Qism Ⅱ Smad3 etishmovchiligi E2F3-bog'liq mexanizm orqali hujayralar proliferatsiyasini rag'batlantirish orqali diabet va diabetik buyrak shikastlanishi uchun orolga asoslangan terapiyani yaxshilaydi.
May 25, 2023
Usullari
1. Hayvonlar
Smad{0}}null (Smad3KO) sichqonlari professor Chuxia Dengning mehribon sovg‘asi bo‘lib, C57BL/6 fonida geterozigotalarda (Smad3 plus /- ) saqlanadi [20]. Smad3KO sichqonlari Smad3 plus /- sichqonlarining kesishishi natijasida yaratilgan. C57BLKS fonida Lepr (Leptin retseptorlari) mutatsiyasiga ega db/db sichqonlari Gonkongdagi Xitoy universiteti (CUHK) Hayvonlar tajriba markazidan sotib olingan. Barcha hayvonlar 12/12 soatlik kun/tun tsiklida oziq-ovqat va suvga bepul kirish imkoniga ega maxsus patogensiz (SPF) muassasada saqlangan. Ushbu tadqiqotda hayvonlarning barcha manipulyatsiyalari CUHK Hayvonlar Tajribalarining Etika Qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan va Ref. Yoʻq. 18-177-MIS.
2. Streptozotsin (STZ) bilan qo'zg'atilgan diabetik sichqoncha modeli
8-10 haftalik yoshdagi C57BL/6 erkak sichqonlariga 5 kun davomida kuniga 50 mg/kg STZ dan qorin bo'shlig'iga yuborilgan. Yakuniy STZ in'ektsiyasidan 5 kun o'tgach, ketma-ket 2 kun davomida barqaror tasodifiy qon glyukozasi 16 mM dan yuqori bo'lgan sichqonlar diabetning muvaffaqiyatli o'rnatilishi deb baholandi va orol transplantatsiyasi uchun qabul qiluvchi sichqonlar sifatida foydalanildi.
3. Orolchani ajratish, transplantatsiya qilish va diabetik fenotipni baholash
Orolchalar Smad3 nokautli (KO) yoki yovvoyi tipdagi (WT) sichqonlardan, avval aytib o'tilganidek, 8-10 hafta yoshida ajratilgan [21]. Orol transplantatsiyasini amalga oshirish uchun, Szot va boshqalar tomonidan tasvirlangan protokolga muvofiq, oxirgi STZ in'ektsiyasidan so'ng 7-kuni 4-hafta yoshida erkak db/db sichqonlarining buyrak kapsulasi ostida bir nechta orolchalar ko'chirilganligi ko'rsatilgan. 22]. Qisqacha aytganda, qabul qiluvchi sichqonchani behushlik Combo (1,5 foiz ketamin va 0, 15 foiz ksilazin, 6 mkl/g tana vazni) bilan behushlik qildi. Ongni yo'qotgandan so'ng, chap buyrakni qoplagan teriga 1 sm lik kesma qilingan. Operatsiya paytida buyrakni muloyimlik bilan tortib oling va uni steril sho'r suv bilan namlang. 25G igna bilan nik hosil qilish uchun kapsulaga kichik tirnalgan qiling. Ko'rsatilgan miqdordagi orolchalar buyrak kapsulasiga PE50 trubkasi orqali yuborilgan. Axir, adacıklar ko'chirildi, past olovda koterizatsiya orqali nikni yopishtiring. Buyrakni almashtiring va qorin pardani tikuv bilan yoping. Terini shtapel bilan mahkamlang. 100 mkl penitsillin-streptomitsin eritmasi (Gibco, cat# 15140122, AQSh) infektsiyani oldini olish uchun qorin bo'shlig'iga yuborildi. Og'riqni yo'qotish uchun 100 mkl Tegmic mushak ichiga yuborildi. Hayvon to'liq tuzalgunga qadar issiq muhitga joylashtirildi. Xuddi shu operatsiya tartibi soxta nazorat sichqonlarida ham amalga oshirildi, ammo orolcha infuzionisiz. Quyruq uchidagi qonning tasodifiy va 6 soatlik ochlikdagi glyukoza darajasi (RBG va FBG) har hafta portativ glyukoza o'lchagich (Roche, ACCU-CHEK® Performa) bilan tekshirildi. Insulin qarshilik testi (IPITT), glyukoza bardoshlik testi (IPGTT), HbA1c darajalari va sarum insulini yuqorida tavsiflanganidek o'lchandi [9].
Olish uchun shu yerni bosingCistanche foyda keltiradi
4. Umumiy siydik oqsili va sarum kreatinin
24 soatlik siydik metabolik qafasda to'plangan. 24 soatlik umumiy siydik oqsili, Quick Start Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, cat# 5000201, AQSH) tomonidan aniqlangan siydik hajmi va siydikdagi oqsil kontsentratsiyasini ko'paytirish yo'li bilan hisoblab chiqilgan. Sarum kreatinin miqdori kreatinin miqdorini aniqlash to'plami bilan aniqlandi (Stanbio Laboratory, cat# 0430-120, AQSH).
5. Gistopatologiya
Buyrakdagi gistopatologik o'zgarishlar paraformaldegid bilan biriktirilgan, kerosin bilan o'rnatilgan bo'limlarda (4 mkm) yuqorida tavsiflanganidek Periodic Acid-Schiff (PAS) reaktivi bilan tekshirildi [23]. Mesangial matritsaning kengayishi yuqorida tavsiflanganidek, miqdoriy tasvir dasturi (Image-Pro Plus 7.0, Media Cybernetics) yordamida baholandi [23].
6. Immunogistokimyo
Orolchalar bo'lgan buyrak yoki oshqozon osti bezi 4 foizli paraformaldegidda mahkamlangan, kerosinga solingan va 4 mkm bo'laklarga bo'lingan. Regidratsiyadan so'ng, bo'limlar 0 da mikroto'lqinli vositali antigen olish bilan ishlov berildi.01 M sitrat (pH 6.0) 10 daqiqa davomida va 5 foiz BSAda 1 soat davomida blokirovka qilindi. . Birlamchi antikor inkübasyonu bir kechada 4 daraja haroratda amalga oshirildi. Floresan bo'yash uchun floresan ikkilamchi antikor xona haroratida (RT) 1 soat davomida qo'llanildi. DAB vositachiligidagi termogenez uchun antigenni olishdan oldin 15 daqiqa davomida 3 foiz H2O2 blokirovkasining qo'shimcha bosqichi kiritilgan. Birlamchi antikor inkubatsiyasidan so'ng, HRP-konjugatsiyalangan polimer (Envision plus System, Dako, AQSh) qo'shildi. E2F3 ni bo'yash uchun EDTA-Tris eritmasida (pH 9,0) antigen olish amalga oshirildi. Immunohistokimyoda ishlatiladigan antikorlar S2-jadvalda batafsil bayon etilgan. Binoni-musbat hudud Image J dasturi (v1.47, NIH, AQSh) yordamida miqdori aniqlandi.
Cistanche ekstrakti
7. Orolchali buyrakda payvandlangan hujayra massasini o'lchash
Orol greftidagi hujayra massasini yarim miqdoriy jihatdan aniqlash uchun har bir bo'limda o'rtacha hujayra maydoni indeksi ishlatilgan. Qisqacha aytganda, orolchali buyrak (parafin o'rnatilgan) sagittal o'qi bo'ylab 4 mkm masofada ketma-ket kesilgan. 160 mkm oraliqda uzluksiz bo'limlar insulin uchun floresan immuno-bo'yalgan. Har bir sichqonchada hujayra maydonini hisoblash uchun insulin-musbat binoni bilan kamida 6 ta bo'lim ishlatilgan. Har bir bo'limdagi insulin-musbat hujayra maydoni Image J dasturi (v1.47, NIH, AQSH) yordamida aniqlangan. Har bir sichqonchadagi bo'limga to'g'ri keladigan o'rtacha hujayra maydoni indeksi umumiy insulin-musbat maydonni insulin-musbat bo'limlar soni bo'yicha barcha bo'limlarga bo'lish yo'li bilan hisoblab chiqilgan.
8. Orolcha hujayralarining birlamchi kulturasi
Izolyatsiya qilingan orolchalar bitta hujayralarga ajratildi va 96-quduq plastinkasiga 200 mL RPMI 1640 (Gibco, AQSH) va 10 foiz FBS (Gibco, AQSh) va 1 foiz penitsillin-streptomitsin (Gibco, AQSh) ekildi. 20 mM glyukoza bilan to'ldiriladi. Orol hujayralari ko'rsatilgan vaqt davomida 37 daraja, 5 foiz CO2 va 100 foiz namlikda o'rnatilgan inkubatorda o'stirildi. E2F3 ning adenovirus vositachiligida nokundalanishi uchun dissotsilangan orol hujayralari sichqonchani E2F3 (shE2F3) maqsad qilib olgan adenovirusni haddan tashqari ifoda etuvchi qisqa soch turmagi RNK (shRNK) o'z ichiga olgan muhitda ekilgan yoki har bir hujayra uchun 10 pfu titrida o'ziga xos bo'lmagan shRNKni (ko'rsatilgan) nazorat qilgan. kundan keyin o'rta almashtirish. shE2F3 dupleksining ildiz ketma-ketligi 5'-CATCCATGCTCTATTCGT-3' edi. 50 ta orolchadan tarqalgan hujayralar immuno-bo'yash va RT-PCR uchun har bir quduqqa, Western blot uchun esa 100 ta orolchaga ekilgan, ular ilgari tasvirlanganidek o'tkazilgan [9].
9. In vivo va in vitro BrdU markalash
In vivo BrdU yorlig'ini amalga oshirish uchun sichqonlar orol transplantatsiyasidan keyingi 2 kundan boshlab 7 kun davomida 50 mg / kg / kun BrdU (PBSda) intraperitoneal AOK qilindi va oxirgi in'ektsiyadan 2 soat o'tgach qurbon qilindi. In vitro BrdU yorlig'i uchun disperslangan orolcha hujayralari 48 soat davomida ekilgan, so'ngra 10 mkM BrdU o'z ichiga olgan yangi muhit bilan almashtirilgan va qo'shimcha 24 soat davomida ekilgan. To'qimalarda va o'stirilgan hujayralarda BrdU ga qarshi lyuminestsent immuno-bo'yoq ilgari tavsiflanganidek amalga oshirildi [9].
Cistanche kukuni
10. RNK-seq
Orollar Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT-db/m va Smad3KO-db/m sichqonlaridan ajratilgan. Har bir genotip uchun 5 dan ortiq sichqonlarning orollari RNK izolyatsiyasi uchun birlashtirildi. RNK miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Germaniya) bilan tayyorlangan. RNK-seq va quyi oqim ma'lumotlar tahlili ilgari tasvirlangan [9]. Berilgan genning ifoda darajasi million xaritalangan o'qish (FPKM) uchun transkriptning kilobazasi uchun fragmentlar sifatida taqdim etilgan. Differensial ravishda ifodalangan gen (DEG) ikki guruh o'rtasidagi FPKM ning 2 baravar farqidan kattaroq yoki unga teng deb ta'riflangan. Yuqori va pastga regulyatsiya qilingan DEGlar birlashtirildi va Gen Ontologiyasi (GO) va Kioto Genlar va Genomlar Ensiklopediyasi (KEGG) yo'llarini boyitish tahlili uchun standart sozlamalar bilan onlayn DAVID bioinformatika resurslari (v6.8) bilan foydalanildi. GO tahlili uchun GOTERM_BP_DIRECT quyi toifasidan foydalanilgan.
11. Immunitetning pasayishi
Sichqoncha orolchalarida immunoprecipitatsiyani amalga oshirish uchun 500 ga yaqin yangi ajratilgan orolchalar 500 ml RIPA buferida lizing qilindi. Quyonga qarshi Smad3 antikori (2 ug) yoki quyon IgG izotipi qo'shildi va yumshoq aylanish bilan 4 daraja kechada inkubatsiya qilindi. Keyin 20 mL protein A agaroz boncuklari (Beyotime, cat# P2051, Xitoy) qo'shildi va 2 soat davomida 4 darajada inkubatsiya qilindi. Yangi RIPA buferi bilan mustahkam yuvilgandan so'ng, chegaralangan oqsil 1xSDS yuklash buferida denaturatsiya qilish yo'li bilan ajralib chiqdi va Western blot tahlilidan o'tkazildi. IgG og'ir zanjirining ta'sirini oldini olish uchun cho'kma Smad3 oqsilini tanib olish uchun engil zanjirga xos sichqoncha quyonlarga qarshi IgG (HRP konjugatsiyalangan, Abmart, cat# M21006, Xitoy) ishlatilgan.
12. Xromatin immunoprecipitatsiyasi-ChIP
Sichqoncha orolchalarida ChIPni amalga oshirish uchun 8-10 haftalik C57BL/6 sichqonlaridan 2000 ga yaqin orolchalar toʻplangan va bitta ChIP preparati sifatida ishlatilgan. Yangi ajratilgan orolchalar 10 ng/ml TGF- 1 (Gibco, AQSh) bilan 15 daqiqa davomida RPMI 1640 plyus 1 foiz FBS va 1 foiz penitsillin-streptomitsin bilan stimulyatsiya qilindi. ChIP SimpleChIP® Plus enzimatik xromatin IP to'plami (CST, AQSh) bilan tavsiya etilgan ko'rsatmalarga muvofiq amalga oshirildi. ChIP tahlilida ishlatiladigan antikorlar va primerlar S1 va S2-jadvallarda batafsil keltirilgan.
Standartlashtirilgan Cistanche
13. Dual-luciferase reporter tahlili
Sichqoncha E2F3 promouteri (-1000 plyus 451 bp) pGL3-asosiy vektoriga (pGL3-E2F3.Pro) klonlandi. Shu bilan birga, pGL3- E2F3.Pro ni yaratish uchun Smad3 ulanish joyining nuqta mutatsiyasi amalga oshirildi. Mut. Dual-lusiferaza reportyor tahlilini amalga oshirish uchun HEK293T xujayralari 24-quduq plastinkasiga 5 x 104 hujayra/quduq zichligida ekilgan. Ertasi kuni hujayralar 500 ng pGL3-Basic yoki pGL3-E2F3.pro yoki pGL3-E2F3.pro.mut bilan pcDNA3 bilan birlashtirildi.1-Smad3, sichqonchani Smad3 ni ortiqcha ifodalaydi yoki yo'q (10F-rasmda ko'rsatilganidek) fosfat kaltsiy usuli bilan. Har bir davolashda transfeksiya dozasini muvozanatlash uchun pEGFP-C1 vektori to'ldirildi. 10 ng pGL4.73.huc/SV40 renilla lusiferaza ifodalovchi vektor transfeksiya samaradorligini normallashtirish uchun har bir davolashga kiritilgan. Transfektsiyadan 6 soat o'tgach, vosita o'zgartirildi, so'ngra qo'shimcha 48 soat davomida inkubatsiya qilindi. Hujayralar parchalandi va lusiferaza faolligi Dual-Luciferase ® Reporter Assay System (Promega, AQSH) bilan aniqlandi va luminometrda (VICTORTM X4 2030 Multilabel Reader, PerkinElmer, AQSh) miqdori aniqlandi. Klonlangan E2F3 promouterining transkripsiyaviy faolligi olovbardosh lusiferaza va renilla lusiferaza qiymat nisbati sifatida taqdim etildi. Har bir davolash uch nusxada amalga oshirildi.
14. Statistika
Ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida taqdim etildi va SPSS dasturi bilan tahlil qilindi (16.0). Ma'lumotlarning normalligi bitta namunali Kolmogorov-Smirnov testi bilan tekshirildi. Guruhlar orasidagi dispersiyalarning bir xilligi Levene statistikasi bilan tekshirildi. Ikki guruh o'rtasida taqqoslash uchun Student's t-testi qo'llanildi. Bir nechta guruhlar o'rtasida taqqoslash uchun, agar teng dispersiya qabul qilingan bo'lsa, LSD testi bilan bir tomonlama ANOVA ishlatilgan. Qabul qilinmagan teng tafovut uchun Welch testining muqobil statistikasi qo'llanildi, keyin Tamhanening T2 testi bilan bir nechta taqqoslashlar o'tkazildi. P < 0.05 statistik jihatdan ahamiyatli deb topildi.
Cistanche qo'shimchalari
Xulosa
Smad3 etishmovchiligi T1DM va T2DM uchun orollarni almashtirish terapiyasini sezilarli darajada yaxshilaydi va diabetik buyrak shikastlanishidan himoya qiladi. Kengaytirilgan E2F{4}}bog'liq hujayra proliferatsiyasi T1DM va T2DMda Smad3KO orolcha terapiyasining asosiy mexanizmi bo'lishi mumkin. Shunday qilib, Smad3KO hujayralarini almashtirish terapiyasi klinik jihatdan diabet uchun yaxshiroq terapevtik strategiya bo'lishi mumkin.
Ma'lumotnomalar
1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Klinik pankreatik orol transplantatsiyasi. Nat Rev Endokrinol. 2017; 13: 268-77.
2. Jeykobson EF, Tzanakakis ES. Qandli diabet terapiyasi uchun inson pluripotent ildiz hujayralarining funktsional pankreatik hujayralariga farqlanishi: innovatsiyalar, muammolar va kelajak yo'nalishlari. J Biol Eng. 2017; 11:21.
3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S va boshqalar. Klinik orolcha transplantatsiyasidan keyin gistologik greftni baholash. Transplantatsiya. 2009; 88: 1286-93.
4. Lan HY. Buyrak fibrozi va yallig'lanishida TGF-beta / Smadlarning turli rollari. Int J Biol Sci. 2011; 7: 1056-67.
5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. Buyrak fibrozida TGF-beta/Smad signalizatsiyasi. Old fiziol. 2015; 6: 82.
6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K va boshqalar. Smad signalizatsiya tarmog'i orol hujayralarining ko'payishini tartibga soladi. Qandli diabet. 2014; 63: 224-36.
7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. TGF-beta signalizatsiyasini inhibe qilish inson pankreatik beta-hujayra replikatsiyasini rag'batlantiradi. Qandli diabet. 2016; 65: 1208-18.
8. Vang P, Karakose E, Liu X, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanic V va boshqalar. DYRK1A, SMAD va Trithorax yo'llarining birgalikda inhibisyonu kattalar inson beta hujayralarida mustahkam replikatsiyani qo'zg'atish uchun sinergizatsiya qiladi. Hujayra Metab. 2019; 29: 638-52 e5.
9. Sheng JY, Vang L, Tang PM-K, Vang HL, Li JC, Xu BH va boshqalar. Smad3 etishmovchiligi Pax6 ifodasini tiklash orqali db/db sichqonlarda beta-hujayralarning ko'payishi va funktsiyasini rag'batlantiradi. Teranostika. 2021; 11: 2845-59.
10. Zmuda EJ, Pauell CA, Hai T. Sichqoncha orolini izolyatsiya qilish va subkapsulyar buyrak transplantatsiyasi usuli. J Vis Exp. 2011 yil.
11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH va boshqalar. Orol izograft transplantatsiyasi 2-toifa diabetning sichqon modelida insulin sezgirligini yaxshilaydi. Endokrin. 2021; 72: 660-71.
12. Vijayachandra K, Xiggins V, Li J, Glik A. TGFbeta1 tomonidan p16ink4a va p19ARF induksiyasi sichqon keratinotsitlarida o'sishni to'xtatish va qarish reaktsiyasiga yordam beradi. Mol karsinog. 2009; 48: 181-6.
13. Dyer MA, Cepko CL. Retinaning rivojlanishida proliferatsiyani tartibga solish. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 333-42.
14. Dyson N. pRB-oila oqsillari tomonidan E2F ni tartibga solish. Genes Dev. 1998 yil; 12: 2245-62.
15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J va boshqalar. TGFbeta retseptorlari signalizatsiyasining vaqtincha bostirilishi inson orollarini transplantatsiyasini osonlashtiradi. Endokrinologiya. 2016; 157: 1348-56.
16. Nomura M, Zhu HL, Vang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. Sichqonchaning pankreatik beta hujayralarida SMAD2 buzilishi ATP sezgir K plyus kanal faolligining susayishi tufayli orol giperplaziyasi va insulin sekretsiyasining buzilishiga olib keladi. Qandli diabet. 2014; 57: 157-66.
17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Vang Q, Vang Y, Salmon P va boshqalar. E2F3 ning haddan tashqari ko'payishi apoptozni qo'zg'atmasdan, insonning funktsional beta hujayralarining ko'payishiga yordam beradi. Hujayra aylanishi. 2013 yil; 12: 2691-702.
18. Chjan Y, Aleksandr PB, Vang XF. Hujayra proliferatsiyasi va omon qolishini nazorat qilishda TGF-beta oilasining signalizatsiyasi. Sovuq bahor Harb Perspect Biol. 2017; 9.
19. Vang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Skott DK, Garsiya-Ocana A, Styuart AF. Qandli diabet--odamning beta-hujayralari ko'payishidagi yutuqlar va muammolar. Nat Rev Endokrinol. 2015; 11: 201-12.
20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H va boshqalar. SMAD3 ning maqsadli buzilishi shilliq qavatning immunitetini buzadi va T-hujayralarining TGF-beta-ga sezgirligini kamaytiradi. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.
21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Sichqoncha oshqozon osti bezidan orollarni ajratish protokoli. Nat Protoc. 2009; 4: 1649-52.
22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Me'da osti bezi orollarini diabetik sichqonlarning buyrak kapsulasiga ko'chirib o'tkazish. J Vis Exp. 2007: 404.
23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Vang Q va boshqalar. Smad3 ni yo'q qilish 2-toifa diabetik nefropatiyada buyrak fibrozi va yallig'lanishining oldini oladi. Metabolizm. 2020; 103: 154013.
Hong-Lian Vang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Vang1, Rui-Chi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 va Hui-Yao Lan2,7
1 Integratsiyalashgan tibbiyot tadqiqot markazi va nefrologiya bo'limi, Janubi-g'arbiy tibbiyot universitetining an'anaviy xitoy tibbiyoti kasalxonasi, Luzhou, Sichuan, 646000, Xitoy.
2. Tibbiyot va terapevtika bo'limi va Li Ka Shing Sog'liqni saqlash fanlari instituti, Gonkong Xitoy universiteti, Gonkong, 999077, Xitoy.
3. Guangdong-Gongkong immunologik va genetik buyrak kasalliklari bo'yicha qo'shma laboratoriyasi, Guangdong provintsiyasi xalq kasalxonasi, Guangdong tibbiyot fanlari akademiyasi, Guangzhou, Guangdong, 510080, Xitoy.
4. Davlat asosiy bioelektronika laboratoriyasi, Jiangsu asosiy biomateriallar va qurilmalar laboratoriyasi, Biologiya fanlari va tibbiyot muhandisligi maktabi, Janubi-sharqiy universiteti, Nankin, Xitoy.
5. Zhanjiang shahri surunkali buyrak kasalliklarining oldini olish va boshqarish bo'yicha asosiy laboratoriya, Nefrologiya instituti, Guangdong tibbiyot universiteti filiali kasalxonasi, Zhanjiang, Guangdong, 524001, Xitoy.
6. Milliy an'anaviy xitoy tibbiyoti klinik tadqiqot bazasi, Janubi-g'arbiy tibbiyot universitetiga qarashli an'anaviy xitoy tibbiyoti kasalxonasi, Luzhou, Sichuan, 646000, Xitoy.
7. CUHK-Guangdong provintsiyasi xalq kasalxonasi immunologik va genetik buyrak kasalliklari bo'yicha qo'shma tadqiqot laboratoriyasi, Gonkongdagi Xitoy universiteti, Gonkong, 999077, Xitoy.
