Qism Ⅰ Smad3 etishmovchiligi E2F3-bog'liq mexanizm orqali hujayralar proliferatsiyasini rag'batlantirish orqali diabet va diabetik buyrak shikastlanishi uchun orolga asoslangan terapiyani yaxshilaydi.
May 25, 2023
Abstrakt
1. Mantiqiy asos
Hujayralarning yomon ko'payishi diabet bilan og'rigan bemorlarda orol hujayralarini almashtirish terapiyasiga to'sqinlik qiluvchi zararli omillardan biridir. Smad3 TGF-signalizatsiyasining muhim transkripsiya omili bo'lib, hujayra proliferatsiyasini inhibe qilish orqali diabetga yordam berishi ko'rsatilgan. Shuning uchun biz Smad{2}}defitsit orolchalari qandli diabet uchun yangi hujayra o'rnini bosuvchi terapiya bo'lishi mumkin, deb taxmin qilamiz.
2. Usullar
Biz ushbu gipotezani streptozotsin bilan bog'liq -1 diabetik sichqonlar va -2 diabetik db/db sichqonlarida navbati bilan Smad3 nokaut (KO) va yovvoyi tipdagi (WT) orolchalarini buyrak kapsulasi ostida ko'chirib o'tkazish orqali tekshirdik. Smad3KO va WT orollarini almashtirish terapiyasining diabet va diabetik buyrak shikastlanishiga ta'siri o'rganildi. Bundan tashqari, Smad3KO-db/db Smad3WT-db/db sichqoncha orolchalariga nisbatan Smad{7}}regulyatsiya qilingan hujayra proliferatsiyasi asosida yotuvchi quyi oqim maqsadli genini aniqlash uchun RNK-seq qo'llanildi.
3. Natijalar
Smad3WT orolchalari bilan davolash bilan solishtirganda, Smad3KO orolchalari bilan davolash qon zardobidagi glyukoza va HbA1c darajasini sezilarli darajada pasaytirish va diabetik buyrak shikastlanishlaridan himoya qilish orqali -1 va -2 turdagi diabetga nisbatan ancha yaxshi terapevtik ta'sir ko'rsatdi. qon zardobida kreatininning ko'payishi va proteinuriya, mezangial matritsaning kengayishi va fibrozning rivojlanishi. Bular payvandlangan hujayralar ko'payishi va qondagi insulin darajasining sezilarli darajada oshishi bilan bog'liq edi, natijada glyukoza intoleransi yaxshilandi. Mexanik jihatdan, RNK-seq Smad3WT-db/db sichqoncha orollari bilan solishtirganda, Smad3-ni db/db sichqoncha orolchalaridan o'chirish G1/S hujayra siklining asosiy regulyatori bo'lgan E2F3 ni sezilarli darajada oshirganligini aniqladi. Keyingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Smad3 E2F3 promotori bilan bog'lanishi va shu tariqa E2F{16}}bog'liq mexanizm orqali hujayra proliferatsiyasini inhibe qilishi mumkin, chunki E2F3 ovozini o'chirish Smad3KO hujayralariga proliferativ ta'sirni bekor qilgan.
4. Xulosa
Smad{0}}yetishmagan orollarni almashtirish terapiyasi-1 va turi-2 qandli diabetni sezilarli darajada yaxshilashi va E2F3-ga bog'liq bo'lgan yangi mexanizm vositachiligida diabetik buyrak shikastlanishidan himoya qilishi mumkin. hujayra proliferatsiyasi.
Kalit so'zlar
Smad3, adacık transplantatsiyasi, diabet, E2F3, hujayra aylanishi.
Olish uchun shu yerni bosingCistanche foydalari
Kirish
-1 turi va 2 qandli diabet (T1DM va T2DM). hujayra yoki orol transplantatsiyasi jozibador terapiya bo'lib, T1DMli bemorlarda muvaffaqiyatli qo'llaniladi. Transplantatsiya uchun ishlatiladigan orolchalar yoki hujayralar odatda kadavra donoridan yoki induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralaridan (iPSC) [1, 2]. T1DM bilan og'rigan bemorlarda 1500 dan ortiq klinik orolcha transplantatsiyasi holatlari yaxshi tasdiqlangan Edmonton protokoliga muvofiq yakunlandi [1]. Bemorlarning taxminan 50 foizi transplantatsiya qilinganidan keyin 5 yil davomida insulin mustaqilligini saqlab qolishsa-da, klinik jihatdan engraftment etishmovchiligi keng tarqalgan muammo hisoblanadi. Orolcha transplantatsiyasiga to'sqinlik qiluvchi omillardan biri bu payvandlangan orolcha hujayralarining juda past proliferativ tezligidir [3]. Bundan tashqari, yallig'lanish, immun allogreftni rad etish va metabolik stress kabi greft mikromuhitidan kelib chiqadigan xavfli stimullar transplantatsiya qilingan hujayralarni apoptoz va nekrozga olib kelishi mumkin, bu esa progressiv greft yo'qolishiga olib kelishi mumkin [1]. Shuning uchun transplantatsiya qilingan hujayralar ko'payishini yaxshilash diabet uchun orol transplantatsiyasiga asoslangan davolashning muvaffaqiyati uchun muhim ahamiyatga ega.
O'sish omili-beta (TGF-) signalini o'zgartirish ko'plab biologik jarayonlarda pleiotrop rol o'ynaydi. Signalning uzatilishi TGF-ligandning 2-toifa TGFBR2 retseptorlari bilan bog'lanishi bilan boshlanadi. Ikkinchisi 1-turdagi TGFBR1 retseptorlarini fosforlanish orqali ishga oladi va faollashtiradi. Faollashtirilgan TGFBR1 retseptorlari tomonidan boshqariladigan Smad oqsillarini (R-Smads), Smad2 va Smad3 ni qo'shimcha fosforlaydi. R-Smadlar Smad4 bilan kompleks hosil qiladi, u maqsadli genlarni transkripsiyaviy tartibga solish uchun yadroga o'tadi [4, 5]. Xabar qilinishicha, oshqozon osti bezi orolchasi universal faollashtirilgan TGF signalizatsiyasini saqlab turadi, chunki fiziologik sharoitda fosforlangan Smad2/3 ning nisbatan yuqori darajasi aniqlangan. Biroq, insulinga bo'lgan talabga javoban, hujayra proliferatsiyasining kuchayishi bilan birga TGF-signalizatsiya faolligi pasayadi [6]. Bundan tashqari, TGF-signalizatsiyasining farmakologik inhibisyoni in vitro va in vivo [7, 8] hujayra proliferatsiyasiga yordam beradi. Eng muhimi shundaki, Smad3 ning yo'q qilinishi qisman pankreatektomiya qilingan sichqonlarda Smad2 ning yo'q qilinishi bilan solishtirganda kuchliroq hujayra proliferatsiyasiga olib keladi, bu Smad3 emas, balki Smad2 emas, balki hujayra proliferatsiyasini tartibga solish uchun TGF signalining quyi oqimidagi asosiy effektor ekanligini ko'rsatadi [6]. Keyinchalik tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, Smad3 siklinga bog'liq kinaz inhibitörleri (CDKIs), jumladan p16, p21 va p57 [7, 8] ifodasini qo'zg'atish orqali hujayra proliferatsiyasini bostiradi.
Bizning yaqinda qilgan ishimiz, shuningdek, db / db sichqonlarida Smad3 ni yo'q qilish (Smad3KO-db / db) semizlik, giperglikemiya, insulin qarshiligi va glyukoza intoleransisiz ochiq diabetning boshlanishini oldini olishini aniqladi. Qizig'i shundaki, Smad3KO-db/db sichqonlari hujayra proliferatsiyasining sezilarli darajada ortishi va doimiy giperinsulinemiya bilan orolcha giperplaziyasini ko'rsatadi [9]. Bu shuni anglatadiki, Smad3 qandli diabetda patogendir va hujayralardagi Smad3 ni maqsad qilib qo'yish diabet uchun yangi hujayra yoki orollarni almashtirish terapiyasini ko'rsatishi mumkin. Bu ushbu tadqiqotda Smad3 nokautli (Smad3KO) orolcha transplantatsiyasi yordamida streptozotsin (STZ) qo'zg'atuvchi -1 diabetik sichqonlarda va -2 diabetik DB/DB tipidagi sichqonlarda tekshirildi.
Cistanche qo'shimchalari
Natijalar
1. Smad3KO orolchalarini transplantatsiyasi STZ bilan qo'zg'atilgan -1 qandli diabetga yaxshi terapevtik ta'sir ko'rsatdi.
Qandli diabetda Smad3KO va Smad3WT orolchasining terapevtik samaradorligini solishtirish uchun biz birinchi navbatda STZ-induktsiyali diabetik sichqonlarning buyrak kapsulasi ostida singenik orol transplantatsiyasini amalga oshirdik, bu erda giperglikemiya hujayra etishmovchiligidan kelib chiqadi. STZ in'ektsiyasidan keyin 7-kuni diabetli sichqonlarga Smad3WT yoki Smad3KO sichqonlaridan yangi ajratilgan 3 dozali orolchalar (sichqoncha uchun 50, 100 va 200 orolcha) ko'chirildi. Tasodifiy qon glyukoza (RBG) va och qoringa glyukoza (FBG) darajasi har hafta 16 hafta davomida kuzatildi. Transplantatsiya dozalari 300 ta orolchaning transplantatsiyasi hujayrasi yo'q bo'lgan sichqonlarda evglikemiyani tezda tiklash uchun etarli ekanligi haqidagi oldingi topilmalar asosida tanlangan [10]. Shakl 1A dan D gacha ko'rsatilgandek, qandli diabetga chalingan sichqonlarda 16 hafta davomida doimiy giperglikemiya rivojlandi. Smad3KO yoki WT orollarining past dozasi (50 ta orolcha) bilan transplantatsiya RBG va FBG darajasini pasaytira olmadi. Biroq, 100 Smad3KO orolchasini olgan diabetik sichqonlar, lekin Smad3WT orolchalarining bir xil dozasi emas, 200 Smad3KO yoki WT orolchalarini olganlarga o'xshash oddiy RBG va FBG ni asta-sekin tikladi. Shuningdek, biz qon glyukozasini pasaytiruvchi ta'sir faqat transplantatsiya qilingan orolchalarga bog'liqligini aniqladik, chunki 16-haftadan boshlab orolchali buyrak olib tashlanganidan keyin giperglikemiya darhol qaytalandi (o'q, 1A-rasm).
Qandli diabetga chalingan sichqonlarda glyukoza bardoshliligining buzilishi ham rivojlandi, bu Smad3KO yoki WT orolchalarining yuqori dozasini (200) va 100 Smad3KO orolchalarini ko'chirib o'tkazish orqali sezilarli darajada engillashdi, lekin 50 Smad3KO yoki WT orolchalari va 100 ta past dozada emas. Smad3WT orolchalari (1E va G-rasm). Kutilganidek, STZ bilan kasallangan diabetik sichqonlarda insulin qarshiligi rivojlanmagan.
Aksincha, insulinga uzoq muddatli javob giperglikemik sichqonlarda soxta operatsiya yoki 50 Smad3WT yoki KO orolchalari va 100 Smad3WT orolchalari bilan samarasiz terapiya bilan kuzatildi (1F va H-rasm). Qayta tiklangan evglikemiya va yaxshilangan glyukoza intoleransiyasiga muvofiq, diabetik sichqonlarga 200 Smad3KO yoki WT orolchalari va 100 Smad3KO orolchalari berildi, ammo 50 Smad3KO yoki WT orolchalari va 100 Smad3WT orolchalari qondagi HbA1C darajasining accompa insulin darajasining oshishi bilan kamayganligini ko'rsatdi. va J). Bundan tashqari, STZ tomonidan qo'zg'atilgan diabet o'sishning kechikishiga olib keldi, bu 200 Smad3KO yoki WT orolchalari va 100 Smad3KO orolchalari bilan transplantatsiya qilingan sichqonlarda qisman tiklandi (S1-rasm). Bundan tashqari, STZ bilan qo'zg'atilgan diabetik sichqonlarda 16 xaftada diabetik nefropatiya ham rivojlandi, bu mezangial kengayish, interstitsial fibroz, proteinuriya va qon zardobida kreatininning ortishi bilan namoyon bo'ldi (2-rasm). Ajablanarlisi shundaki, 100 Smad3KO orolchalari bilan davolash, lekin 100 Smad3WT orolchalari bilan davolash diabetik buyrak kasalligi rivojlanishidan himoyaga olib keldi, garchi bu 200 Smad3KO yoki WT orolchalarining yuqori dozasi bilan davolash qilingan diabetik sichqonlarda ham sezilarli edi (2-rasm). Ushbu topilmalar Smad3KO orolchalarining STZ bilan bog'liq diabetga nisbatan yaxshiroq terapevtik samaradorligini ko'rsatadi va Smad etishmayotgan orolchalarni almashtirish terapiyasini qo'llash orqali glisemik nazoratni va diabetik buyrak shikastlanishidan himoya qilish uchun zarur bo'lgan orolchalarni taxminan 50 foizga kamaytirishni taklif qiladi. qandli diabet.
2. Smad3KO orolcha transplantatsiyasi db/db sichqonlarda -2 turdagi diabetga yaxshi terapevtik ta'sir ko'rsatdi.
Ma'lum qilinishicha, orolcha transplantatsiyasi STZ ning past dozasi bilan ta'minlangan yuqori yog'li dietali sichqoncha modelida T2DM ni yaxshilaydi [11]. Keyinchalik biz Smad3KO orolchalarini transplantatsiya qilish T2DMga yaxshi terapevtik ta'sir ko'rsatadimi yoki yo'qligini tekshirdik. Db/db sichqonlarini 250 Smad3KO yoki WT orolchalari bilan diabetdan oldingi 4-haftadan 12-haftagacha davolash orqali. Biz Smad3KO yoki WT bilan transplantatsiya qilishni aniqladik. orolchalar qabul qiluvchi db/db sichqonlarning o'sishiga ta'sir qilmadi (S2-rasm). Smad3WT orolchalari transplantatsiyasini olgan db/db sichqonlari soxtalashtirilgan db/db sichqonlari bilan solishtirganda RBG va FBG ning pasayishi tendentsiyasini ko'rsatgan bo'lsa-da, Smad3KO orolchalarining ekvivalent dozasi bilan transplantatsiya qilingan db/db sichqonlarida RBG va FBG sezilarli darajada pasaygan (rasm). 3A va B). Db/db sichqonlarida rivojlangan glyukoza intoleransi Smad3KO tomonidan sezilarli darajada yaxshilandi, ammo Smad3WT orolcha transplantatsiyasi emas, garchi insulin qarshiligi o'zgarmagan bo'lsa ham (3C-F-rasm). Smad3WT orolcha transplantatsiyasi yoki soxta operatsiya bilan solishtirganda, Smad3KO orol transplantatsiyasi bilan davolangan db/db sichqonlari ham qondagi HbA1c darajasining sezilarli darajada pasayishini ko'rsatdi, bu esa qondagi insulin darajasining sezilarli o'sishi bilan birga keldi (3G va H-rasm). Bundan tashqari, 250 Smad3KO orolchalari bilan davolash glomerulyar mezangial kengayishni sezilarli darajada susaytirdi (4-rasm). Biroq, 12 xaftalik yoshida db/db sichqonlarda qon zardobida kreatinin, proteinuriya va buyrak fibrozida sezilarli o'zgarishlar kuzatilmaganligi sababli, Smad3KO yoki WT orolchalari bilan davolash qilingan db/db sichqonlarida bu parametrlarda aniq o'zgarishlar aniqlanmadi (rasm). 4). Birgalikda bu ma'lumotlar yana Smad3KO orolchalarini transplantatsiya qilish -2 diabetik DB/DB sichqonlarida Smad3WT orolchalariga nisbatan yaxshiroq davolashni ta'minlaydi.
3. Smad3 etishmovchiligi STZ bilan kasallangan diabetik sichqonlarda ham, db / db sichqonlarida ham payvandlangan orolchalarda hujayra ko'payishiga yordam beradi.
Keyinchalik biz Smad3KO orolchalarining transplantatsiyasi T1DM va T2DM ga yaxshi terapevtik ta'sir ko'rsatadigan potentsial mexanizmlarni o'rganib chiqdik. Biz birinchi navbatda payvandlangan orolchalardagi hujayra massasini insulin bilan immuno-bo'yash orqali tekshirdik. STZ bilan bog'liq diabetda biz transplantatsiya qilinganidan keyin 16-haftada 50 Smad3KO yoki WT orolchalari bilan o'yilgan sichqonlarda buyrak kapsulasi ostida insulin-musbat hujayralar mavjudligini aniqlay olmadik, bu hujayralarning yo'qolishini ko'rsatadi. Kutilmaganda, 100 Smad3WT orolchasini olgan diabetik sichqonlarda faqat bir nechta dispers insulin ishlab chiqaruvchi hujayra klasterlari ko'rsatilgan, ammo bu ko'rsatkich 100 Smad3KO orolchalari bilan davolash qilingan diabetik sichqonlarda sezilarli darajada oshgan, natijada hujayra massasi deyarli 17- barobar oshgan (1-rasm). 5A va B). Qizig'i shundaki, 200 Smad3KO yoki WT orollarining yuqori dozasi berilgan diabetik sichqonlar xuddi shunday hujayra massasini ko'rsatdi (5A va B rasmlari). Ushbu topilmalar 1A va B rasmlarida ko'rsatilganidek, orol transplantatsiyasining giperglikemiyaga dozaga bog'liq ta'siriga mos keldi.
Keyinchalik biz Smad3KO orolcha greftidagi hujayra massasining ortishi hujayra proliferatsiyasining kuchayishi bilan bog'liqligini tekshirdik. Ikki rangli immunofluoressensiya shuni ko'rsatdiki, orolcha transplantatsiyasidan keyingi 16-haftada 100 Smad3WT orolchalari bilan davolangan sichqonlar aniqlanmaydigan yoki kam uchraydigan PCNA va insulin plyus hujayralarini ko'rsatdi, bu birinchi navbatda 100 Smad3KO orolchalari yoki 200 Smad3KO yoki WT yuqori dozasini olganlarda ko'paygan. orolchalar (5C va D-rasm). Keyinchalik, qon glyukoza darajasi yuqori bo'lganida, orol transplantatsiyasidan keyingi 7-kuni BrdU yorlig'i bilan progressiv diabetik sharoitlarda Smad3 payvandlangan orollarda erta hujayra proliferatsiyasini nazorat qiladimi yoki yo'qligini tekshirdik. BrdU yorlig‘i Smad3WT orolcha greftlarining bir xil dozasi bilan solishtirganda 100 Smad3KO orolcha greftida BrdU plyus insulin plyus hujayralarning 3- barobar ortganini aniqladi (5E va F-rasm). Ushbu topilma shuni ko'rsatadiki, Smad3 etishmovchiligi giperglikemik sharoitlarda S-fazali hujayra sikli orqali hujayralar ko'payishiga yordam beradi va bu orol transplantatsiyasidan keyingi 16-haftada ko'rinib turganidek, hujayra massasining 17- barobar oshishiga yordam beradi (5A va B-rasm). . Birgalikda bu topilmalar shuni ko'rsatadiki, Smad3 etishmovchiligi ko'p jihatdan hujayralar ko'payishiga yordam beradi va shu bilan STZ tomonidan qo'zg'atilgan -1 qandli diabetda evglikemiyani tiklaydi.
Xuddi shunday, yuqori hujayrali proliferativ faollik Smad3KO adacık greftlarida ham aniqlandi -2 diabetik DB/db sichqonlarda Smad3WT orolcha greftlari bilan solishtirganda hujayra massasining 5- barobar ortishi bilan ko'rsatilgan. orolcha transplantatsiyasidan keyingi 12-hafta yoshi (6A va B-rasm), bu insulin va PCNA plyus hujayralarining 2.5- barobar ortishi bilan bog'liq edi (6C va D-rasm). BrdU-yorliqlash yordamida biz, shuningdek, 3-haftalik db/db sichqonlarda transplantatsiyadan keyingi 7-kuni Smad3KO orolcha greftlarida insulin va BrdU plyus hujayralarining 3- barobar ortganini aniqladik (6E-rasm va F). Ushbu topilma yana bir bor tasdiqlaydiki, Smad3 yo'q hujayralar giperglikemiyaga chidamli va T2DMni yaxshilash uchun hujayra massasini saqlab qolish uchun yuqori proliferativ bo'lib qoladi.
4. Smad3 etishmovchiligi in vitroda hujayra proliferatsiyasiga yordam beradi
TGFBR1 ning farmakologik inhibisyoni hujayra proliferatsiyasini in vitro [7, 8] rag'batlantirishi haqida xabar berilgan. Shuning uchun biz Smad3 ning genetik yo'q qilinishi Smad3KO va WT orol hujayralarini o'stirish orqali hujayra ko'payishiga yordam beradimi yoki yo'qligini tekshirdik, keyin BrdU yorlig'i. Ikki marta immunofluoressensiya shuni ko'rsatdiki, Smad3 bo'lmagan orol hujayralari Smad3WT orol hujayralariga (2,4 foiz) nisbatan BrdU-musbat hujayralar (5,7 foiz) sezilarli darajada yuqori bo'lgan (7A va B-rasm). Smad3KO hujayralarining kengaygan proliferatsiyasi, shuningdek, Smad3 ning hujayra proliferatsiyasidagi asosiy tartibga soluvchi rolini tasdiqlovchi Western blot tahlili (7C-rasm) tomonidan aniqlangan PCNA ning ko'payishi bilan namoyon bo'ldi.
5. RNK-seq E2F3 ni hujayra proliferatsiyasini tartibga soluvchi Smad3 maqsadli gen sifatida aniqlaydi.
Hujayra proliferatsiyasini tartibga solishda Smad3 ning quyi oqim mexanizmini ochish uchun biz db/m yoki db/db sichqonlardan ajratilgan orolchalarda Smad3 genini o'chirgan yoki o'chirmasdan RNK-seq o'tkazdik, shu jumladan Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT -db/m, va Smad3KO-db/m sichqonchalari ilgari tasvirlanganidek [9]. Yo'lni boyitish tahlili db/m yoki db/db fonida Smad3WT va Smad3KO orolchalari orasidagi differentsial ifodalangan genlar (DEG) o'rtasida o'tkazildi. Db/db ning genetik fonida Smad3KO GO va KEGG tahlillari natijasida aniqlangan hujayra sikli bilan bog'liq genlar yoki yo'llarda sezilarli o'zgarishlarga olib keldi (8A-rasm va S3-rasm). Individual genlarni hisobga olgan holda, RNK-seq tahlili Smad3WT-db bilan solishtirganda Smad3KO-db/db orolchalarida siklin, siklinga bog'liq kinazlar (CDK) va hujayra bo'linish sikli (CDC) oqsillari oilasini o'z ichiga olgan genlar ekspressiyasining o'sishini aniqladi. /db orolchalari, ular RT-PCR orqali madaniyatli Smad3KO orolcha hujayralarida qo'shimcha tasdiqlandi (rasm S4 A va C). Bundan farqli o'laroq, db / m ning genetik fonida Smad3KO hujayra sikli bilan bog'liq genlar yoki yo'llarga sezilarli ta'sir ko'rsatmadi (rasm S3B va C). Ma'lum qilinishicha, TGF-/Smad3 signalizatsiyasi siklinga bog'liq kinaz inhibitör genlarini (CDKI) qo'zg'atish orqali hujayra siklini salbiy tartibga soladi [7, 8, 12]. Ajablanarlisi shundaki, ushbu CDKI genlarining hech biri in vivo jonli ravishda Smad3KO-db/db orolchalarida va mos ravishda RNK-seq va RT-PCR tomonidan aniqlangan madaniyatli Smad3KO orolcha hujayralarida bostirilmagan (S4B va C-rasm). Bundan farqli o'laroq, p16, p18 va p57 kabi bir nechta CDKI genlarining ifoda darajalari hatto madaniyatli Smad3KO orolcha hujayralarida ham ko'tarilgan (S4C-rasm). Bu Smad{47}}boshqariladigan hujayra proliferatsiyasida muqobil mexanizm mavjudligini anglatadi.
Shunday qilib, biz ECR brauzer dasturi yordamida hujayra siklining GO davridagi 224 DEG promotorlar ketma-ketligi uchun Smad3 bog'lanish potentsialini tahlil qildik (8A-rasm). Ular orasida E2F3 nomli gen bizning e'tiborimizni tortdi, chunki u hujayra siklining G1/S kirishini tartibga soluvchi kalit va terminal ijrochi hisoblanadi [13, 14]. Biz sichqonchaning E2F3 lokusu promouterida potentsial Smad3 bog'lanish joyini topdik, u odamlarda ham saqlanib qoladi (8B-rasm).
Sitstanche tubulosa
E2F3 Smad{2}}boshqariladigan hujayralar proliferatsiyasi uchun zarurmi yoki yo'qligini o'rganish uchun biz orolchalardagi E2F3 va Smad3 o'rtasidagi bog'liqlikni ko'rib chiqdik. RNK-seqga muvofiq, immunohistokimyo E2F3 ifodasi Smad3WT-db/db sichqoncha orolchalarida sezilarli darajada kamayganligini, lekin Smad3KO-db/db sichqonlarida sezilarli darajada oshganini aniqladi (8C-rasm). Bundan tashqari, RNK va oqsil darajasida madaniyatli Smad3KO orolcha hujayralarida E2F3 ifodasining ortishi kuzatildi (8-rasm DF). Bundan farqli o'laroq, E2F3 ning adenovirus vositachiligidagi sukunati hujayralarning proliferativ faolligini (insulin) bekor qildi.ortiqchaBrdUortiqcha) Smad3KO orolcha hujayralarida (9-rasm), E2F3 ning Smad{4}}boshqariladigan hujayra proliferatsiyasida muhim rolini ochib beradi.
Smad3 ning E2F3 promouterida prognoz qilingan bog'lanishini yanada tasdiqlash uchun biz sichqonchaning ajratilgan orolchalarida xromatin immunoprecipitatsiyasini (ChIP) amalga oshirdik (10A-rasm). ChIP uchun ishlatiladigan Smad3 antikorining o'ziga xosligi dastlab sichqoncha orolchalarida immunoprecipitatsiya bilan tasdiqlangan (10B-rasm). ChIP PCR Smad3 ning E2F3 promotoriga anti-Smad3 antikori sifatida ulanishini tasdiqladi, ammo hech qanday o'ziga xos bo'lmagan IgG izotipi E2F3 promotoriga mos keladigan xromatin fragmentini muvaffaqiyatli cho'ktirmadi (10C-rasm). Miqdoriy RT-PCR IgG izotipi bilan solishtirganda Smad3 antikori bilan ChIP tahlilida E2F3 promotorlar ketma-ketligini 6-katta boyitishini aniqladi (10D-rasm), bu Smad3 E2F3 genomik lokusuning promotor hududiga bog'lanishi mumkinligini ko'rsatdi. .
E2F3 promouterida Smad3 ulanishining funktsional ahamiyatini tasdiqlash uchun biz Smad3 bog'lanish joyini yoki uning mutant shaklini o'z ichiga olgan sichqoncha E2F3 promouteri tomonidan boshqariladigan lusiferaza reportyor vektorini yaratdik (10E-rasm). HEK293T hujayralarida ikki tomonlama lusiferaza tahlili klonlangan E2F3 promouteri tomonidan boshqariladigan lyusiferaza kuchli transkripsiyasini aniqladi, bu Smad3ni haddan tashqari ifodalash orqali sezilarli darajada inhibe qilingan. Biroq, Smad3 bog'lanish joyining mutatsiyasi Smad3 ning inhibitiv ta'sirini bekor qildi (10F-rasm). Ushbu topilmalar Smad3 ning E2F3 transkripsiyasida uning promouteriga bog'lanish orqali bostiruvchi rolini to'g'ridan-to'g'ri isbotladi.
Ushbu tadqiqotda biz Smad{0}}defitsit orolchalarini transplantatsiya qilish STZ bilan kasallangan diabetik sichqonlar va db/db sichqonlarda diabet va diabetik buyrak shikastlanishiga yaxshi terapevtik ta'sir ko'rsatishini ko'rsatdik. STZ bilan bog'liq diabetda 100 Smad3KO emas, balki 100 Smad3WT orolchalarini transplantatsiya qilish hujayra massasining 17- barobar ortishiga olib keldi, bu qondagi insulin darajasining sezilarli darajada oshishi bilan bog'liq edi va shu bilan glyukoza intoleransi yaxshilandi va evglikemiya tiklandi. diabetik buyrak shikastlanishidan himoya qilishda.
Xuddi shunday natijalar db/db sichqonlarda T2DMda ham topilgan, bunda 250 Smad3KO orolchalari bilan transplantatsiya qilingan, ammo Smad3WT orolchalarining bir xil dozasi ham hujayra massasini 5- barobar oshirib, glisemik nazoratni yaxshilagan. Ushbu topilmalar shuni ko'rsatadiki, Smad3 etishmovchiligi diabetik mikromuhitga chidamli bo'lib, glyukemik nazoratni yaxshiroq ko'rsatish uchun payvandlangan orol hujayralarining kengayishiga va insulin ishlab chiqarilishiga yordam beradi. Qizig'i shundaki, biz 100 Smad3KO orolchalari bilan davolash STZ bilan qo'zg'atilgan diabetda 200 Smad3WT yoki KO orolchalarini qo'llash bilan teng glisemik nazoratni keltirib chiqarishi mumkinligini aniqladik. Ushbu kuzatish shuni ko'rsatadiki, Smad3 etishmovchiligi T1DM uchun orolcha hujayralarini almashtirish terapiyasida insulin mustaqilligini muvaffaqiyatli o'rnatish uchun zarur bo'lgan orolchalar sonini sezilarli darajada (kamida 50 foiz) kamaytirishi mumkin. Ushbu topilmalar TGFBR1 inhibitori bo'lgan SB{14}} bilan orolchalarni oldindan davolash transplantatsiyadan so'ng hujayralarning ko'payishi va funktsiyasini rag'batlantirishi haqidagi oldingi hisobotga mos keladi [15]. Biroq, Smad2 hujayralardagi insulinning glyukoza bilan stimulyatsiya qilinishida muhim rol o'ynaganligi sababli [16], Smad3 ni emas, balki orolchalarda (hujayralar) yuqori oqim TGFBR1 ni maqsad qilib qo'yish diabetning hujayralarni almashtirishni davolash uchun qulayroq bo'lishi mumkin. Shunday qilib, Smad{22}}yetishmagan orolcha transplantatsiyasi klinik jihatdan T1DM va T2DM uchun yangi terapiya bo'lishi mumkin. Bundan tashqari, Smad3KO orollari bilan davolash T1DM ning 16-haftasida diabetik buyrak shikastlanishidan ham himoya qilishi mumkin, ammo bu T2DMda chuqur emas, chunki 12-haftada db / db sichqonlarida diabetik buyrakning minimal shikastlanishi.
Mexanik jihatdan biz Smad3 ning hujayra proliferatsiyasini inhibe qilish uchun E2F3 ni bostirish orqali ishlashini aniqladik. Bu E2F3 promouterida ChIP va lusiferaza muxbiri tahlili tomonidan tasdiqlangan funktsional Smad3 bog'lanish joyi mavjudligi haqidagi dalillar bilan tasdiqlanadi. Smad3 bo'lmagan orolcha hujayralari E2F{8}}bog'liq mexanizmda proliferatsiyaning kuchayganligini ko'rsatdi, chunki E2F3 ning ishdan chiqishi bu proliferativ faollikni bekor qildi. E2F3 E2F oilasiga mansub va G1/S hujayra sikliga kirishni boshqaruvchi Rb-E2F mexanizmining muhim komponenti hisoblanadi [13]. E2Fs transkripsiya omillari va hujayra siklining rivojlanishini tartibga soluvchi genlarni tartibga soluvchi yakuniy ijrochilardir [14]. E2F3 ning haddan tashqari ko'payishi kemiruvchilar va odamlarning orolchalarida hujayra proliferatsiyasini rag'batlantirishi isbotlangan [17]. Smad3 ning hujayralardagi hujayra siklini bostirish uchun transkripsiyaviy ravishda E2F3 ni maqsad qilganligi haqidagi topilmalar hujayra proliferatsiyasi uchun yangi tartibga solish mexanizmini ta'minlaydi. Shunday qilib, orol hujayralarida Smad3 ning buzilishi E2F{29}}bog'liq hujayra proliferatsiyasiga yordam beradi, chunki insulin ishlab chiqaradigan PCNA plyus yoki BrdU plyus hujayralarining sezilarli darajada ko'payishi, Smad3KO orolchalarining subterapevtik dozasi bilan davolash hujayrani kengaytirish uchun etarli ekanligini ko'rsatadi. ommaviy va STZ-induktsiyali sichqonlarda T1DM va db/db sichqonlarda T2DM ni inhibe qiladi.
Herba CistanchevaCistanche ekstrakti
Xabar qilinishicha, TGF-signalizatsiyasi oshqozon osti bezi orollari hujayralarining rivojlanishi va faoliyatida muhim rol o'ynaydi, hujayra siklini to'xtatadi va CDKIlarni qo'zg'atish orqali hujayra apoptozini keltirib chiqaradi [7, 8, 18]. Ajablanarlisi shundaki, in vivo va in vitro tajribalari Smad3KO orolchalarida CDKI transkripsiyasi o'zgarmaganligini yoki hatto ko'tarilmaganligini aniqladi (S4-rasm). Ushbu nomuvofiqlik turli xil tajriba sharoitlari bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Joriy tadqiqot natijalari Smad3KO sichqonlaridan (orolchalar) olingan. Biroq, oldingi tadqiqotlar TGFBR1 ning farmakologik inhibisyoniga asoslangan bo'lib, u butun TGF signalizatsiyasiga ta'sir qiladi [7, 8]. Bundan tashqari, biz yosh kattalar sichqonlaridan (8-10 haftalik) orolcha namunalaridan foydalanganmiz, oldingi tadqiqotlarda nisbatan qari hayvonlar yoki keksa odamlarning jasad donorlaridan olingan orolchalar ishlatilgan [7, 8]. Orol xujayralari CDKI ning yoshga bog'liq to'planishini ko'rsatadi [19], keksa hujayralardagi CDKIlar TGF signalizatsiyasining inhibisyoniga nisbatan sezgirroq bo'lishi mumkin.
Ushbu tadqiqotda bir nechta cheklovlar mavjud edi. Birinchidan, adacık transplantatsiyasining samaradorligi STZ tomonidan qo'zg'atilgan diabetik sichqoncha modelida autoimmun reaktsiyasisiz tekshiriladi. Shu sababli, Smad3KO ning diabet uchun Smad3WT orolcha terapiyasidan ustunligi kelajakda haqiqiy T1DM modelida ham tekshirilishi kerak. Ikkinchidan, ushbu tadqiqot natijalari butun orolchaga asoslangan, ammo hujayraga xos bo'lmagan Smad3KO hujayra terapiyasiga asoslangan. Orolchadagi hujayralardan boshqa hujayra turlari hujayralararo o'zaro bog'lanish yo'llari orqali hujayra proliferatsiyasini modulyatsiya qilishda Smad{7}}bog'liq rolni bajarishi noma'lum. Shunday qilib, hujayraga xos Smad3KO bilan keyingi tadqiqotlar kafolatlanadi. Bundan tashqari, ushbu tadqiqot natijalari klinik ahamiyatini isbotlash uchun inson orollari namunalarida tekshirilishi kerak.
Ma'lumotnomalar
1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Klinik pankreatik orol transplantatsiyasi. Nat Rev Endokrinol. 2017; 13: 268-77.
2. Jeykobson EF, Tzanakakis ES. Qandli diabet terapiyasi uchun inson pluripotent ildiz hujayralarining funktsional pankreatik hujayralariga farqlanishi: innovatsiyalar, muammolar va kelajak yo'nalishlari. J Biol Eng. 2017; 11:21.
3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S va boshqalar. Klinik orolcha transplantatsiyasidan keyin gistologik greftni baholash. Transplantatsiya. 2009; 88: 1286-93.
4. Lan HY. Buyrak fibrozi va yallig'lanishida TGF-beta / Smadlarning turli rollari. Int J Biol Sci. 2011; 7: 1056-67.
5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. Buyrak fibrozida TGF-beta/Smad signalizatsiyasi. Old fiziol. 2015; 6: 82.
6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K va boshqalar. Smad signalizatsiya tarmog'i orol hujayralarining ko'payishini tartibga soladi. Qandli diabet. 2014; 63: 224-36.
7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. TGF-beta signalizatsiyasini inhibe qilish inson pankreatik beta-hujayra replikatsiyasini rag'batlantiradi. Qandli diabet. 2016; 65: 1208-18.
8. Vang P, Karakose E, Liu X, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanic V va boshqalar. DYRK1A, SMAD va Trithorax yo'llarining birgalikda inhibisyonu kattalar inson beta hujayralarida mustahkam replikatsiyani qo'zg'atish uchun sinergizatsiya qiladi. Hujayra Metab. 2019; 29: 638-52 e5.
9. Sheng JY, Vang L, Tang PM-K, Vang HL, Li JC, Xu BH va boshqalar. Smad3 etishmovchiligi Pax6 ifodasini tiklash orqali db/db sichqonlarda beta-hujayralarning ko'payishi va funktsiyasini rag'batlantiradi. Teranostika. 2021; 11: 2845-59.
10. Zmuda EJ, Pauell CA, Hai T. Sichqoncha orolini izolyatsiya qilish va subkapsulyar buyrak transplantatsiyasi usuli. J Vis Exp. 2011 yil.
11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH va boshqalar. Orol izograft transplantatsiyasi 2-toifa diabetning sichqon modelida insulin sezgirligini yaxshilaydi. Endokrin. 2021; 72: 660-71.
12. Vijayachandra K, Xiggins V, Li J, Glik A. TGFbeta1 tomonidan p16ink4a va p19ARF induksiyasi sichqon keratinotsitlarida o'sishni to'xtatish va qarish reaktsiyasiga yordam beradi. Mol karsinog. 2009; 48: 181-6.
13. Dyer MA, Cepko CL. Retinaning rivojlanishida proliferatsiyani tartibga solish. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 333-42.
14. Dyson N. pRB-oila oqsillari tomonidan E2F ni tartibga solish. Genes Dev. 1998 yil; 12: 2245-62.
15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J va boshqalar. TGFbeta retseptorlari signalizatsiyasining vaqtincha bostirilishi inson orollarini transplantatsiyasini osonlashtiradi. Endokrinologiya. 2016; 157: 1348-56.
16. Nomura M, Zhu HL, Vang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. Sichqonchaning pankreatik beta hujayralarida SMAD2 buzilishi ATP sezgir K plyus kanal faolligining susayishi tufayli orol giperplaziyasi va insulin sekretsiyasining buzilishiga olib keladi. Qandli diabet. 2014; 57: 157-66.
17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Vang Q, Vang Y, Salmon P va boshqalar. E2F3 ning haddan tashqari ko'payishi apoptozni qo'zg'atmasdan, insonning funktsional beta hujayralarining ko'payishiga yordam beradi. Hujayra aylanishi. 2013 yil; 12: 2691-702.
18. Chjan Y, Aleksandr PB, Vang XF. Hujayra proliferatsiyasi va omon qolishini nazorat qilishda TGF-beta oilasining signalizatsiyasi. Sovuq bahor Harb Perspect Biol. 2017; 9.
19. Vang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Skott DK, Garsiya-Ocana A, Styuart AF. Qandli diabet--odamning beta-hujayralari ko'payishidagi yutuqlar va muammolar. Nat Rev Endokrinol. 2015; 11: 201-12.
20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H va boshqalar. SMAD3 ning maqsadli buzilishi shilliq qavatning immunitetini buzadi va T-hujayralarining TGF-beta-ga sezgirligini kamaytiradi. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.
21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Sichqoncha oshqozon osti bezidan orollarni ajratish protokoli. Nat Protoc. 2009; 4: 1649-52.
22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Me'da osti bezi orollarini diabetik sichqonlarning buyrak kapsulasiga ko'chirib o'tkazish. J Vis Exp. 2007: 404.
23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Vang Q va boshqalar. Smad3 ni yo'q qilish 2-toifa diabetik nefropatiyada buyrak fibrozi va yallig'lanishining oldini oladi. Metabolizm. 2020; 103: 154013.
Hong-Lian Vang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Vang1, Rui-Chi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 va Hui-Yao Lan2,7
1 Integratsiyalashgan tibbiyot tadqiqot markazi va nefrologiya bo'limi, Janubi-g'arbiy tibbiyot universitetining an'anaviy xitoy tibbiyoti kasalxonasi, Luzhou, Sichuan, 646000, Xitoy.
2. Tibbiyot va terapevtika bo'limi va Li Ka Shing Sog'liqni saqlash fanlari instituti, Gonkong Xitoy universiteti, Gonkong, 999077, Xitoy.
3. Guangdong-Gongkong immunologik va genetik buyrak kasalliklari bo'yicha qo'shma laboratoriyasi, Guangdong provintsiyasi xalq kasalxonasi, Guangdong tibbiyot fanlari akademiyasi, Guangzhou, Guangdong, 510080, Xitoy.
4. Davlat asosiy bioelektronika laboratoriyasi, Jiangsu asosiy biomateriallar va qurilmalar laboratoriyasi, Biologiya fanlari va tibbiyot muhandisligi maktabi, Janubi-sharqiy universiteti, Nankin, Xitoy.
5. Zhanjiang shahri surunkali buyrak kasalliklarining oldini olish va boshqarish bo'yicha asosiy laboratoriya, Nefrologiya instituti, Guangdong tibbiyot universiteti filiali kasalxonasi, Zhanjiang, Guangdong, 524001, Xitoy.
6. Milliy an'anaviy xitoy tibbiyoti klinik tadqiqot bazasi, Janubi-g'arbiy tibbiyot universitetiga qarashli an'anaviy xitoy tibbiyoti kasalxonasi, Luzhou, Sichuan, 646000, Xitoy.
7. CUHK-Guangdong provintsiyasi xalq kasalxonasi immunologik va genetik buyrak kasalliklari bo'yicha qo'shma tadqiqot laboratoriyasi, Gonkongdagi Xitoy universiteti, Gonkong, 999077, Xitoy.
