Tetrandrine kaltsiyga bog'liq kalpain-1 signal blokadasi orqali podotsitlar shikastlanishini engillashtiradi

Aloqa: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Yin Ding, Xuanli Tang, Yuxui Vang, Dongrong Yu, Caifeng Chju va Jin Yu*

Abstrakt

Fon:Podotsitlar proteinuriyaga aralashuvlar uchun hal qiluvchi nishonga aylandibuyrakkasalliklar. Ko'pgina tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, podotsitlar shikastlanishida vaqtinchalik retseptorlari potentsial kation kanali oqsili 6 (TRPC6) ning haddan tashqari ifodalanishi hujayra ichidagi Ca2 qo'shimcha oqimini tartibga soladi va Ca2 plyus bog'liq proteaz kalpa-1 signalini rag'batlantiradi. An'anaviy xitoy preparati tetrandrin, selektiv bo'lmagan Ca2 plyus kanal blokeri uzoq vaqtdan beri surunkali kasalliklarni davolash uchun ishlatilgan.buyrakkasallik. Ushbu tadqiqot tetrandrinning anti-proteinurik xususiyatlarining mumkin bo'lgan mexanizmlarini o'rganishga qaratilgan.

Usullari:Biz sichqon podotsitlari va adriamitsin qo'zg'atgan nefropatiya kalamushlarida Ca2 plyus bog'liq kalpain-1 signalida tetrandrinin ishtirokini tekshirdik. Ijobiy nazorat sifatida siklosporin A (CsA) va U73122 ishlatilgan. Hujayra hayotiyligi, sitotoksikligi, Ca2 plyus kontsentratsiyasi, kalpain faolligi va kalpain{5}} signalizatsiya yo'llarining mRNK va oqsil ifoda darajalari tekshirildi. Klinik va patologik o'zgarishlar o'lchanadi.

Natijalar:Tetrandrin o'stirilgan TRPC6-ortiqcha ekspressiv podotsitlarda hujayra ichidagi Ca2 va oqimini kamaytirdi. Ham in vitro, ham in vivo tadqiqotlarda tetrandrinni qo'llash kalpain faolligini va kalpain-1 ifodasini pastga boshqargan va quyi oqimdagi Talin-1 va nefrinning ekspressiyasini tiklagan. CsA bilan solishtirganda, tetrandrin bilan davolash kalpain faolligi va kalpain{4}} ifodasiga yuqori darajada inhibitiv ta'sir ko'rsatdi.

Xulosa:Tetrandrine kalpain{2}} signalizatsiya yo'lining Ca2 va unga bog'liq faollashuvini blokirovka qilish orqali podotsitlarning shikastlanishida terapevtik salohiyatga ega. Tetrandrin proteinuriyani kamaytiradi, buyrak funktsiyasini yaxshilaydi va buyrakning patologik shikastlanishini engillashtiradi.

Kalit so‘zlar:Tetrandrine, Podotsit shikastlanishi, Vaqtinchalik retseptor potentsial kation kanali oqsili 6, Kalpain-1

Cistanche tubulosa buyrak kasalligining oldini oladi, namunani olish uchun shu yerni bosing

Fon

Podotsitlar glomerulyar filtratsiya to'sig'ining selektiv o'tkazuvchanligini va glomerulyar struktura yaxlitligini saqlash uchun zaruriy shartdir. Podotsitlar shikastlanishi odatda buyrakning proteinurik kasalliklari, shu jumladan fokal segmentar glomeruloskleroz (FSGS), membranoz nefropatiya, minimal o'zgarishlar kasalligi va diabet bilan bog'liq.buyrakkasallik [1-4]. Podositlarni zararli omillardan himoya qilish va tiklash buyrak kasalligini muvaffaqiyatli davolashda asosiy muammo hisoblanadi.

Podositlar glomerulyar bazal membranadan tashqarida joylashgan va oyoq jarayonlari bilan tavsiflangan yuqori darajada ixtisoslashgan, terminalda farqlangan hujayralardir. Podositlarda kaltsiy signalizatsiyasi regulyatsiyasining buzilishi podotsitlar aktin sitoskeletal disorganizatsiyasiga, oyoq jarayonining buzilishiga, diafragma diafragma diafragmasining yorilishi va proteinuriyaga olib keladi. Vaqtinchalik retseptor potentsial kation kanali oqsili 6 (TRPC6), podotsitlardagi yangi yoriqli diafragma bilan bog'langan oqsil, o'ziga xos bo'lmagan Ca2 va o'tkazuvchan ion kanali sifatida aniqlangan [5-8]. Glomerulyar TRPC6 ifodasi ko'plab irsiy va orttirilgan proteinurik kasalliklarda kuchayadi. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, podotsitlarda TRPC6 ning haddan tashqari ko'payishi, podotsitlar shikastlanishi uchun javobgar bo'lgan hujayra ichidagi Ca2 plus oqimining yuqori darajada oshishiga olib keladi. Podositlar ichidagi kaltsiy yukining ortishi maqsad genlarning faolligini yoki ifodasini modulyatsiya qilish uchun quyi oqim signalizatsiya yo'llarini, jumladan kalpain-1, Talin-1, nefrin va kalsinevrinni faollashtiradi [9-12]. Fangji Huangqi Tang nefrotik sindromni davolash uchun klassik an'anaviy xitoy tibbiyoti (TCM) hisoblanadi [13]. U oltita o'tdan iborat: Radix Stephania Tetrandra (Stefania tetrandra ildizlari), Radix Astragali (Astragalus membranaceus ildizlari), Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (Atractylodes macrocephaly ildizlari), Radix Glycyrrhizae (Glycyrrhizae ildizi) (Zingiber Officinale ildizlari) va Fructus Ziziphi Jujubae (Fructus of Ziziphus jujuba) [1]. Radix Stephania Tetrandra ning asosiy faol komponentlaridan biri bo'lgan tetrandrin, selektiv bo'lmagan Ca2 plyus kanal blokeri, klinik sinovlarda sinovdan o'tgan va proteinuriyani engillashtirish va buyrak faoliyatini yaxshilash uchun ko'rsatilgan [14, 15]. Oldingi tadqiqot tetrandrinning podotsitlarda Ca2 plyus ga bog'liq RhoA signaliga blokirovka qiluvchi ta'sirini ko'rsatdi [16], ammo asosiy mexanizmlar aniqlanmagan. Bu erda TRPC{22}}ortiqcha ifodalovchi modellar in vitro va in vivo ishlab chiqilgan. Tetrandrin qo'llanilgandan so'ng, TRPCga bog'liq bo'lgan Ca2 plyus signalizatsiyadagi o'zgarishlar baholandi, jumladan quyi oqim maqsadlari, kalpain-1, Talin-1, nefrin va kalsineurin. Ijobiy nazorat sifatida proteinuriya kasalliklarini davolashda keng qo'llaniladigan kalsinevrin inhibitori siklosporin A (CsA) [17] va TRPC6 kanalini ochish inhibitori [18] U73122 ishlatilgan.

Usullari

Hujayra madaniyati va plazmid tuzilishi

Professor Piter Mundeldan (Sinay tog'i tibbiyot maktabi, AQSh) olingan shartli o'lmas sichqon podotsit hujayra chizig'i (MPC5) hujayralari ko'payish uchun 33 darajada ushlab turildi va keyin farqlash uchun 37 darajaga o'tkazildi. TRPC6 ifoda plazmidi TRPC6 genining kodlovchi DNK ketma-ketligining toʻliq uzunligini pCDH-GFP-PURO vektorining EcoRI/BamHI joylariga klonlash orqali tuzilgan va lentivirusga qadoqlangan. Differensiatsiyalanganda va taxminan 80 foiz qo'shilish darajasigacha o'stirilganda, podotsitlar har sm2 uchun 4×104 hujayra zichligida ekilgan va TRPC{11}}ortiqcha ifodalovchi lentivirus bilan birgalikda inkubatsiya qilingan. TRPC6 oqsili va mRNK ifodasi yordamida tasdiqlangan TRPC6 barqaror hujayra liniyasi keyingi tajribalar uchun ishlatilgan. Shu bilan birga, MPC5 podotsitlari uchta guruhga bo'lingan: oddiy nazorat (NC) guruhi, bo'sh lentivirus (Lv-NC) guruhi va TRPC{16}}ortiqcha ifodalovchi (OverTRP) guruhi.

In vitro hujayrali dori-darmonlarni davolash va sitotoksiklik tahlili

Hujayra hayotiyligi ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Hujayralarni hisoblash to'plami{0}} (CCK-8) tahlili yordamida o'rganildi. Har bir quduqqa jami 5{8}}00 MPC5 podotsitlar 96-quduq plastinkalarida uch nusxada yetishtirildi. Hujayralar bir qator CsA (0-2mkmol / L; Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh) va tetrandrin (0-40mkmol / L; Sigma Aldrich) bilan 37 daraja 48 soat davomida davolandi. Keyin CCK{12}} plitalarga (10 mkl/quduqqa) qo'shildi, keyin ular qorong'ida 2 soat davomida inkubatsiya qilindi. 450 nm chastotada yutilish mikroplata o'quvchi (BioTek Instruments, AQSh) yordamida o'lchandi. Sitotoksiklik Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST (Dojindo Laboratories, Yaponiya) yordamida laktat dehidrogenaza (LDH) chiqarilishini miqdoriy aniqlash orqali tekshirildi. Ijobiy nazorat sifatida hujayralar 10 mkmol/LU73122 (Cal biochem, AQSH) bilan 37 daraja haroratda 10 daqiqa davomida davolandi.

RNK ekstraktsiyasi va miqdoriy teskari transkriptaza-polimeraza zanjiri reaktsiyasi (qRT‑PCR)

Jami RNK madaniyatli hujayralardan tayyorlangan vabuyrakRNAiso Plus reagenti (Takara, Yaponiya) yordamida to'qimalar va ishlab chiqaruvchilarning protokoliga muvofiq cDNA PrimeScript™ RT Master Mix to'plamiga (Takara) teskari transkripsiya qilinadi. qRT-PCR Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Germaniya) yordamida amalga oshirildi. Maqsadli va mos yozuvlar genlarining primer ketma-ketligi S1 qo'shimcha jadvalida keltirilgan. Ma'lumotlar ABI Prism 7900HT FAST Real-Time PCR tizimi yordamida to'plangan. Nishon gen ifodasining nisbiy miqdori qiyosiy 2-DDCt usuli yordamida normallashtirildi. Ichki nazorat sifatida glitseraldegid 3-fosfatdehidrogenaza (GAPDH) ishlatilgan.

Western bloting

umumiy oqsil namunalari madaniyatli hujayralardan olingan vabuyrakto'qimalar. Protein kontsentratsiyasi BCA protein tahlili to'plami (Thermo Fisher Scientific) yordamida aniqlandi. Namunalar 10% natriy dodesil sulfat-poliakrilamid jelida ajratildi va poliviniliden diflorid membranasiga o'tkazildi. Keyin membrana bir kechada 4 daraja haroratda birlamchi antikorlar, ya'ni anti-TRPC6 (Santa Kruz, AQSh), kaliyga qarshi og'riq-1 (Abcam, Buyuk Britaniya), anti-talin-1 (Abcam) bilan bloklandi. , anti-nefrin (Santa Kruz) va anti-kalsinevrin (Abcam). Yuvishdan keyin membrana echki antiquyon IgG (H plus L; Jekson ImmunoResearch Laboratories, AQSh) bilan inkubatsiya qilindi. Membrana, shuningdek, teng yuklanish uchun GAPDH (Abcam) ni aniqlash uchun qayta ishlandi. Birlamchi antikor tomonidan tan olingan diapazonlar tasvirlangan va oqsil tasmalarining optik zichligi TanonImage dasturi (Tanon, Xitoy) yordamida tahlil qilingan.

Madaniy podotsitlarda sitozolik Ca2 plyusni aniqlash MPC5 podotsitlari ekilgan va mos ravishda 48 soat, 48 soat va 10 daqiqa davomida tetrandrine, CsA va U73122 bilan ishlov berilgan. Keyin podotsitlar qorong'uda 30 daqiqa davomida 10 mkM Fluo-3AM (Dojindo Laboratories) bilan to'ldirilgan RPMI-1640 bilan inkubatsiya qilindi. Shundan so'ng, ular zudlik bilan fosfat tamponli sho'r suv bilan yuvildi, unda ular 488 nm da saqlangan va hayajonlangan. Sitozolik Ca2 plyus ionining nisbiy kontsentratsiyasi Zeiss lazerli konfokal ko'rish tizimi (Zeiss, AQSh) yordamida floresans intensivligini o'lchash orqali baholandi.

Kalpain faolligini o'lchash

Kalpain faolligi ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq Abcam Inc kompaniyasining Calpain Activity Assay Kit yordamida aniqlangan. Podositlarning supernatant (150 uL) yokibuyrakto'qimalar tegishli bufer eritmasida (145 mmol/L Nacl, 1 0 0 mmol/L Tris-HCL, pH7,3) va 0,15 mLN-Suksinil-Leu-Tyr-AMC (500 umol/L) ga olindi. Qorong'ida 37 daraja 1-soatlik inkubatsiyadan so'ng, namunalar 360 nm qo'zg'atuvchi filtr va 440 nm emissiya filtri bilan jihozlangan florometr yordamida o'qildi.

Adriamitsin qo'zg'atgan nefropatiya (ADRN) kalamush modeli. Dastlabki tajribalarimizda Fermi tomonidan namuna hajmining [19] yaqinlashishi va nazorat va model guruhlari o'rtasidagi proteinuriya farqiga asoslanib, tadqiqotimizda zarur bo'lgan kalamushlarning umumiy soni aniqlandi. Taxminan 200 g og'irlikdagi va taxminan 8 haftalik (Chjejiang TCM instituti) jami 56 ta sog'lom erkak Sprague-Dawley kalamushlari tasodifiy ravishda ettita guruhga (n =8 kalamush/guruh), ya'ni ADR guruhi, ADR plus bo'lingan. tetrandrin past dozali guruh (4mg/kg/kun), ADR plyus tetrandrin o‘rta dozali guruh (8mg/kg/kun), ADR plyus tetrandrin yuqori dozali guruh (16mg/kg/kun), ADR plyus CsA bilan davolash qilingan guruh (30mg) /kg/d), ADR plus tetrandrinning o'rta dozasi (8mg/kg/d) CsA (30mg/kg/d) guruhi va NC guruhi bilan birgalikda. Model guruhidagi va dori-darmonlarni davolash guruhlaridagi kalamushlar ketamin gidroxloridning (50 mg / kg) intraperitoneal in'ektsiyasi bilan behushlik qilindi va FSGS kalamush modelini ishlab chiqish uchun kaudal venaga ikki doz ADR (4 mg / kg) yuborildi. 12 hafta o'tgach, kalamushlarning siydik namunalari metabolik katakchalar yordamida 24 soat davomida to'plangan, so'ngra qon va hosil yig'ilgan.buyraklar. Klinik samaradorlik kuzatildi va 24-soatlik siydik oqsili, plazma albumini, sarum kreatinin (Scr) va qon siydik azoti (BUN) darajasidagi o'zgarishlar avtomatlashtirilgan kimyo analizatori (HITACHI 7180) bilan savdoda mavjud diagnostika to'plamlari yordamida o'lchandi. ).

Hayvonlardan foydalanish bilan bog'liq barcha eksperimental protseduralar Chjejiang TCM institutida (Tyanmusan yo'li №132) Hayvonlar tajribasi bo'yicha Etika qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan va NIH Laboratoriya hayvonlarini parvarish qilish va ulardan foydalanish bo'yicha qo'llanmada ko'rsatilgan tamoyillarga muvofiq qat'iy bajarilgan. .

Gistologik bo'yash, elektron mikroskopiya va tahlil

Kalamushbuyraklarparaformaldegidda mahkamlangan, etanolning bosqichma-bosqich seriyali yordamida suvsizlangan va kerosinga singdirilgan. Kesmalar (5-mkm qalinlikdagi) gematoksilin va eozin (H&E) va Masson trikromi bilan bo'yalgan va optik mikroskop ostida tekshirilgan. Buyraklar perfuziya qilingan va glutaraldegid bilan biriktirilgan va keyin epoksi qo'shilishi uchun 1- mm3 to'qimalar bloklariga kesilgan. Elektron mikroskopiya standart protseduralar yordamida amalga oshirildi. Har bir namunadan tasodifiy ravishda beshta ultra-mikrograflar olingan. Podotsitlarning oyoq jarayonlarining sintez tezligi (PFR) quyidagi formula bo'yicha hisoblab chiqilgan: PFR (foiz )=∑LFP / ∑LBM×100 foiz, bu erda ∑LFP - birlashtirilgan oyoq jarayonining umumiy uzunligi va ∑LBM - periferik kapillyar bazal membrananing umumiy uzunligi (BM).

Statistik tahlil

Ma'lumotlar o'rtacha±standart o'lchov xatosi sifatida ifodalanadi va SPSS 20.0 (IBM Statistics SPSS, US) va GraphPad Prism 6 for Windows (GraphPad Software Inc., AQSh) yordamida tahlil qilinadi. Oddiy taqsimot qq chizmalari va SW testi bilan baholandi. Ma'lumotlar normal taqsimotni ko'rsatdi. Ikki guruh ma'lumotlar solishtirilganda, mustaqil namunalar t-testi qo'llanildi. Uch yoki undan ortiq mustaqil guruhlar o'rtasidagi farqlar bir tomonlama dispersiya tahlilidan so'ng Tukeyning post hoc testi yordamida taqqoslandi. Statistik ahamiyatga ega bo'lgan p<>

Natijalar

Tetrandrin, CsA va U73122 ning optimal konsentratsiyasi va sitotoksikligini tanlash

Hujayra hayotiyligini aniqlash uchun CCK{0}} tahlili ishlatilgan. 1a va b-rasmda ko'rsatilganidek, 1{7}}mkmol/L tetrandrin va 0,1 mkmol/L CsA maksimal konsentratsiyasi MPC5 podotsitlarining hayotiyligiga ta'sir qilmadi. LDH chiqarish tahlili 48 soat davomida 10 mkmol/L tetrandrin va 0,1 mkmol/L CsA ning toksikligi yo'qligini, 10 min uchun 10 mkmol/LU73122 esa kutilgan toksiklikni ko'rsatganligini tasdiqladi (1c-rasm). Shuning uchun keyingi hujayra tajribalari mos ravishda 10mkmol/L va 0,1mkmol/L da tetrandrin va CsA dan foydalanildi.

Tetrandrin TRPC6 ni haddan tashqari ifodalovchi madaniyatli MPC5 hujayralarida hujayra ichidagi Ca2 va infuziyani kamaytirdi.

Plazmid transfeksiyasi yordamida MPC5 podotsitlarida TRPC6 haddan tashqari ekspressiyasining hujayra modeli muvaffaqiyatli o'rnatildi. qRT-PCR va western blot tahlili shuni ko'rsatdiki, Over-TRP guruhidagi TRPC6 ning ifoda darajalari NC va Lv-NC guruhlaridagiga nisbatan sezilarli darajada oshgan (p).<0.05; fig.="" 2a="" and="" b).="" and="" full-length="" gel="" and="" blot="" of="" trpc6="" were="" included="" in="" supplementary="" fig.="">

Floresan tasviri (2c-rasm) va yarim miqdoriy tahlil (2d-rasm) TRPC6 ning haddan tashqari ko'payishi hujayra ichidagi Ca2 ortiqcha oqimini kuchaytirganini ko'rsatdi, holbuki NC va Lv-NC guruhlari o'rtasida aniq farqlar yo'q edi. Keyin o'nta OverTRP guruhi hujayralari eksperimental dorilar bilan davolandi. Dori-darmonlarni oldindan davolash guruhlari (tetrandrine, CsA va U73122) hujayra ichidagi Ca2 plus oqimiga (P) inhibitiv ta'sir ko'rsatdi.<0.05), while="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" among="" the="" three="" groups="" of="">

Tetrandrinning MPC5 hujayralarida kalpain-1, kalsineurin, Talin-1 va nefrinning faolligiga va ifodalanishiga ta'siri

It has been shown that intracellular Ca2 plus activates calpain, a Ca2 plus -dependent cysteine protease, and calcineurin, a Ca2 plus /calmodulin-dependent protein phosphatase. In line with previous observations, the activity and expression levels of calpain and calcineurin in the OverTRP group were all higher than those in the NC and Lv-NC groups (p<0.05; fig.="" 3a-e,="" h="" and="" i).="" drop="" intervention="" in="" cultured="" trpc6-overexpressing="" podocytes="" established="" that="" tetrandrine="" inhibited="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" expression.="" te="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" mrna="" levels="" were="" significantly="" reduced="" in="" the="" tetrandrine-exposed="" group="" than="" in="" the="" csa="" intervention="" group=""><0.05; fig.="" 3a="" and="" d).="" western="" blotting="" results="" demonstrated="" a="" considerable="" decrease="" in="" calpain-1="" protein="" levels="" because="" of="" tetrandrine=""><0.05; fig.="" 3c="" and="" h).="" in="" addition,="" calcineurin="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05; fig.="" 3b)="" after="" tetrandrine="" exposure,="" but="" the="" mrna="" and="" protein="" expression="" levels="" of="" calcineurin="" remain="" unchanged="" (fig.="" 3e="" and="" i).="" treatment="" with="" csa="" did="" not="" block="" calpain="" activation="" (fig.="" 3a),="" and="" the="" effect="" was="" not="" as="" robust="" as="" that="" of="" tetrandrine="" in="" calpain-1="" mrna="" expression=""><0.05; fig.="" 3d).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 3b,="" e="" and="">

The podocyte cytoskeleton-associated anchoring protein Talin-1 and the slit diaphragm protein nephrin are two specific targets of calpain-1. When treated with tetrandrine, there was an increasing trend in mRNA and protein expression of Talin-1 (p >0.05) va nefrin (s<0.05), compared="" with="" that="" in="" the="" overtrp="" group,="" but="" this="" finding="" was="" not="" statistically="" significant="" among="" the="" three="" treatment="" groups="" (p="">0.05; 3f, g, j va k rasm).

To'liq uzunlikdagi jellar va dog'lar S1 qo'shimcha rasmga kiritilgan.

ADRN ning kalamush modelidan foydalangan holda in vivo tajribalar In vivo TRPC6/kalpain-1 signalizatsiyasining tetrandrin vositachiligida inhibisyoniga javobni tavsiflash uchun kalamushlarda ADRN modeli ishlab chiqildi. TRPC6 ning mRNK va oqsillarni ifodalash profillari ADRN guruhida normal ovqatlangan kalamushlarga qaraganda sezilarli darajada oshdi (NC guruhi; p<0.05; fig.="" 4a="" and="" b).="" consistent="" with="" the="" above="" studies="" in="" cell-based="" models,="" the="" activity="" and="" expression="" levels="" of="" calpain="" and="" calcineurin="" increased="" remarkably="" in="" the="" adrn="" group=""><0.05; fig.="" 4c-g,="" j,="" and="" k)="" than="" in="" the="" nc="">

CsA bilan davolash TRPC6 haddan tashqari ekspressiyasi natijasida kelib chiqqan kalpain faollashuvini bloklamadi (4c-rasm) va ta'siri tetrandrinning kaliy og'rig'i-1 protein ifodasiga ta'siri kabi kuchli emas edi (p).<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="" k).="" the="" tetrandrine="" group="" was="" down="" compared="" to="" the="" adr="" group="" (fig.="">

CsA bilan davolash TRPC6 haddan tashqari ekspressiyasi natijasida kelib chiqqan kalpain faollashuvini bloklamadi (4c-rasm) va ta'sir kalpain-1 oqsili ifodasiga tetrandrinning ta'siri kabi kuchli emas edi (p).<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="">

Bundan tashqari, Talin-1 va nefrinning ifodasi baholandi (4h, i, l va m-rasm). ADRN kalamushlarida Talin-1 va nefrin darajasi NC guruhidagiga nisbatan pasaygan (p.<0.05). upon="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" mrna="" levels="" and="" protein="" expression="" of="" talin-1="" and="" nephrin="" were="" visibly="" increased.="" the="" high-dose="" group="" of="" tetrandrine="" recovered="" the="" expression="" of="" the="" two="" structural="" components,="" similar="" to="" the="" adr+csa="" group="" (p="">0.05).

To'liq uzunlikdagi jellar va dog'lar S2 qo'shimcha rasmga kiritilgan.

Tetrandrin ADRN rivojlanishini bostirdi va gistopatologiyani qutqardi Tetrandrinning ta'siribuyrakADRN bilan davolash qilingan Sprague-Dawley kalamushlarida funksiya keyinchalik baholandi (5a-d-rasm). Guruhlar o'rtasida 24-h proteinuriya, Scr va BUN darajalarida dastlabki sezilarli farqlar yo'q edi. O'n ikki hafta o'tgach, ADRN guruhidagi 24 soatlik proteinuriya, Scr va BUN darajalari statistik ravishda oshdi, plazma albumini esa NC guruhidagilarga nisbatan sezilarli darajada kamaydi (P).<0.05). after="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" levels="" of="" proteinuria,="" scr,="" and="" bun="" were="" markedly="" decreased,="" whereas="" the="" level="" of="" albumin="" was="" significantly="" improved="" compared="" to="" those="" in="" the="" adr="" group=""><0.05). among="" the="" three="" dose-response="" subgroups="" of="" tetrandrine,="" a="" significant="" difference="" was="" observed:="" the="" middle="" dose="" demonstrated="" considerably="" better="" efficacy="" than="" the="" other="" two="" doses=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" levels="" of="" serum="" alanine="" aminotransferase,="" before="" and="" after="" treatment="" among="" groups="" (p="">0.05; ma'lumotlar ko'rsatilmagan).

Gistomorfologiyadagi o'zgarishlar 6-rasmda ko'rsatilgan. ADRN kalamushlarida H&E va Masson bo'yalishi FSGS, tubulointerstitial fibroz va buyrak oraliq yallig'lanish hujayralari infiltratsiyasini ko'rsatdi. Bundan tashqari, glomeruliyalarning elektron mikroskopiyasini ko'rish 80-100 foiz podotsit PFR bilan yuqori darajada o'chirilgan, semizlangan va birlashtirilgan podotsit oyoq jarayonlarini aniqladi. Tetrandrin kichik guruhlaridagi (o'rta dozali va yuqori dozali guruhlar) kalamushlar turli darajadagi ADR guruhiga qaraganda kamroq lezyonlar bilan namoyon bo'ldi va yuqori dozali guruhdagi yaxshilanish o'rta dozali guruhdagidan ustun keldi. Tetrandrin bilan davolash qilingan past, o'rta va yuqori dozali guruhlarda podotsit PFRlari mos ravishda 70-80 foiz, 50-60 foiz va 30-40 foizni tashkil etdi. Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, tetrandrin ADR qo'llash natijasida kelib chiqqan buyrak glomerulining strukturaviy shikastlanishidan himoyalangan. Guruhlar orasida yorug'lik mikroskopi ostidagi patologik o'zgarishlarda sezilarli farqlar yo'q edi (yuqori dozali tetrandrin, CsA va CsA bilan birgalikda tetrandrin). Bundan tashqari, CsA bilan davolash qilingan ADRN guruhidagi podotsit PFR yuqori dozali tetrandrin bilan davolash qilingan guruhlardagi bilan bir xil edi.

Munozara

Podotsitlar FSGS va tegishli nefrotik kasalliklarga aralashuvlar uchun maqsad sifatida tobora muhim ahamiyat kasb etmoqda [20, 21]. Bu erda, in vitro va in vivo ma'lumotlarga asoslanib, shunday bo'ldi

selektiv bo'lmagan Ca2 plyus kanal blokeri bo'lgan tetrandrinning podotsitlarni himoya qilish va antiproteinurik ta'siri hujayra ichidagi Ca2 plyus oqimini va Ca2 plyusga bog'liq kalpain-1 signal kaskadini, shu jumladan Talinni-1 inhibe qilish orqali vositachilik qilganligini ko'rsatdi. , nefrin va kalsineurin. Tetrandrin kalpani inhibe qilishdan ko'ra samaraliroq edi.

Oldingi topilmalarga ko'ra, podotsit TRPC6 asosan normal va patologik sharoitlarda Ca2 va oqim o'zgarishiga hissa qo'shadigan kanaldir [7, 22]. Ma'lumki, kalpain faolligi kaltsiy darajasiga bog'liq va u bilan bog'liqbuyrakshikastlanish, ayniqsa buyrak anti-glomerulyar BM shikastlanishi [10, 23]. Aniqlangan 15 kalpain izoformlari orasida kalpain-1 yaqinda TRPC6 faolligini podotsitlar shikastlanishi bilan bog'lashi ko'rsatildi [24]. Kalpain{7}} podotsitlar sitoskeleti bilan bog‘langan Talin-1 oqsilini va podotsitlar yaxlitligini buzuvchi va og‘ir proteinuriyaga olib keladigan yoriq diafragma oqsili, nefrinni parchalashi xabar qilingan [8-12, 16]. Kalsineurin Ca2 plyusga bog'liq fosfataza bo'lib, u avval podotsitlar va hujayralardagi rol o'ynashi isbotlangan.buyrakfunktsiyasi. To'plangan dalillar, kalpainning kalsineurinni proteolitik tarzda parchalashi va faollashtirishi mumkinligini ko'rsatmoqda [25, 26]. Ushbu tadqiqot o'stirilgan podotsitlarda virus infektsiyasi va SD kalamushlarida adriamitsin in'ektsiyasi orqali TRPC6 haddan tashqari ekspressiya modellarini yaratdi. Shunga ko'ra, biz TRPC6-vosita qilgan Ca2 plus oqimi kalpain faolligini va kalpain oilasi a'zosi kalpain-1 ifodasini faollashtirganini ko'rsatdik. Ko'tarilgan kalpain{6}} keyinchalik quyi oqimdagi Talin-1 va nefrinni parchalab tashladi.

Tetrandrine an'anaviy Xitoy tibbiyot zavodidan olingan alkaloid bo'lib, selektiv bo'lmagan Ca2 plyus kanal blokeridir. Bu erda tetrandrin TRPC6 haddan tashqari ekspressiyasini inhibe qilgani va TRPC6 ni haddan tashqari ko'rsatadigan kalamushlarda Ca2 plyus oqimini kamaytirgani tasdiqlandi [16]. Eng muhimi, ushbu tadqiqot tetrandrinning kaltsiyga bog'liq bo'lgan quyi oqim signalizatsiya yo'liga oraliq ta'siriga qaratilgan. CsA dan farqli o'laroq, tetrandrin kaltsiy bilan faollashtirilgan neytral proteaz (kalpain) faolligini pasaytirganligi kuzatildi. Bundan tashqari, tetrandrin kaltsiy bilan faollashtirilgan proteazalar oilasi kalpain-1 ifodasini pasaytirdi va Talin-1 va nefrinning pastga regulyatsiya qilingan ifodasini tikladi. CsA bilan solishtirganda, tetrandrinni qo'llash kalpain inaktivatsiyasiga va kalpainning past tartibga solinishiga yuqori ta'sir ko'rsatdi-1. Bu natijalar tetrandrinning TRPC6-kalpain{13}} signal yoʻlining TRPCga bogʻliq faollashuvini bloklash orqali podotsitlar shikastlanishida terapevtik salohiyatga ega ekanligini koʻrsatdi.

Fosfolipaz C (PLC) TRPC{0}}bog'lovchi hamkori [27] ekanligi aniqlangan. U73122 PLC ni inhibe qiladi, shuning uchun kamroq diatsilgliserin hosil bo'ladi va TRPC6 kanalining ochilishi kamayadi [18, 24]. Shunday qilib, U73122 ijobiy nazorat sifatida parallel ravishda ishlatilgan va u hujayra ichidagi Ca2 ortiqcha oqimini kamaytirishda, kalpain faolligini va TRPC6 ni haddan tashqari ifodalovchi podotsitlarda kalpain{8}} ifodasini kamaytirishda sezilarli ta'sir ko'rsatdi. Biroq, in vitro sitotoksiklik tahlillari aniq podotsit toksikligini ko'rsatdi.

Ushbu tadqiqotda, 12 haftalik ADR in'ektsiyasidan so'ng, ADR bilan davolash qilingan kalamushlarda jiddiy proteinuriya, gipoalbuminemiya va BUN va Scr darajasining oshishi aniqlandi. Yorug'lik mikroskopi ADRN kalamushlarida FSGS, tubulointerstitial fibroz va buyrak oraliq yallig'lanish hujayralari infiltratsiyasini aniqladi. Elektron mikroskopiya oyoq jarayonlarining keng tarqalishini ko'rsatdi. Bundan tashqari, in vivo ma'lumotlar tetrandrin terapiyasi proteinuriyani kamaytirishi, buyrak funktsiyasini yaxshilashi va glomerulosklerozning rivojlanishini susaytirishi mumkinligini ko'rsatdi. Tetrandrin bilan davolashdan so'ng, yorug'lik mikroskopi va elektron mikroskop ostidagi patologik o'zgarishlar, ADRN kalamushlarida 24-h proteinuriya, plazma albumini, Scr va BUN NC guruhidagilarga nisbatan sezilarli darajada yaxshilandi.

Kalsineurin inhibitori CsA uzoq vaqtdan beri proteinuriyani davolash uchun ishlatilganbuyrakkasalliklar [28]. Kalsinevrin CsA immunosupressiv preparatining bevosita nishoni sifatida klinik ahamiyatga ega [17, 29]. CSA kalsineurinning ekspressiyasini pasaytiradi va faollashtirilgan T-hujayralarining kalsineurin vositachiligidagi yadro omilini kamaytiradi [30-32]. So'nggi dalillar CsA ning sinaptopodinning kalsinevrin vositachiligida fosforillanishini blokirovka qilish orqali sinaptopodin kabi podotsit aktin sitoskeletoniga barqarorlashtiruvchi ta'sirini qo'llab-quvvatlaydi [17]. Shuningdek, kalpain kalsinevrinni proteolitik tarzda parchalashi va faollashtirishi mumkinligi isbotlangan [25, 26]. Ushbu tadqiqot ma'lumotlari CsA kalsinevrin faolligini va ekspressiyasini tetrandringa qaraganda kuchliroq inhibe qilganligini yana bir bor tasdiqladi. Avval xabar qilinganidek, CsA calpain faoliyatiga bevosita ta'sir qilmaydi.

Tadqiqotning asosiy cheklovi tetrandrin kichik guruhlari (past dozali, o'rta dozali va yuqori dozali guruhlar) o'rtasida dozaga bog'liq ta'sir ko'rsatmaslik edi. Mumkin bo'lgan tushuntirishlardan biri, biz ishlatgan dozalar oralig'i kalamushlar uchun juda yuqori bo'lishi mumkin. Bundan tashqari, hayvonlar tajribasidagi individual farqlar dozadagi farqlardan ancha katta bo'lishi mumkin. Nisbatan kichik namuna hajmi statistik quvvatni kamaytirishi mumkin. Shu sababli, ARDN kalamushlarida tetrandrinning aniq dozalari diapazoni va ta'sirini aniqlash uchun sezilarli darajada kichikroq dozalar va tegishli namuna hajmini o'z ichiga olgan qo'shimcha tadqiqotlar talab qilinadi.

Xulosa qilib aytganda, kaltsiy signalizatsiya yo'llarini tartibga solishda tetrandrin kalpainga aniq inhibitiv ta'sir ko'rsatdi-1, CsA esa kalsinevrinning inhibisyoniga bevosita ta'sir ko'rsatdi. Ushbu topilmalar tetrandrin va CsA kombinatsiyalangan davolash klinik natijalarni yaxshilash uchun kaltsiy signalizatsiya tarmog'ining bir nechta maqsadlariga ta'sir qilishi mumkinligini ko'rsatadi. Tasdiqlovchi tadqiqotlar ushbu kuzatishlarni tasdiqlash, shuningdek, sinergik ta'sir mexanizmlarini tushuntirish uchun zarur.

Qisqartmalar

FSGS: Fokal segmental glomerulyar skleroz; MCD: Minimal o'zgarish kasalligi; MN: Membranoz nefropatiya; DKD: qandli diabetbuyrakkasallik; TRPC6: Vaqtinchalik retseptor potentsial kation kanali oqsili 6; Ca2 plyus: kaltsiy; TCM: Klassik an'anaviy xitoy tibbiyoti; Tet: Tetrandrine; CsA: siklosporin A; Scr: sarum kreatinin; BUN: qon siydikida azot; PFR: Qayta ishlash tezligi; BM: Bazal membrana; ADRN: Adriamitsin tomonidan qo'zg'atilgan nefropatiya; PLC: Fosfolipaz C.

Referatnces

1. Garg P. Podositlar biologiyasini ko'rib chiqish. Men J Nefrolman. 2018;47(1-ilova):3–13.

2. Khalilpourfarshbaf M, Hajiaghaalipur F, Selvarajan KK va boshqalar. Diabetik nefropatiyada podotsitlarning shikastlanishiga qarshi mezenximal ildiz hujayralariga asoslangan terapiya. Tissue Eng Regen Med. 2017;14:201–10.

3. Nagata M. Podotsit shikastlanishi va uning oqibatlari. Buyrak Int. 2016;89:1221–30.

4. Pavenstädt H, Kriz W, Kretzler M. Glomerulyar podotsitning hujayra biologiyasi. Physiol Rev. 2003;83:253–307.

5. Riehle M, Büscher AK, Gohlke BO va boshqalar. TRPC6 G757D funktsiyani yo'qotish mutatsiyasi FSGS bilan bog'lanadi. J Am Soc Nephrol. 2016;27:2771–83.

6. Ilatovskaya DV, Blass G, Palygin O va boshqalar. Podositlar kaltsiyini tartibga solishda NOX4 / TRPC6 yo'li va diabetik buyrak kasalligida buyrak shikastlanishi. J Am Soc Nephrol. 2018;29:1917–27.

7. Reiser J, Polu KR, Möller CC va boshqalar. TRPC6 buyrakning normal ishlashi uchun zarur bo'lgan glomerulyar yoriq diafragma bilan bog'liq kanaldir. Nat Genet. 2005;37:739–44.

8. Huang H, You Y, Lin X va boshqalar. TRPC6 signal yo'lini inhibe qilish TGF- 1 tomonidan qo'zg'atilgan podotsitlar shikastlanishini engillashtiradi. Hujayra fiziol biokimyosi. 2017;41:163–72.

9. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M va boshqalar. Kaltsiyga bog'liq proteaz Calpain-1 TRPC6 faolligini podotsitlar shikastlanishi bilan bog'laydi. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–109.

10. Peltier J, Bellocq A, Perez J va boshqalar. Kalpain faollashishi va sekretsiyasi eksperimental glomerulonefritda glomerulyar shikastlanishga yordam beradi: kalpastatin-transgen sichqonlarining dalillari. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–23.

11. Tian X, Kim JJ, Monkley SM va boshqalar. Podositlar bilan bog'liq talin1 glomerulyar filtratsiya to'sig'ini saqlash uchun juda muhimdir. J Clin Investig. 2014;124:1098–113.

12. Jiang L, Ding J, Tsai H va boshqalar. Podositlarda vaqtinchalik retseptor potentsial kation kanali 6 ning haddan tashqari ifodalanishi hujayra ichidagi Ca2 plyus va RhoA faollashuvining ko'payishi orqali sitoskeletning qayta tuzilishini keltirib chiqaradi. Exp Biol Med (Maywood). 2011;236:184–93.

13. Liu X, Zhou QG, Zhu XC va boshqalar. Fangji Huangqi tangning potentsial faol komponentlarini "kimyoviy va metabolik profillar o'rtasidagi o'zaro bog'liqlik" ga asoslangan integral metabolomikani qo'llash orqali nefrotik sindromni davolash bo'yicha skrining. Old Farmakol. 2019;10:1261.

14. Liu KC, Lin YJ, Hsiao YT va boshqalar. Tetrandrine endoplazmatik retikulum stressi va Ca2 plus / Kalpain yo'llari orqali inson nazofarengeal karsinoma NPC-TW 039 hujayralarida apoptozni keltirib chiqaradi. Antikanser Res. 2017;37:6107–18.

15. Vang YJ, He LQ, Sun W va boshqalar. Surunkali buyrak kasalligining 3-bosqichini davolashda an'anaviy xitoy tibbiyotining optimallashtirilgan loyihasi: ko'p markazli ikki tomonlama ko'r-ko'rona randomizatsiyalangan nazorat ostida sinov. J Etnofarmakol. 2012;139:757–64.

16. Yu J, Zhu C, Yin J va boshqalar. Tetrandrine RhoA/ROCK1 signalizatsiyasini blokirovka qilish orqali o'tkinchi retseptorlari potentsial Kation Channel oqsili 6 haddan tashqari ifodalangan podotsitlarning shikastlanishini bostiradi. Drug Des Devel Ther. 2020;14:361–70.