va http://www.LOVD.nl/ERCC1_000021) va ClinVar ma'lumotlar bazasiga ( Variatsiya identifikatori: 978472).

qPCR yordamida o'chirishni aniqlash

Deletsiyani aniqlash uchun limfotsitlar/epitelial hujayralardan genomik DNK ajratildi va ERCC1 genining tegishli hududi qPCRda kuchaytirildi. qPCR Universal ProbeLibrary Assay Design Center (Roche) yordamida ishlab chiqilgan va Sigma-Aldrich tomonidan sintez qilingan zondlar va maxsus primerlar (S1-jadvalda keltirilgan) yordamida amalga oshirildi. Primerlar o'chirilgan hududni 4-eksonda va gen ichidagi nazoratda (ekson-5) o'chirilmagan hududni kiritish uchun mo'ljallangan. LightCycler R 480 Probes Master reaksiya aralashmasi (Roche) yordamida multipleks qPCR ichki standart sifatida CFTR geni (ekson 27) yordamida ERCC1 gen hududini kuchaytirish va miqdorini aniqlash uchun ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq amalga oshirildi (jadval). S1). qPCR LightCycler R 480 asbobida (Roche) amalga oshirildi va ma'lumotlar tahlili LightCycler R 480 dasturiy ta'minot versiyasi 1.5.0 (Roche) yordamida amalga oshirildi. Ketma-ketlik o'zgarishini talqin qilish uchun Amerika Tibbiyot Genetika kolleji ko'rsatmalariga amal qilindi.

Sanger sekvensiyasi orqali noto'g'ri ma'no variantini aniqlash

Genomik DNK hujayra pelletlarini butun hujayrali lizat buferida qayta suspenziya qilish orqali ajratilgan (50 mM KCL, 10 mM Tris, pH 8.0, 25 mM MgCl2, {{12} },1 mg/ml jelatin, 0,45 foiz Tween-20 va 0,45 foiz NP-40) tarkibida 0,1 mg/ml Proteinaz K (EO0491; ThermoFisher Scientific) va 1 inkubatsiya h 56 gradusda, so'ngra 10-daqiqada Proteinaz K ning 96 daraja issiqlik inaktivatsiyasi. Noto'g'ri mutatsiyalarni qamrab oluvchi ~1 kb fragmentlar PCR bilan kuchaytirildi (tartiblash primerlari S1-jadvalda keltirilgan), so'ngra to'g'ridan-to'g'ri yoki teskari primer yordamida Sanger sekvensiyasi amalga oshirildi.

Hujayra chiziqlari

Fibroblast hujayralari liniyalari ta'sirlangan shaxslar va ota-onalarning teri biopsiyalari asosida yaratilgan. Barcha hujayra liniyalari (S2 jadvalida keltirilgan) penitsillin/streptomitsin (Sigma-Aldrich) va 10 foiz FBS (Bodinco BV) bilan to'ldirilgan 5 foiz CO2 indiy (Thermo Fisher Scientific) atmosferasida 37 darajada o'stirildi. Barcha hujayra liniyalari muntazam ravishda mikoplazma infektsiyasi uchun sinovdan o'tkazildi.

Fibroblastlarni hTERT bilan abadiylashtirish

WT (48BR) va PV50LD fibroblastlari Amaxa Nucleofector (dastur U23) yordamida p Babe-Neo-TERT (Addgene Plasmid # 1774) nukleofektsiyasi orqali abadiylashtirildi. Har bir elektroporatsiyada 400,{8}} fibroblast va 2,5 mkg plazmid DNK mavjud edi. Elektroporatsiyadan so'ng hujayralar 5 ml DMEM va 10% FBS bo'lgan 25-sm2 to'qima madaniyati kolbalariga ekilgan. 2 kundan keyin madaniyat muhiti 20 mkg/ml neomitsinni o'z ichiga olgan muhit bilan almashtirildi.

/ streptomitsin (Sigma-Aldrich) va 10 foiz FBS (Bodinco BV). Barcha hujayra liniyalari muntazam ravishda mikoplazma infektsiyasi uchun sinovdan o'tkazildi.

Plazmid tuzilmalari

All plasmids used in this study are listed in Table S3. The GFP gene in pERCC1-GFP-N1 (Houtsmuller et al., 1999) was replaced with m Venus (a gift of Joachim Goedhart, Amsterdam, Netherlands) using AgeI and BsrGI. The GFP-NLS gene (Luijsterburg et al., 2017) was inserted into pcDNA5-FRT-TO-Puro. The ERCC1-m Venus cassette was amplified by PCR (see Table S1 for primers) and inserted as a NheI and BspEI fragment into plenty-CW57-TO-GFP digested with NheI and AgeI to generate plenty-CW57-TO-ERCC1WT-mVenus. Overlap PCR was used to introduce the c.466C>ERCC1 da T mutatsiyalari. Bir-biriga o'xshash PCR mahsuloti ko'p CW57-TO-ERCC1R156W-mVenus hosil qilish uchun NheI va AgeI fragmenti sifatida kiritildi. ERCC1WT va ERCC1R156W NheI va AgeI fragmentlari sifatida pcDNA ga5-FRT-TO Puro-EGFP-N1ga kiritildi5-FRT-TO-Puro-ERCC1WT-EGFPand pcDNA5-FRT- -Puro-ERCC1R156W-EGFP. Saytga yo'naltirilgan mutagenez pMacro Bac-XPF-ERCC1WT ga nuqta mutatsiyalarini kiritish uchun S1-jadvalda keltirilgan primerlardan foydalangan holda ishlab chiqaruvchining protokolida tavsiflangan KOD-plus mutagenez to'plami (Toyobo) yordamida ishlatilgan. Barcha ketma-ketliklar Sanger ketma-ketligi bilan tasdiqlangan.

KO hujayrasini yaratish

Yagona KO, U2OS(FRT) va RPE{1}}hTERT (PuroR/TP53-dKO) hujayralarini ishlab chiqarish uchun liniyalar Leyden universiteti tibbiyot markazi/Sigma dan yo'naltiruvchi RNKni kodlovchi pLV-U6g-PPB bilan kotransfektsiya qilindi. -Lipofect0ine yordamida Cas9-2A-GFP (pX458; Addgene #48138) kodlovchi ekspresyon vektori bilan birga ERCC1 genini nishonga olgan Aldrichning yagona yo‘naltiruvchi RNK (sgRNK) kutubxonasi (plazmidlar uchun S3-jadvalga va sgRNK ketma-ketligi uchun S4-jadvalga qarang). (Invitrogen). Transfektsiyalangan U2OS (FRT) hujayralari 3 kun davomida puromitsinda (1 mkg/ml) tanlab olindi va past zichlikda qoplandi, shundan so'ng alohida klonlar ajratildi. Transfektsiyalangan RPE{19}}hTERThujayralari FACS BFP/GFP bo‘yicha saralangan va past zichlikda qoplangan, shundan so‘ng alohida klonlar ajratilgan. KO klonlari Western blot tahlili bilan tasdiqlangan. Cas9 integratsiyasi/barqaror ifodasining yo'qligi Western blot tomonidan tasdiqlangan.

Barqaror hujayra liniyalarini yaratish

U2OS(FRT) fonida bitta ERCC1 KO kloni (S2-jadvalga qarang) ERCC1WT-GFP, ERCC1R156W-GFP yoki GFP-NLS ni bularni kodlovchi pcDNA5-FRT-TO-Puroplazmidning kotransfeksiyasi orqali barqaror ifodalash uchun ishlatilgan. cDNKlar (2 mkg), Flp rekombinazani (0,5 mkg) kodlovchi pOG44plazmid bilan birga. 1 µg/ml puromisin va 4 µg/ml blastitsidin S ni tanlagandan so‘ng poliklonal hujayra populyatsiyasi olindi. GFP-belgilangan ERCC1 oqsillari yoki GFP-NLS ifodasi 24 soat davomida 2 µg/ml doksisiklin qo‘shilishi bilan yuzaga keldi.

KI hujayra chiziqlarini yaratish

Homozigotli KI'larni yaratish uchun RPE{0}}hTERT xujayralari xatoga moyil bo'lgan DSB ta'mirini bostirish va homologiyaga bog'liq remontdan foydalanishni oshirish uchun dastlab 30 daqiqa davomida 1 mM DNK-PK inhibitori (NU7441) bilan ishlov berildi. Keyinchalik, 350,{8}} hujayralar 20 mkl nukleofektor buferida (V4XP-3032; Lonza) ERCC1 genini nishonga olgan 4,5 mkg plazmid va ERCC1 genini nishonga olgan sgRNK ishtirokida qayta suspenziya qilindi. S4 forsgRNA ketma-ketliklari) va bemor mutatsiyasini o'z ichiga olgan 100 mkM bir zanjirli donor DNKsi, shuningdek Cas9 tomonidan qayta kesishning oldini olish uchun PAM joyini yo'q qilish uchun jim mutatsiyalar va KI klonlarini skriningni osonlashtirish uchun HindIII cheklash joyini kiritish uchun jim mutatsiyalar. Hujayralar EA{24}} dasturi yordamida anAmaxa 4D-X Nucleofector Unit (Lonza) yordamida elektroporatsiya qilindi. Elektroporatsiyadan so'ng hujayralar 10 foiz FBS bilan McCoy muhitida past zichlikda qoplangan. Ertasi kuni vosita DMEM (10 foiz FBS va 1 foiz penitsillin/streptomitsin) bilan almashtirildi va hujayralarga koloniyalarni shakllantirishga ruxsat berildi. Taxminan 400 ta koloniya ajratildi va kengaytirildi. Genomik DNK ajratildi va kiritilgan mutatsiyani va kiritilgan cheklash joyini (HindIII) o'z ichiga olgan fragment ichki PCR orqali kuchaytirildi (primerlar uchun S1-jadvalga qarang). PCR fragmentlari HindIII (NEB) bilan 3 soat davomida 37 darajada hazm qilindi va keyin gel elektroforezi bilan ajratildi. HindIII cheklash joyiga kiritilgan klonlar Sanger ketma-ketligi bilan tahlil qilindi (primerlar uchun S1-jadvalga qarang). Biz 400 ta izolyatsiya qilingan klonlar orasidan ikkita homozigotli KI klonlarini oldik, bu KI samaradorligi ~0,5 foizga to'g'ri keladi.

Lentiviral transduktsiya

lentivirus transduktsiyasi uchun mVenus-ERCC1WT yoki mVenus ERCC1R156W lentiviral vektor pLenti-CW57-TO ga kiritildi. HEK293T virusni ishlab chiqarish uchun JetPEI (Sigma Aldrich) yordamida VSV-G, RRE va REV ERCC1 sintezlarini kodlovchi vektorlar bilan transfektsiya qilindi. Virus o'z ichiga olgan supernatant 24 soatdan keyin to'plangan va 0.44-mkm filtr bilan filtrlangan. Birlamchi fibroblastlar PV46LD va PV50LD polibrene (Sigma-Aldrich) ishtirokida lentiviral tarzda o'tkazildi. Hujayralar 15 mkg/ml puromisin bilan tanlangan. mVenus-belgilangan ERCC1 oqsillarining ekspressiyasi 24 soat davomida 2 mkg/ml doksisiklin qo'shilishi bilan yuzaga keldi.

Klonogen omon qolish tahlillari

Cells were trypsinized, seeded at low density, and allowed to attach. The next day, cells were either mock-treated or exposed to an increasing dose of UV light (1, 2, 3, and 4 J/m2 of UV-C 266nm), an increasing dose of IR (2, 4, 6, and 8 Gy), or increasing concentrations of MMC (2, 4, 6, and 8 ng/ml). After 7–9 d, the cells were washed with 0.9% NaCl and stained with methylene blue. Colonies of >20 ta hujayralar baholandi. Omon qolish tajribalari ikki nusxada amalga oshirildi va kamida ikki marta takrorlandi.

Co-IP uchun immunopresipitatsiya

Hujayralar soxtalashtirilgan yoki UV-C nurlangan (20 J/m2) va 1 soatdan keyin yig'ib olingan. Hujayra granulalari EBC{6}} tamponida (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 foiz NP-40, 2 mM MgCl2 va proteaz inhibitori) muz ustida 2{26}} daqiqa davomida lizing qilindi. kokteyl [Roche]) 500 U/ml benzonaz nukleaza (Novagen) bilan to'ldirilgan. Hujayra lizatlari GFP-Trap A boncuklari (Chromotek) bilan 4 daraja 1,5 soat davomida inkubatsiya qilindi. Keyin boncuklar olti marta EBC{21}} buferi (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 foiz NP-40, 1 mM EDTA va proteaz inhibitori kokteyli) bilan yuvildi va Laemmli-SDSda qaynatiladi. namuna buferi.

G'arbiy dog'

Hujayralar aylantirildi, PBS bilan yuvildi va Laemmli buferida (40 mM Tris, pH 6,8, 3,35% SDS, 16,5% glitserin, 0,0005% Bromofenol Blue va 0,05) 1{8}} daqiqa qaynatiladi. M ditiotreitol). Proteinlar NuPAGE MOPSrunning buferida (NP0001-02; Thermo Fisher Scientific) Criterion XT Bis-Tris jellarida (#3450124; Bio-Rad) 4 foizdan 12 foizgacha bo'lgan proteinlarda ajratilgan va poliviniliden ftorid membranalarida (IPFL00 Millipore; IPFL00) bo'yalgan. ). Membrana xona haroratida 1 soat davomida blokirovka qiluvchi bufer (MB-070-003; Rok yer) bilan bloklangan. Keyin membrana ko'rsatilgandek antikorlar bilan tekshirildi (S5-jadvalda keltirilgan). Aniqlash uchun Odyssey CLx tizimi (LI-COR Biosciences) ishlatilgan.

RNKni tiklash tahlili (RRS)

30,000 hujayralar 12-mm shisha qoplamalarga 24-quduq plastinkalarida DMEMda 1 foizli FBS bilan ekilgan. 24 soatdan keyin hujayralar 6 J/m2 dozada UV-C bilan nurlantirildi va turli vaqt oralig'ida ({{20}} soat, 3 soat va 18 soat) konditsioner muhitda inkubatsiya qilindi. Inkubatsiyadan so'ng, yangi paydo bo'lgan transkriptlar hujayralarni 400 mkM 5-etinil-uridin (CLK-N002-10; Jena Bioscience) bilan inkubatsiya qilish orqali etiketlandi, bu keyinchalik 50 dan iborat Click-iT aralashmasi bilan vizualizatsiya qilindi. mM Tris buferi, pH 8,0, 60 mkM Attoazid (647N-101; ATTO-TEC), 4 mM CuSO4•5H2O, 10 mM L-askorbin kislotasi (A0278; Sigma-Aldrich) va 0,1 µgPI/ml (D1306; Thermo Fisher Scientific) 1 soat davomida. Hujayralar PBS bilan 5 daqiqa davomida uch marta yuvildi va Aqua Polymount (Brunschwig) yordamida mikroskop slaydlariga (Thermo Fisher Scientific) o'rnatildi.

Immunofluoresans

Immunofluoresan bo'yash uchun 25 0, 000 hujayralar 18- mm shisha qoplamalarga ekilgan. Ertasi kuni hujayralar 4% paraformaldegid bilan fiksatsiya qilindi, soʻngra 1{21}} daqiqa davomida {{1{12}}}},5 foiz Triton X-100 bilan oʻtkazuvchanlik amalga oshirildi. Hujayralar reaksiyaga kirishmagan aldegid guruhlarini blokirovka qilish uchun 10 daqiqa davomida PBSda 100 glitsin bilan ishlov berildi, PBS bilan yuvildi va yuvish tamponida (PBS 0,5% BSA va 0,05% Tween-20; Sigma-Aldrich) 10 daqiqa davomida muvozanatlashtirildi. Antikor qadamlari va yuvishlar yuvish tamponida edi. Birlamchi antikorlar xona haroratida 2 soat davomida inkubatsiya qilindi, keyin ikkilamchi antikorlar 1 soat va DAPI 5 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Birlamchi va ikkilamchi antikorlar S5-jadvalda keltirilgan. Hujayralar 0,1 µg/ml DAPI bilan inkubatsiya qilindi va Aqua Polymount yordamida o‘rnatildi.

H2AX bo'yash

200,{1}} hujayralar DMEM (10 foiz FBS va 1 foiz P/S) bilan 24-quduq plastinkalarida 18-mm shisha qoplamalarga ekilgan. Ertasi kuni hujayralar YXlon xalqaro rentgen generatori (200 KV, 4 mA; doza tezligi 2 Gy/min) tomonidan IQ ta'siriga uchradi. Belgilangan vaqt nuqtalarida hujayralar PBSda 3 foizli paraformaldegid bilan 10 daqiqa davomida mahkamlangan va H2AX uchun 1 soat davomida bo'yalgan (yuqoriga qarang). Tasvirlar ImageJ-da maxsus yaratilgan makros yordamida aniqlandi, bu yuqorida tavsiflanganidek, har bir hujayradagi fokuslar sonini avtomatik va ob'ektiv tahlil qilish imkonini berdi (Typas va boshq., 2015).

Ruxsat etilgan hujayralarni mikroskopik tahlil qilish

Ruxsat etilgan namunalar tasvirlari 63 × PLAN APO (1,4 raqamli diafragma [NA]) moyga botirish maqsadlari (Zeiss) va qo'zg'alish uchun ishlatiladigan HXP 120 metall-galoid chiroq bilan jihozlangan Zeiss AxioImagerM2 yoki D2 keng maydonli floresan mikroskopida olingan. Floresan zondlar DAPI uchun quyidagi filtrlar yordamida aniqlandi (qo'zg'atuvchi filtr: 350/50 nm; dikroik oyna: 400 nm; emissiya filtri: 460/50 nm), Alexa 555 (qo'zg'atuvchi filtr: 545/25 nm; dikroik oyna: 5 nm) ; emissiya filtri: 605/70 nm) yoki Alexa 647 (qo'zg'alish filtri: 640/30 nm; dikroik oyna: 660 nm; emissiya filtri: 690/50 nm). Tasvirlar ZEN 2012 dasturi yordamida yozib olingan va ImageJ da tahlil qilingan.

UV lazerli mikro nurlanish

Hujayralar 18-mm kvarts (UV-C) yoki shisha (UV-A) qoplamalarida o'stirildi va Chamlide CMB magnit kamerasiga joylashtirildi, unda o'sish muhiti CO2-mustaqil Leibovitz L{ bilan almashtirildi. {4}} oʻrtacha (Thermo Fisher Scientific). UV-C lazer izlari diod bilan pompalanadigan qattiq holatdagi 266- mm itriy alyuminiy granatli lazer (o'rtacha quvvat 5 mVt, takrorlash tezligi 10 kHz gacha va puls uzunligi 1 ns) yordamida amalga oshirildi. UV-Amikro-nurlanishdan oldin hujayralar ICL hosil qilish uchun 6 mkM trioksalen bilan 1 soat davomida yoki DSB hosil qilish uchun 24 soat davomida 15 mkM BrdU bilan sensibilizatsiya qilingan. UV-A lazer izlari diodli qattiq holatdagi 355-nm Yttrium alyuminiy granat lazeri (o'rtacha quvvati 14 mVt va takrorlash tezligi 200 Gts gacha) tomonidan yaratilgan. Ikkala lazer ham UGA-42-Caliburn/2L Spot Yoritish tizimiga (Rapp OptoElectronic) birlashtirilgan.

Mikro-nurlanish 100 × (1,2NA) ultrafiltrli glitserin-immersion ob'ektiv (UV-C) yordamida to'liq kvartsli keng maydonli floresan Zeiss Axio Observer 7 mikroskopida 37 darajaga o'rnatilgan atrof-muhit kamerasida jonli hujayra tasviri bilan birlashtirildi. ) yoki Plan-Neofluar 63× (1,25 NA) moyga botirish maqsadi (UV-A). Lazer tizimi mikroskopga TriggerBox orqali ulanadi va neytral zichlik (ND-1) filtri lazer nurining 90 foizini bloklaydi. Qo'zg'atish uchun AnHXP 120-V metall-galoid chiroq ishlatilgan. Tasvirlar Zeiss ZEN-da olingan va ImageJ-da miqdori aniqlangan.

Xromosoma sinishi tahlili

2 × 1{{20}}6 fibroblastlar DMEM (10% FBS) bilan 175-sm2 toʻqima madaniyati kolbalariga ekilgan va 50 nM MMC bor yoki yoʻqligida 37 darajada ekilgan. 48 soatdan keyin har bir kulturaga 600 mkl demekolsin (10 mkg/ml) qo‘shildi va hujayralar metafazalarni boyitish uchun qo‘shimcha 30 daqiqa 37 daraja haroratda inkubatsiya qilindi. Keyin hujayralar tripsizlanadi va 75 mM KCLda qayta suspenziya qilindi va xona haroratida 20 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Hujayralar aylantirildi, 10 ml fiksatorda (75% metanol va 25% sirka kislotasi) qayta suspenziya qilindi, xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va santrifüj qilindi. Pelletlar 10 ml fiksatorda qayta suspenziya qilindi va xona haroratida 5 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Ushbu bosqich takrorlandi va nihoyat, pellet 0,5-1,0 ml fiksatorda qayta suspenziya qilindi. Hujayra suspenziyasi slaydga tushirildi va quritishga ruxsat berildi. Slaydlar 3 foizli Giemsa eritmasida 5 daqiqa davomida bo'yalgan, musluk suvida yuvilgan va quritishga ruxsat berilgan. Slaydlar kodlangan va har bir kodlangan madaniyatdan 50 ta metafaza xromosoma shikastlanishi uchun tekshirilgan. Ballar qo'yilgandan so'ng, slaydlar dekodlandi va natijalar taqdim etilganidek tahlil qilindi (Stoepker va boshq., 2011).

UDS

180,000 hujayralar DMEMda 1 foizli FBS bilan 18-mm shisha qoplamalarga 12-quduq plitalariga ekilgan. 24 soatdan so'ng hujayralar 3 J/m2 UV-C bilan 5-µm filtr orqali lokal ravishda nurlandi. Keyin hujayralar 1 soat yoki 4 soat davomida 20 mkM EdU (VWR) va 1 mkM5-ftor-deoksiuridin (Sigma-Aldrich) bilan impuls bilan belgilandi. Belgilangandan so'ng, hujayralar DMEMda 10 mkM timidin bilan 30 daqiqa davomida qo'shimchalarsiz o'rtacha quvib chiqarildi va PBSda 3,7 foiz formaldegid bilan 15 daqiqa davomida mahkamlandi. Hujayralar 0,5% Triton-X100 bilan PBS da 20 daqiqa davomida o'tkazuvchan bo'lgan va PBS da 3% BSA (Thermo Fisher Scientific) da bloklangan. O'rnatilgan EdU ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga (Invitrogen) muvofiq Click-iT kimyosidan foydalangan holda Attoazide Alexa Fluor 647 bilan birlashtirildi. Ulanishdan so'ng hujayralar 10 daqiqa davomida 2 foizli formaldegid bilan postfikslangan va keyinchalik 100 mM glisin bilan bloklangan. DNK 0,5 M NaOH bilan 5 daqiqa davomida denatüratsiya qilindi, so'ngra 15 daqiqa davomida 10% BSA bilan blokirovka qilindi. Keyinchalik, hujayralar siklobutan pirimidin dimerlariga qarshi antikor bilan (S5-jadvalga qarang) 2 soat, keyin 1 soat davomida ikkilamchi antikorlar va DAPI 5 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Hujayralar Polymountda (Brunshvig) o'rnatildi.

MS ma'lumotlarini yig'ish

MS asosan yuqorida tavsiflanganidek amalga oshirildi (Salas Lloret va boshq., 2019). Barcha tajribalar nanoelektrospray ion manbai orqali Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) ga ulangan EASY-nLC 1000 tizimida (Proxeon) amalga oshirildi. Q-Exactive 1,9 mkm C18-AQ boncuklari (Reprospher) bilan qadoqlangan 25-sm silika emitteriga (FS360-75-15-N-5-C25; NewObjective) ulangan. -DE;Pur; Doktor Manish, Ammerbuch-Entringen, Germaniya). Namunalar 0% dan 30% asetonitrilgacha 40-daqiqa xromatografiya gradientida oʻtkazildi, soʻngra 200 NL/min oqim tezligi bilan ustunni qayta muvozanatlashdan oldin asetonitril 95% gacha oshirildi. Mass-spektrometr ma'lumotlarga bog'liq bo'lgan yig'ish rejimida birinchi yettilik usuli va skanerlash diapazoni 300-1600 m/z bilan ishladi. Toʻliq skanerlangan MS spektrlari 3 × 106 maqsadli qiymatda va 70 000 ruxsatda olingan va yuqori toʻqnashuvli dissotsiatsiya tandem massa spektrlari (MS/MS) 105 maqsadli qiymatda qayd etilgan va ruxsati 35 000, izolyatsiya oynasi 2,2 m/z va normallashtirilgan to'qnashuv energiyasi 25 foiz. Minimal avtomatik daromadni boshqarish maqsadi 104 edi. Maksimal MS1 va MS2 inyeksiya vaqtlari mos ravishda 250 va 120 ms edi. Skanerlangan ionlarning prekursor ion massalari MS/MS tahlilidan 30 soniya davomida dinamik ravishda chiqarib tashlandi. Zaryad 1 va 6 dan yuqori bo'lgan ionlar MS2 tahlilini ishga tushirishdan chiqarildi.

MS ma'lumotlarini tahlil qilish Barcha xom ma'lumotlar yuqorida tavsiflanganidek MaxQuant (1.6.6.0 versiyasi) yordamida tahlil qilindi (Tyanova va boshq., 2016a). Biz homo sapiens uchun silikonda hazm qilingan UniProt mos yozuvlar proteomasini, jumladan kanonik va izoform ketma-ketliklarini (27-may, 2019) qidirdik. Ma'lumotlar bazasini qidirish quyidagi o'zgartirishlar bilan standart sozlamalarga muvofiq amalga oshirildi. Tripsin/P bilan hazm qilish to'rtta o'tkazib yuborilgan bo'linishga imkon berdi. Oksidlanish (M) va asetil (oqsil N-term) maksimal uchta o'zgaruvchan modifikatsiya sifatida ruxsat etilgan. Karbamido-metil (C) qattiq modifikatsiya sifatida o'chirib qo'yildi. Yorliqsiz miqdorni aniqlash (LFQ) yoqildi, bu Tez LFQga ruxsat bermadi. Max-Quant chiqish ma'lumotlari Perseus hisoblash platformasi yordamida qayta ishlandi (v 1.6.6.0; Tyanova va boshq., 2016b). LFQ intensivligi qiymatlari log2 o'zgartirildi va faqat sayt yoki teskari peptidlar tomonidan aniqlangan potentsial ifloslantiruvchi moddalar va oqsillar olib tashlandi. Namunalar eksperimental toifalarda guruhlangan va kamida bitta guruhdagi to'rtta replikatsiyadan to'rttasida aniqlanmagan oqsillar ham olib tashlandi. Yo'qotilgan qiymatlar matritsaning butun qiymatlarini hisobga olgan holda 1,8 pastga siljish (log2) va tasodifiy 0,3 kenglik (log2) bilan normal taqsimlangan qiymatlar yordamida hisoblangan. Qaysi oqsillar sezilarli darajada boyitilganligini aniqlash uchun statistik tahlil (t-testlar) o'tkazildi. Vulkan uchastkalari yaratildi va statistik tahlil chiqish jadvallari Microsoft Excelda qayta ishlandi. MS proteomikasi ma'lumotlari PRIDE (Perez-Riverol va boshq., 2019) PXD017940 ma'lumotlar to'plami identifikatori bilan hamkorlar ombori orqali ProteomeXchange Konsortsiumiga saqlangan.

Rekombinant ERCC1-XPFni tozalash

Baculovirus ishlab chiqarish pMacroBac-His-ERCC1/XPF-HA konstruksiyalari (Enzlin va Sch¨ arer, 2002) yordamida tasvirlanganidek amalga oshirildi. ERCC1WT va ERCC1R156W Sf9 hasharot hujayralarida bitta bakulovirusdan XPFWT bilan birgalikda ifodalangan. Heterodimerlar tavsiflanganidek nikelga yaqinlik, o'lchamni istisno qilish va geparin xromatografiyasi orqali tozalandi (Enzlin va Sch¨ arer, 2002). ERCC{10}}XPF geparin ustunidan 600 mM NaCl atrofida elutsiya qilindi. Protein konsentratsiyasi 0,1 dan 0,2 mg / ml gacha.

Nukleaz tahlili

39 uchida (IDT) lyuminestsent bo'yoq Cy5 (5{17}} pmol) o'z ichiga olgan novda halqali substrat (GCCAGCGCTCGG(T)22CCGAGCGCTGGC) 100-ml tavlanish buferida (10 tavlandi. mM Tris, pH 7,5 va 5{24}} mM NaCl) 95 gradusda 5 daqiqa qizdirish va 2 soat davomida asta-sekin sovutish. 25 mM HEPES, pH8.0, 2 mM MgCl2, 10% glitserin, 0,5 mM -merkaptoetanol, 0.1mg/ml BSA, 440 ni oʻz ichiga olgan 20-ml reaksiyalarda 2{27}}0 fmol tavlangan substrat ishlatilgan. mM NaCl va 0-40 nM protein. Reaksiyalar 30 gradusda 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va 10 µl90% formamid/10 mM EDTA qo‘shib to‘xtatildi. 95 daraja haroratda 5 daqiqa qizdirilgandan va muzda sovutilgandan so'ng, har bir namunadan 15 µl 15 foiz denaturatsiya qiluvchi poliakrilamid jelga yuklangan. Jellar 30 mA da 30 daqiqa davomida ishladi va bantlar Typhoon RGB (Amersham Biosciences) tomonidan floresans orqali vizualizatsiya qilindi.

In vitro NER tahlili

XPF yetishmaydigan (XP2YO) hujayra ekstraktlari va plazmidni o'z ichiga olgan saytga xos dG-AAF lezyoni ilgari ta'riflanganidek hosil qilingan (Gillet va boshq., 2005; Shivji va boshq., 1999) . Har bir reaksiya uchun 2 µl tuzatish buferi (2{{40}}0 mM Hepes-KOH, 25 mM MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mM ATP, 110 mM fosfokreatin va 1,8 mg / ml BSA, yakuniy pH 7,8), 0,2 µl kreatin fosfokinaz buferi (quyon mushaklaridan 2,5 mg/ml kreatin fosfokinaz [Sigma Aldrich], 10 mM glisin, pH 9,0 va 50% glitserin), XPF3de mkl ekstrakti, NaCl (yakuniy kontsentratsiyasi 70 mM gacha) va umumiy hajmi 9 µl bo‘lgan tozalangan ERCC{30}}XPF oqsillari 10 daqiqa davomida 30 daraja oldindan isitildi. Har bir reaksiyaga dG-AAF (50 ng/mkl) ni o'z ichiga olgan 1 mkl plazmid qo'shildi va reaktsiyalar 30 gradusda 45 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Keyin reaksiya aralashmasi muz ustida 5 daqiqa sovutildi, so'ngra 0,5 µl 1 mkM qo'shimcha ip d (GGGGCATGTGGCGCCGGTAATAGC TACGTAGCTC) qo'shildi va reaktsiya aralashmasi 5 daqiqa davomida 95 daraja qizdirish orqali denatüratsiya qilindi. Xona haroratida 15 daqiqa tavlanishdan so‘ng 1 µl ketma-ketlik aralashmasi (har bir reaksiya uchun 0,13 U ketma-ketlik va 2,0 µCi [-32P] dCTP o‘z ichiga olgan) qo‘shildi. 37 daraja 3 daqiqa davomida inkubatsiyadan so'ng 1,2 mkl deoksiribonukleotid trifosfat aralashmasi (50 mkM dCTP, 100 mkM dTTP, 100 mkM dATP va 100 mkM dGTP) qo'shildi. Reaksiya aralashmasi 37 daraja haroratda 12 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va 8 µl yuklovchi bo‘yoq (80 foiz formamid va 10 mM EDTA) qo‘shib reaksiya to‘xtatildi. Namunalar 5 daqiqa davomida 95 daraja qizdirildi, muzda sovutildi va 14 foiz denaturatsiya qiluvchi poliakrilamid jelga yuklandi. Jellar 2,5 soat davomida 45 Vt quvvatda ishladi va chiziqlar PhosphorImager (Typhoon RGB) yordamida vizualizatsiya qilindi.

Onlayn qo'shimcha material

S1-rasmda 1-aka-uka va 2-opa-singilda jigar va buyraklar funksiyalarining laboratoriya qiymatlari ko'rsatilgan. S2-rasmda ERCC1 genidagi noto'g'ri mutatsiya va intragenik o'chirishni tasdiqlovchi genomik ketma-ketlik ma'lumotlari ko'rsatilgan. S3-rasmda bemor fibroblastlarida ERCC1 va XPF ning oqsil ifodasi ko'rsatilgan. S4-rasmda tozalangan rekombinant ERCC1 va XPF oqsillari va ERCC1WT va ERCC1R156W Co-IP ko'rsatilgan. S5-rasmda UDS mikroskopiya tasvirlari, H2AX o‘choqlari va ERCC1-XPFdagi bemor mutatsiyalarining joylashuvi ko‘rsatilgan. S1-jadvalda ushbu tadqiqotda foydalanilgan barcha primerlar va zondlarning ketma-ketligi mavjud. S2-jadvalda ushbu tadqiqotda sinab ko'rilgan barcha hujayra qatorlari keltirilgan. S3-jadvalda ushbu tadqiqotda ishtirok etgan barcha plazmidlar keltirilgan. S4-jadvalda tadqiqotning sgRNK ketma-ketligi va S5-jadvalda antikorlar ko'rsatilgan. Jadval S6 raqamlarda miqdoriy aniqlash uchun ishlatiladigan hujayralar sonini beradi. Data S1 barcha kesilmagan Western blot fayllarini ko'rsatadi.

Minnatdorchilik

Mualliflar aka-uka va ularning ota-onalariga ushbu maqolaga hissa qo‘shganliklari uchun minnatdorchilik bildiradilar, Silvi Noordermeer (Leyden universiteti tibbiyot markazi [LUMC], Leyden, Niderlandiya) pLenti-CW57-TO-GFP lentiviral ifoda vektori va KI yaratish bo‘yicha maslahatlar. hujayralar, mVenus cDNA uchun Yoaxim Goedxart (Amsterdam universiteti, Amsterdam, Niderlandiya), DNK-PK inhibitori uchun Bert van derKooij (LUMC, Leiden, Niderlandiya), Wim Vermeulen va Anja Rams (Erasmus MC, Rotterdam, Niderlandiya) 165TOR hujayralari, CS20LO hujayralari bilan ta'minlash uchun Tomoo Ogi (Nagoya universiteti, Yaponiya), CSL16NG va CSL16NG hTERT hujayralari bilan ta'minlash uchun Alan Lehman (Sasseks universiteti, Buyuk Britaniya) va KI hujayralarini yaratish bo'yicha maslahat uchun Joost Shimmel (LUMC, Leyden, Niderlandiya) .

Bu ish Leyden universiteti Tibbiyot markazi tadqiqot stipendiyasi va Nederlandse tashkiloti tomonidan moliyalashtirildi. Biz Onderzoek VIDI grantini (ALW.016.161.320) MSLuijsterburgga, Yevropa tadqiqot kengashining ACO Vertegaal, KWInvestrij grantiga (310913) boshlovchi grantini taqdim etamiz. 11367) R. Gonz´alez-Prietoga, KWF Kan kerbestrijding granti (VU 2013-5983) MA Rooimans va Koreya asosiy fanlar instituti (IBS-R022-A1) va Milliy grantlar Saraton instituti (P01CA092584) ODSch arerga.

Muallif hissalari: K. Apelt KO hujayralari, KI hujayralari va barqaror hujayra liniyalarini yaratdi; ERCC1 va XPF ifodasi, lentiviral transduksiyalar, klonogen omon qolishlar (UV, MMC, IR), Western blot tahlili uchun Co-IP tajribalari, UDS tajribalari, MS uchun Co-IP tajribalari va H2AX bo'yoqlari uchun Western blot va immunostainings amalga oshirildi; va qog'ozni yozdi. A. Kragten mahalliy ultrabinafsha nurlanishidan keyin UDS, RRS va immuno-bo'yoqlarni o'tkazdi. AP Wonder gem KO va KI hujayralarini yaratdi va noto'g'ri mutatsiyani tasdiqlash uchun UDS tajribalari, Western blot va Sanger sekvensiyasini amalga oshirdi. SM White bemorlarga maslahat berdi, ekzoma ma'lumotlarini tahlil qildi, biopsiya qildi, birlamchi fibroblastlarni yaratdi va bemorning klinik tavsifini yozdi. S. Lunke va BT Wilson NGS ma'lumotlarini yaratdilar. S. Pantaleo va D. Flanagan o'chirishni tasdiqlash uchun qPCRni amalga oshirdi. C.Kvinlan buyrakning klinik tavsifini yozgan. V.Xardikar jigarning klinik tavsifini yozgan. MA Rooimans va R.MF Wolthuis hTERT bilan abadiylashtirilgan 48BR va PV50LD fibroblastlarini yaratdilar va MMC tomonidan induktsiya qilingan xromosoma sinishi tahlillarini o'tkazdilar. R. Gonsales-Prieto va ACO Vertegaal barcha MS tajribalarini tahlil qildilar. WW Wiegant va H. vanadium U2OS hujayralarida (IR) klonogen omon qolishni amalga oshirdi. J.-E.Yeo va HS Kim rekombinant oqsillarni tozaladilar va nukleaza tahlilini va in vitro NER tahlillarini o'tkazdilar. OD Sch¨arervisor in vitro NER ishi R156W allelining strukturaviy talqiniga hissa qo'shdi va qog'ozni tahrir qildi. MS Luij sterburg loyihani nazorat qildi va qog'ozni yozdi.

Ma'lumotnomalar

Abdel Ghaffar, TY, ES Elsobky va SM Elsayed. 2011. Kokayn sindromi bo'lgan bemorlarda kolestaz va klinik tashxis uchun o'zgartirilgan mezonlarni taklif qildi. Yetim J. Rare Dis. 6:13. -1172-6-13

Abdulla, UB, JF MakGouran, S. Brolin, D. Ptchelkine, AH El-Sagheer, T. Braun va PJ McHugh. 2017. RPA XPF-ERCC1 endonukleazasini faollashtiradi va DNK o'zaro bog'liqliklarini qayta ishlashni boshlaydi. EMBO J. 36: 2047–2060.

Adair, GM, RL Rolig, D. Moore-Faver, M. Zabelshansky, JH Wilson va RS Nairn. 2000. Maqsadli gomologik rekombinatsiya paytida uzun homolog bo'lmagan quyruqlarni olib tashlashda ERCC1 ning roli. EMBO J. 19: 5552–5561.

Ahmad, A., AR Robinson, A. Duensing, E. van Drunen, HB Beverloo, DB Weisberg, P. Hasty, JH Hoeijmakers va LJ Niedernhofer. 2008. ERCC{1}}XPF endonukleazasi DNKning ikki zanjirli uzilishini tiklashni osonlashtiradi. Mol. Hujayra. Biol. 28:5082–5092.

Ahmad, A., JH Enzlin, NR Bhagwat, N. Wijgers, A. Raams, E. Appledoorn, AF Theil, JH J Hoeijmakers, W. Vermeulen, NG J Jaspers va boshqalar. 2010. XPF-ERCC1 nukleazasining noto'g'ri joylashishi XP-F bemorlarida DNKning tiklanishini kamaytirishga yordam beradi. PLoS Genet. 6: e1000871.

Auerbach, AD 2009. Fankoni anemiyasi va uning tashxisi. Mutat. Res. 668:4–10.

Ben Chehida, A., N. Ghali, R. Ben Abdelaziz, F. Ben Mussa va N. Tebib. 2017. Kokayn sindromi bo'lgan 2 aka-uka buyrakning ishtiroki. Eron. J. Buyrak dis. 11:253–255.

Biggerstaff, M., DE Szymkowski va RD Wood. 1993. ERCC1, ERCC4 va kseroderma pigmentosum guruhi F DNK tuzatish nuqsonlarini in vitro bilan birgalikda tuzatish. EMBO J. 12: 3685–3692.

-2075.1993.tb06043.xBogliolo, M., B. Shuster, C. Stoepker, B. Derkunt, Y. Su, A. Raams, JP Trujillo, J. Minguillon, MJ Rami´rez, R. Pujol , va boshqalar. 2013. DNKni tiklovchi endonukleaza XPF ni kodlovchi ERCC4 mutatsiyalari Fankoni anemiyasini keltirib chiqaradi. Am. J. Xum. Genet. 92:800–806.

Cekkaldi, R., P. Sarangi va AD D'Andrea. 2016. Fanconi anemiya yo'li: yangi o'yinchilar va yangi funktsiyalar. Nat. Ruhoniy Mol. Hujayra Biol. 17: 337–349.

de Laat, WL, E. Appeldoorn, NG Jaspers va JH Hoeijmakers. 1998a. ERCC1-XPF endonukleaza faolligi uchun zarur bo'lgan DNK strukturaviy elementlar. J. Biol. Kimyo. 273:7835–7842.

de Laat, WL, AM Sijbers, H. Odijk, NG Jaspers va JH Hoeijmakers. 1998b. Inson ta'mirlash oqsillari ERCC1 va XPF o'rtasidagi o'zaro ta'sir doiralarini xaritalash. Nuklein kislotalari Res. 26:4146–4152.

nar/26.18.4146

de Vries, A., CT van Oostrom, FM Hofhuis, PM Dortant, RJ Berg, FR de Gruijl, PW Wester, CF van Kreijl, PJ Capel, H. van Steeg va SJ Verbeek. 1995. Ultrabinafsha-B va sichqonlarning kanserogenlariga nisbatan sezuvchanlikning ortishi, DNK eksizyonini tiklash geni XPA. Tabiat. 377:169–173.

DiGiovanna, JJ va KH Kraemer. 2012. Xeroderma pigmentosumga nur porlashi. J. Invest. Dermatol. 132:785–796.

Enzlin, JH va OD Schrer. 2002. XPF-ERCC1 DNK taʼmirlash endonukleazasining faol joyi yuqori darajada saqlanib qolgan nukleaza motivini hosil qiladi. EMBO J. 21: 2045–2053.

Funaki, S., S. Takaxashi, X. Murakami, K. Xarada va X. Kitamura. 2006. Takroriy o'tkir tubulointerstitial nefrit bilan Kokayn sindromi. Patol. Int. 56:678–682.

.02029.x

Gillet, LC, J. Alzeer va OD Schrer. 2005. N- (deoksiguanozin-8-il)-2-atsetilaminofluoren (dG-AAF) ning o'zgartirilgan "o'ta engil" DNK sintezi yordamida oligonükleotidlarga saytga xos qo'shilishi. Nuklein kislotalari Res. 33: 1961–1969.

Gregg, SQ, AR Robinson va LJ Niedernhofer. 2011. ERCC1-XPF DNK tuzatish endonukleazidagi nuqsonlarning fiziologik oqibatlari. DNKni tiklash (Amst.). 10:781–791.

Guo, C., Y. Nakazawa, L. Woodbine, A. Bjorkman, M. Shimada, H. Fawcett, N. Jia, K. Ohyama, TS Li, ​​Y. Nagayama va boshqalar. 2015. Inson sub'ektlarida XRCC4 etishmovchiligi sezilarli nevrologik fenotipni keltirib chiqaradi, ammo ochiq immunitet tanqisligi yo'q. J. Allergiya klinikasi. Immunol. 136:1007–1017.

Helfricht, A., PE Thijssen, MB Rother, RG Shah, L. Du, S. Takada, M. Rogier, J. Moritz, H. IJspeert, C. Stoepker va boshqalar. 2020. ZBTB24 ning yo'qolishi ICF sindromi bo'lgan bemorlarda nohomolog bo'lmagan so'nggi qo'shilish va sinf-switch rekombinatsiyasini buzadi. J. Exp. Med. 217: e20191688.

Houtsmuller, AB, S. Rademakers, AL Nigg, D. Hoogstraten, JH Hoeij-makers va V. Vermeulen. 1999. Tirik hujayralardagi DNK ta'mirlash endonukleazasining ERCC1/XPF ta'siri. Fan. 284:958–961. h

fan.284.5416.958

Jaspers, NG, A. Raams, MC Silengo, N. Wijgers, LJ Niedernhofer, AR Robinson, G. Giglia-Mari, D. Hoogstraten, WJ Kleijer, JH Hoeij-makers va V. Vermeulen. 2007. Insonda ERCC1 etishmovchiligi bo'lgan birinchi bemorda nukleotidlar eksizyonini tiklashda engil nuqson va jiddiy rivojlanish etishmovchiligi bo'lgan serebro-oculofasio-skeletal sindromi borligi xabar qilingan. Am. J. Xum. Genet. 80:457–466.

Joenje, H., AB Oostra, M. Wijker, FM di Summa, CG van Berkel, MA Rooimans, W. Ebell, M. van Weel, JC Pronk, M. Buchwald va F. Arwert. 1997. Fankoni anemiyasining kamida sakkiz geniga dalil. Am. J. Xum. Genet. 61:940–944.

Jons, M., F. Beuron, A. Borg, A. Nans, CP Earl, DC Briggs, AP Snijders, M. Bowles, EP Morris, M. Linch va NQ McDonald. 2020. XPF-ERCC1 endonukleazasining kriyo-EM tuzilmalari DNK-birikmasi avtomatik ravishda inhibe qilingan konformatsiyani qanday buzishini ochib beradi. Nat. Kommun. 11: 1120.

Karikkineth, AC, M. Scheibye-Knudsen, E. Fivenson, DL Croteau va VA Bohr. 2017. Kokayn sindromi: Klinik xususiyatlar, model tizimlari va yo'llari. Qarish Res. Vahiy 33:3–17.002

Kashiyama, K., Y. Nakazawa, DT Pilz, C. Guo, M. Shimada, K. Sasaki, H. Fawcett, JF Wing, SO Lewin, L. Carr va boshqalar. 2013. ERCC1-XPF nukleazasining noto'g'ri ishlashi turli xil klinik ko'rinishlarga olib keladi va Kokayn sindromi, pigmentoz kseroderma va Fankoni anemiyasini keltirib chiqaradi. Am. J. Xum. Genet. 92:807–819.