Qism Ⅰ Temir chelator, PBT434, miya mikrovaskulyar endoteliy hujayralarida hujayralararo temir savdosini modulyatsiya qiladi
Apr 28, 2023
Abstrakt
Temir va boshqa o'tish metallari, masalan, mis va marganets, miya faoliyatini qo'llab-quvvatlash uchun zarurdir, ammo ortiqcha to'planishi sitotoksik hisoblanadi. Metalllarning, xususan, temirning ortiqcha to'planishi bir nechta nevrologik kasalliklarga xosdir; Bularga Altsgeymer kasalligi, Parkinson kasalligi, Fridrix ataksiyasi va neyrodegeneratsiya va miyada temir to'planishi bilan kechadigan boshqa kasalliklar kiradi. Temir oqimini qon-miya to'sig'i orqali boshqarish normal fiziologiyada va bu patologik sharoitlarda temirning ortiqcha to'planishiga qarshi birinchi himoya chizig'ini ta'minlaydi. Ushbu tadqiqotda biz Parkinson kasalligi va ko'p tizimli atrofiyani davolash uchun ishlab chiqilayotgan PBT434 temir xelatatori hujayradan tashqari Fe ning xelyatsiyasi orqali inson miyasining mikrovaskulyar endotelial hujayralari (hBMVEC) tomonidan temirning so'rilishini modulyatsiya qilishini aniqladik.2 ortiqcha. HBMVEC ni PBT434 bilan davolash transferrin retseptorlari (TfR) va seruloplazmin (Cp) uchun transkriptlarning ko'pligi oshishiga olib keladi. Western blot va Elishay tahlillari oqsillarning ham mos ravishda ko'payishini aniqlaydi. Hujayra ichida PBT434 xayriya, labil Fe ning aniqlanadigan darajasini oshiradi2 ortiqcha; ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, bu Fe2 ortiqchaferritindan ajralib chiqadi. Bundan tashqari, PBT434 temir eksportchisi uchun substrat bo'lgan ferroportinning sitozolik temirning ko'payishi tufayli temirning chiqishini kuchaytiradi. PBT434 hBMVEC qon-miya to'sig'i orqali tez va ikki tomonlama muvozanatlashadi. Bu natijalar shuni ko'rsatadiki, PBT{4}}temir kompleksi hBMVECni qabul qilish uchun substrat emas va shuning uchun PBT434 interstitsial temirni xelatlaydi va qon-miya to'sig'ining endotelial hujayralari tomonidan temirning qayta so'rilishini inhibe qiladigan modelni qo'llab-quvvatlaydi. shuningdek, neyrovaskulyar birlikning boshqa hujayralari tomonidan o'zlashtirilishini inhibe qiladi. Umuman olganda, bu terapevtik temir xelyatsiyasining yangi va istiqbolli mexanizmini taqdim etadi.
Olish uchun shu yerni bosingCistanche qanday foydalari bor
Kirish
Metall xelyatsiya terapiyasi (MCT) uzoq vaqtdan beri o'tish metallari bilan zaharlanishni va metallning ortiqcha to'planishiga olib keladigan muhim metall ionining metabolizmidagi genetik kasalliklarni davolash sifatida ishlatilgan [1-3]. Ikkinchisiga ikkita misol: Uilson kasalligida misning [4] va irsiy gemokromatozda temirning giper-to'planishi [5]. Mis ham, temir ham oksidlovchi stressning katalizatorlari bo'lib, shuning uchun hujayra va organizmning redoks-faol o'tish metallarini "chaperon qilish" qobiliyatidan yuqori konsentratsiyalarda sitotoksikdir [6, 7]. Temirning to'planishi, xususan, keng miqyosda idiopatikdir; Darhaqiqat, temirning ko'payishi miyaning qarishining belgisidir [8-10]. Patologik jihatdan miyada temirning bu to'planishi temir metabolizmi bilan bog'liq bo'lmagan genlardagi mutatsiyalar [11-15] va boshqa turli xil neyrodegenerativ kasalliklarning o'ziga xos xususiyati bo'lib, ularning ba'zilarida qarish [16], Altsgeymer kasalligi [16], Altsgeymer kasalligi [16] kabi o'ziga xos genetik aloqasi yo'q. 17], Fridreyxning ataksiyasi [18] va Parkinson kasalligi [19]. Guruh sifatida bunday kasalliklarni miyada temir to'planishi (NBIA) bilan neyrodejeneratsiya deb hisoblash mumkin, ammo bu qisqartma odatda genetik aloqasi aniqlanganlar bilan cheklangan [11, 13, 14].
Temirning haddan tashqari yuklanishida maqsad hujayra temirni qabul qilish yoki tashqariga chiqarishdagi nuqson tufayli tanani ortiqcha temirdan "tozalash" dir. Bu erda maqsad dori bilan fiziologik temir xelatatorlari bilan raqobat qilishdir; yaxshi farmakokinetikaga ega bo'lgan va temir temirga yuqori afiniteye ega bo'lgan birikma maqsadli dori hisoblanadi. Tana muhim metallar bilan to'ldirilganligi sababli, davolanish jarayonida etishmovchilikni keltirib chiqarish haqida tashvishlanish juda kam. Miya kasalliklarini temir xelat terapiyasi bilan davolash boshqa strategiyani talab qiladi. Bu temirning tizimli haddan tashqari yuklanishi muammosi emas, balki quyi oqimdagi oqibatlarga olib keladigan patologiya sohalarida temir to'planishi. Masalan, Parkinson kasalligida (PD) yoshga bog'liq temir to'planishi oksidlovchi stress bilan bog'liq hujayra shikastlanishiga yordam beradi [20]. Haddan tashqari labil temir substantia nigral neyronlarda -sinukleinning noto'g'ri qatlamlanishiga yordam beradi. Yuqori afinitetli chelatordan foydalanish miyadagi temir yukining biroz kamayishiga olib kelishi mumkin, ammo, albatta, temir tanqisligini keltirib chiqaradi, bu yosh guruhiga xos bo'lgan tizimli temir tanqisligi sababli, hech bo'lmaganda, keksa odamlarda kontrendikedir [21] . Optimal yaqinlikka ega bo'lgan chelator temir to'planishini, shuningdek, ortiqcha labil temir va asosiy kasallik jarayonlari tufayli oksidlovchi stressni kamaytirish potentsialiga ega.
Sitstanche tubulosavaCistanche ta'siri
Talassemiya bilan og'rigan bemorlarda transfüzyondan kelib chiqqan temirning ortiqcha yuklanishini davolashda foydalanish uchun tasdiqlangan chelatorlardan biri deferipron (DFP, Ferriprox brendi) [5, 22]. DFP Fridreyx ataksiyasi [23] va Parkinson kasalligini [24, 25] davolashda ham qo'llanilgan. Meta-tahlilda DFP miyokarddagi temir miqdorini sezilarli darajada kamaytirishi, shuningdek, klassik temir xelatlashtiruvchi vosita bo'lgan deferoksaminga qaraganda talassemiya bilan og'rigan bemorlarda yurakni ko'proq himoya qilishini ko'rsatdi [5]. Boshqa tomondan, DFP jigar tomonidan tez metabollanadi [26] va yaqinda olib borilgan ishlar temirga bog'liq bo'lgan giston lizin demetilazlarining faol joyida Fe2 plus xelatini ko'rsatdi, bu faollik ilgari tan olinmagan sitotoksiklik bilan bog'liq [27]. Ushbu topilma temir xelat terapiyasidan foydalanishdagi asosiy cheklovni, ya'ni temir do'konida yoki protez temir turini o'z ichiga olgan oqsilda fiziologik muhim temir uchun dori bilan raqobatni ta'kidlaydi. Shunga qaramay, DFP, masalan, Parkinson kasalligining 2-bosqich sinov davolashida samaradorlikni ko'rsatdi, chunki bu ham analitik (T2- vaznli MRI tomonidan miyada temir yukining kamayishi) va xulq-atvor indekslari (kognitiv va motor neyron funktsiyasi) [ 24, 25].
Biroq, DFP ning Fe3 plus uchun yaqinligi tashvishli bo'lib qolmoqda. Barqaror DFP-temir turlari tris-kompleksdir, [Fe(DFP)3] 0 [28]. Ushbu kompleksning neytralligi temirni hujayradan tashqariga chiqarish uchun ideal bo'lsa-da, uning barqarorligi konstantasi ~ 1037, DFP ni haqiqiy temir tozalovchi qiladi; shu nuqtai nazardan, uning lizin demetilaz kabi temir fermentini inhibe qilishini oldindan aytish mumkin [27]. Bu tashvish DFP membranalarining o'tkazuvchanligiga ega bo'lgan, ammo Fe2 plus va Fe3 plus uchun sezilarli darajada zaifroq yaqinlikka ega bo'lgan temir xelatatorlarini ishlab chiqish zarurligini aks ettiradi. Bu oxirgi xususiyat protez metallni dori vositalaridan tozalashni va reaktiv kislorod turlarini ishlab chiqarishga olib keladigan temir temirning avtooksidlanishini katalizlash uchun xelatlashtiruvchi vositaning termodinamik salohiyatini cheklaydi. Aslini olganda, kuchli temir temir xelatatorlari Fe2 plus ning oksidlovchi xususiyatini katalizlaydi [29]. Ushbu tadqiqotda biz temir va temirning o'rtacha afinitesi bo'lgan bunday temir xelatatori qon-miya to'sig'ini (BBB) tashkil etuvchi miya mikrovaskulyar endotelial hujayralarida temir oqimini qanday modulyatsiya qilishini xabar qilamiz.
Cistanche tabletkalari
Ushbu preparat, PBT434 [5,7-dikloro-2-((metilamino)metil)-8-gidroksi-3-metilkinazolin-4 (3H)-on, 1A-rasm] , Fe uchun ~11 va ~15 log barqarorlik konstantalari bilan bis-temir kompleksini hosil qiladi2 ortiqchava Fe3 ortiqcha, mos ravishda [30]. PBT434 substantia nigra pars compacta (SNpc) neyronlarining yo'qolishining oldini oldi, nigral-sinuklein to'planishini pasaytirdi, o'rta miyada PD kasalligi modeli bilan bog'liq temir miqdorini kamaytirdi va Parkinson kasalligining ikkita sichqoncha modelida tizimli temir zahiralari kamaymasdan, vosita ishlashini saqlab qoldi. [30]. PBT434 ko'p tizimli atrofiya (MSA) [30, 31] sichqoncha modellarida ham samarali bo'lib, Parkinson kasalligiga o'xshash, ammo sinukleinlarning noto'g'ri qatlamlanishi va keyinchalik to'planishi bilan tavsiflanadi, bu esa o'ziga xos belgi bo'lgan glial sitoplazmatik qo'shimchalarning shakllanishiga olib keladi. kasallikning patologiyasi [32]. Shunisi e'tiborga loyiqki, PBT434 sichqonchaning PD modellarida oksidlovchi stress belgilarini kamaytirdi [30], bu 1) PBT434 maqsadli temir zahiralari aks holda pro-oksidant sifatida ishlash uchun tayyorlanganligini va 2) PBT434 yangi paydo bo'lgan oksidlanishga asoslangan sitotoksiklikni kuchaytirmaganligini ko'rsatadi. PBT434 1-bosqich tadqiqotini qoniqarli yakunladi [33].
Bu erda taqdim etilgan ish PBT434 ning miyaning to'siq hujayralarida temir savdosiga ta'sirini o'rganish uchun mo'ljallangan, mikrovaskulyar endotelial hujayralar, ular asosiy glia bilan birgalikda qon-miya to'sig'ini hosil qiladi. Ushbu tadqiqotlar monolayer va transwell madaniyat formatlarida yaxshi tasdiqlangan o'lmas endotelial hujayra chizig'idan foydalangan [34-37]. Ushbu tadqiqotlarning asosiy maqsadi bu hujayralardan temirni qabul qilish va oqib chiqish kinetikasini va ularning PBT434 tomonidan modulyatsiyasini aniqlash edi. Transwell BBB modeli, shuningdek, endotelial hujayralar to'sig'i bo'ylab ikki tomonlama PBT434 transcellular oqimini namoyish qilish uchun ishlatilgan. Model molekulyar nuqtai nazardan ko'rsatdiki, PBT434 temir oqimini rag'batlantirganda, xelyatsiya orqali temirning so'rilishini inhibe qiladi. Hujayra ko'rish tadqiqotlari shuni ko'rsatadiki, PBT434 klassik Fe tomonidan tekshirilgan bir xil labil temir hovuziga kiradi.2 ortiqchaxelatlashtiruvchi vosita, 2,2'-bipiridin yoki bipiridil va temir temir uchun floresan prob. Natijalar PBT434 uchun mumkin bo'lgan ta'sir mexanizmini ko'rsatadi, bu BBBda tizimli temirning so'rilishini inhibe qilishni va keyinchalik interstitsial bo'shliqda miya temirining sekvestrlanishini o'z ichiga oladi.
Natijalar
1. PBT434 miya mikrovaskulyar endotelial hujayralariga sitotoksik ta'sir ko'rsatmaydi
In vitro hujayra madaniyatida PBT434 uchun tegishli ish konsentratsiyasini aniqlash uchun biz PBT434 ga javoban hBMVEC mitoxondrial funktsiyasini kuzatish uchun MTT tahlilidan foydalandik. Oldingi hisobotlarga [30] asoslanib, 24 soat davomida 100 mkM gacha bo'lgan PBT434 kontsentratsiyasi bilan ishlov berilgan. Biz sinovdan o'tgan har qanday kontsentratsiya bilan hBMVEC hayotiyligida sezilarli o'zgarishlarni kuzatmadik (2-rasm).
2. PBT434 tezlik bilan qabul qilinadi va hBMVEC to'sig'i orqali sotiladi
PBT434 - sichqonlar va odamlarda o'tkazilgan tadqiqotlarda ko'rinib turganidek, BBB ga osonlikcha kirib boradigan og'iz orqali biologik mavjud dori [30, 38, 39]. Biz radiotraser sifatida 14C etiketli PBT434 dan foydalangan holda mono qatlamlarda o'stirilgan hBMVECda PBT434 to'planishini kuzatdik. Ma'lumotlar shuni ko'rsatdiki, birinchi bosqichda 14C-PBT434 qabul qilish muhiti va hujayra o'rtasida tezda muvozanatlashgan. Ushbu dastlabki qabul qilish 3 soat davomida qo'shimcha sekin to'planish bilan kuzatildi, bu 30,1 ± 9,8 pmol / mg / soat tezlikni ko'rsatdi (3A-rasm). Qabul qilish protokolida qabul qilish so'ndiriladi va 14C-PBT434 to'planishi uchun ishlov berishdan oldin hujayralar 4˚C da yuviladi (usullar). Alohida tajribada biz 30 daqiqalik yuklash davridan keyin hBMVEC dan 14C-PBT434 oqimini tekshirdik. Efflux protokolida hujayralar 25˚C da yuviladi. 3B-rasmdagi ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, 25˚C yuvishda hujayrada to'plangan 14C-PBT434 ning taxminan 92 foizi yo'qolgan (3A da 550 pmol 14C-PBT434/mg protein 30 daqiqadan 43 pmol 14C-PBT434/mg gacha) 3B da t=0 da protein). Qolgan 14C-PBT434 ning yana sekin yo'qolishi kuzatildi (3B-rasm). Ma'lumotlar hBMVEC tomonidan PBT434 ning to'planishi va chiqishining ikki jihatini ko'rsatadi. Plazma membranasi bo'ylab oqim tezda muvozanatga o'xshab ko'rinadigan narsaga erishadi, yutilish yoki oqim paytida. Biroq, ikkala jarayonda ham boshqa sekinroq jarayon paydo bo'ladi. Bu shuni ko'rsatadiki, hujayra ichida PBT434 hujayraning ba'zi bir qismi hujayradan tashqari muhit bilan muvozanatdagi fraktsiya bilan kinetik barqaror holat munosabatida bo'lgan mahalliy/holatda. 3B-rasmda qayd etilgan kinetik tahlil shuni ko'rsatdiki, PBT434 ning ushbu hovuzi hujayralar 20 mkM reagent bilan ishlov berilganda hujayra lizatidagi 27 ± 4 pmol/mg oqsil bilan ifodalangan.
PBT434 ning hujayralararo oqimini tekshirish uchun biz transwell membranasining apikal tomonida o'sgan holda yaxshi tasdiqlangan in vitro BBB modelidan foydalandik [35, 36, 40, 41]. Ushbu transwell kulturalarining to'siq xususiyatlari ularning transendotelial elektr qarshiligini (TEER) va FITC etiketli dekstranga o'tkazmasligini aniqlash orqali tasdiqlangan (S1-rasm). Biz 14C-PBT434 ni luminal (yoki apikal, qon tomonida) (4A-rasm) abluminal (yoki bazolateral, miya tomoni) membranada qabul qilish bilan solishtirdik (4C-rasm). Xuddi shu tajribada mos keladigan oqim (hujayralararo oqim) oqim kamerasida 14C-PBT434 ko'rinishi bilan aniqlandi (4-rasm B va D panellari). Ushbu jarayonlarning tezligi 1-jadvalda keltirilgan. 4-rasmda ko'rsatilgan ommaviy ma'lumotlar (B va D panellari) ushbu modeldagi qon-miya to'sig'i bo'ylab PBT434 ning aniq oqimi ikki yo'nalishda bir xil bo'lganligini ko'rsatadi. Bazal kamerada 976 ± 185 pmol 14C-PBT434 to'plangan (4B-rasm) va bazal kamerada 1033 ± 210 pmol miqdori aniqlangan (4D-rasm). Ushbu yaqin ekvivalentlik, shuningdek, ikkita to'siq membranalarida PBT434 oqimining bir-biriga o'xshash tezligida aks ettirilgan (1-jadval). Shu bilan birga, ushbu to'siq modelida PBT434 ning bazolateral membranada sezilarli darajada ko'proq so'rilishi kuzatildi, chunki bazal kameradan birikmaning ~ 50 foizga ko'proq yo'qolishi (4C-rasm) tasvirlangan, bu hujayraning aniq so'rilishining ~ 40 foizga yuqori darajasiga to'g'ri keladi. (1-jadval). Kuchliroq qabul qilish ko'proq to'planishga olib keladi. Hujayralarni 3 soatda tahlil qilish shuni ko'rsatdiki, ular oqim yo'nalishidan qat'i nazar ~ 6 mkM PBT434 ni saqlab qolishgan. Qiymatlar 8,1± 1,3 mkM (apikaldan bazalgacha) va 4,7±1,2 mkM (bazaldan apikalgacha) edi. Yuqorida ta'kidlab o'tilganidek, bu tahlil lizisdan oldin hujayralarni yuvish va umumiy hujayra oqsili va 14C-PBT434 miqdorini aniqlashdan keyin amalga oshiriladi. Bundan tashqari, apikal kameradagi muhitda RPMI plyus 10 foiz FBS va 10 foiz NuSerum, bazal, "miya" kamerasida esa faqat RPMI (metodlar) mavjud edi. To'g'ri xulosa shundan iboratki, bazal membranada ko'proq "so'rilish" PBT434 ning hujayra yuzasi adsorbsiyasini aks ettiradi, bu apikal kamerada zardobdagi oqsil komponentlari mavjudligi bilan cheklangan. PBT434 to'planishi uchun hujayralarni yuvgandan so'ng, bu adsorbsiyalangan material ("qabul qilish" sifatida qayd etilgan) olib tashlandi. Ushbu oqim tajribasini takrorlash, lekin bazal kameradagi sarum bilan, haqiqatan ham, sarum PBT434 hujayra yuzasining adsorbsiyasini bostirishini ko'rsatdi (S2-rasm).
3. PBT434, bipiridildan farqli o'laroq, labil temirning hujayra ichidagi mavjudligini cheklamaydi.
PBT434 deferipron yoki bipiridil kabi klassik temir xelatatorlari bilan solishtirganda temirga nisbatan o'rtacha darajada yaqinroq bo'lganligi sababli, biz bu farq hBMVEC ning uyali labil temir hovuziga (LIP) PBT434 ta'sirida qanday aks etganligini tekshirdik. Buning uchun biz o'tkazuvchan, Fe dan foydalandik2 ortiqcha-xayriya sitoplazmatik temir bilan reaksiyaga kirishadigan o'ziga xos floresan bo'yoq FerroOrange. Biz bipiridil bilan ishlov berilganda hujayralardagi floresansning sezilarli ablasyonini ko'rdik, bu yuqori afinitetli temir temir xelatatori tomonidan LIPning xelatlanishiga mos keladi va shu bilan floresan temir indikatorining ta'sirini bloklaydi (5A-rasm). Aksincha, PBT434 Fe uchun FerroOrange bilan raqobatlashmadi2 ortiqcha, uning o'rtacha yaqinligi bilan mos keladigan xatti-harakatlar [30]. Natijalar shuni ko'rsatdiki, PBT434, lekin PBT{2}}mevjud bo'lmagan faol lotin emas, FerroOrange-ga kirish mumkin bo'lgan Fe ning 34 ± 9 foizga oshishiga olib keldi.2 ortiqchaBu xelatlovchi vosita temirni hujayra ichida bir vaqtning o'zida toksik ta'sir qilmasdan mobilizatsiya qilishini taklif qiladi. Quyida keltirilgan ma'lumotlar temirning ferritindan kelib chiqqanligini ko'rsatadi.
Ilgari PBT434 MPTP bilan davolash qilingan sichqonlarda ferroportin oqsili ekspressiyasini qayta tiklash uchun ko'rsatilgan edi. Bu natija, PBT434 ga javoban hujayra ichidagi temir temirning bo'yalishining ortishi bilan birga, temir bilan bog'liq bo'lgan oqsillarning hujayrali javob tizimi va funktsiyasiga potentsial ta'sir ko'rsatdi. Buni baholash uchun biz birinchi navbatda PBT434 ning temir bilan ishlaydigan bir nechta oqsillar uchun transkriptlarning ko'pligiga ta'sirining miqdoriy PCR (qPCR) tahlilini o'tkazdik (6-rasm). Temir oqizuvchi oqsil, ferroportin (Fpn) va ikkita sitoplazmatik temir chaperonlari, PCBP1 va 2 transkriptlari ta'sir qilmagan bo'lsa-da, transferrin retseptorlari (TfR) va ferroksidaza, seruloplazmin (Cp) uchun mRNKlarning ko'pligi ta'sir ko'rsatdi. o'zgartirish. TfR va Cp transkriptlari mos ravishda 2,8 va 3.6- barobar oshdi. Transferrin retseptorlari (TfR) ifodasi temirga sezgir element (IRE) / temirni tartibga soluvchi protein (IRP) tizimi bilan bog'liq [42-44]. TfR mRNKning ko'payishi PBT434 regulyator IREBPni RNK-bog'lovchi oqsildan sitozolik akonitazaga aylantiruvchi Fe, S klasterini yig'ish uchun PCBP{18}}bog'liq temir yetkazib berish bilan raqobatlashishini ko'rsatadi [45]. Shunday qilib, PBT434 ushbu tartibga soluvchi modulyatsiyani RNK-bog'lash va mos ravishda TfR mRNK degradatsiyasini inhibe qilish tomon siljitadi. Hujayradagi temir tanqisligida Cp ifodasi qisman HIF-1 [46] tomonidan tartibga solinadi. HIF{25}} funktsiyasining ortishi temirga bog'liq reaktsiyada prolil gidroksilaza faolligi bilan gidroksillanishining pasayishi natijasida yuzaga keladi [47]. IREBP misolida bo'lgani kabi, PBT434 HIF-1 gidroksillanishi va degradatsiyasida ko-faktor bo'lib xizmat qiluvchi temir hovuzini kamaytiradi. Ushbu modelda ushbu transkripsiya faollashtiruvchining barqaror holat darajasining oshishi Cp transkripsiyasini oshiradi.
Elishay tahlili va western blotting kombinatsiyasidan foydalanib, biz temir bilan ishlov beradigan oqsillarni PBT434 yoki PBT434-bilan ishlov berilgan hBMVEC bilan ifodalanishini tekshirdik; JB tahlillarining misollari 7A-rasmda keltirilgan. Ma'lumotlar shuni ko'rsatdiki, TfR monomer va dimerning ko'pligi Cp (7B va 7C-rasm) kabi 24 soatga sezilarli darajada oshdi. Ikkala o'sish ham tegishli transkriptlardagi PBT{7}}bog'liq o'sish bilan parallel bo'ldi (6-rasm), Aksincha, temir oqimi oqsili Fpn ifodasi PBT434 davolashga befarq edi (7D-rasm).
western blot ma'lumotlarida ko'rsatilgan katlama o'zgarishlarini aniqlash uchun qo'shimcha usul sifatida ELISA dan foydalandik. Shunday qilib, hBMVEC 24 soat davomida PBT434 bilan ishlov berildi va hujayra lizatlari TfR uchun Elishay tomonidan tahlil qilindi (8A-rasm). Elishay tomonidan aniqlangan PBT434 bilan davolashga javoban TfR ning baravar ortishi g'arbiy dog'lar tahlili bilan ta'minlanganiga teng edi (7B-rasm). Elishay, shuningdek, HepG2 hujayralarini ijobiy nazorat sifatida ishlatib, sekretsiyalangan va GPI bilan bog'langan Cp oqsilining ko'pligini baholash uchun ishlatilgan. O'sish muhitida ajraladigan Cp bilan bog'liq holda, bu yondashuv HepG2 va hBMVEC shartli muhitda sCp ko'pligi ushbu tahlilning pastki sezgirlik chegarasida yoki undan past bo'lganligi bilan cheklangan edi (S3-rasm). Biroq, bu GPI-Cp ko'pligini baholash imkonini berdi. Ushbu usulda hujayralar fosfatidilinositolga xos fosfolipaz C (PI-PLC) bilan ishlov berildi, bu GPI langarini kesib tashlaydi; Shunday qilib shartlangan ommaviy axborot vositalari Cp-ELISA tomonidan jamlangan va tahlil qilingan. Ushbu yondashuv PBT434 HepG2 hujayralarida GPI-Cp miqdorini oshirganligini ko'rsatgan bo'lsa-da, u yana PI-PLC tomonidan chiqarilgan Cp ni aniqlay olmadi (8B-rasm). Elishay shuningdek, ferritin miqdorini aniqlashning bevosita usulini ham taqdim etdi. Buning uchun hBMVEC 24 soat davomida 1 uM Fe-sitrat bilan yuklangan, so'ngra PBT434 yo'qligi yoki mavjud bo'lganda qo'shimcha 1 soat davomida davolash. Olingan hujayra lizatlari ferritin uchun Elishay tahlilidan o'tkazildi (8C-rasm). TfR o'sishidan farqli o'laroq, PBT434 bilan davolash ferritin (Ft) oqsilini ~ 18 foizga pasaytirdi. Haqiqatan ham, Ft oqsilining yo'qolishi reagent bilan atigi 1 soat davolashdan keyin aniq bo'ldi. Ushbu natijaning vaqtinchalik tabiati PBT434 bilan 30 daqiqalik davolanishdan keyin yuqorida qayd etilgan xayriya Fe2 plus ning ko'payishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Keyinchalik muhokama qilinganidek, ferritinning ishdan chiqishi boshqa hujayra o'tkazuvchan Fe2 va xelatlashtiruvchi moddalar bilan davolashdan keyin ko'rsatildi [48].
4. 55Fe2 ortiqchaqabul qilish PBT434 bilan kompleks hosil qilish orqali inhibe qilinadi
24 soat davomida Fe2 plyusning sekin, ikki fazali qabul qilinishi va muvozanatlashuvi bilan solishtirganda, hBMVECda PBT434 ning 30 daqiqa ichida tez muvozanatlashishini hisobga olgan holda, biz PBT434 va Fe2 plus bir xil qabul qilish mexanizmini baham ko'rmaydi deb taxmin qildik. Buni sinash uchun monoqatlamlar PBT434 yoki PBT434-boʻlmaganda yoki mavjud boʻlmaganda radioyorliqli 55Fe2 plus bilan inkubatsiya qilindi va 55Fe2 plus 3 soat davomida oʻzlashtirilishi kuzatildi (9A-rasm). PBT434 55Fe2 plus qabul qilish tezligini sezilarli darajada kamaytirdi, shuningdek, hujayra lizatlarida 55Fe2 plus umumiy to'planishini kamaytirdi (9C-rasm). Bu effekt PBT434-uchun ko'rinmadi. PBT434 ni 55Fe qabul qilish stavkalarini solishtirish PBT434 va Fe2 plus alohida transport yo'llari bilan qabul qilinishini ko'rsatadi. Bundan tashqari, PBT434 ishtirokida 55Fe-ning so'rilishini inhibe qilish, ammo PBT{30}}metod emasligi shuni ko'rsatadiki, hujayradan tashqari PBT{31}}temir kompleksi hBMVEC, ya'ni ZIP8 va temir temir tashuvchilar uchun ligand emas. ZIP 14.
Cistanche qo'shimchalari
PBT434 ning temir to'planishidagi rolini batafsil o'rganish uchun biz uning oldingi ta'sirining 55Fe2 plus qabul qilinishiga ta'sirini sinab ko'rdik. PBT434 bilan oldindan ishlov berilgan, yuvilganidan keyin 55Fe2 plyusga ta'sir qilingan hujayralar 3 soatdan keyin 55Fe2 plus ni olish va to'planish tezligining oshishini ko'rsatdi (9-rasm, B va D panellari). Ushbu ko'paygan to'planish kamida 24 soat davomida saqlanib qoldi. Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, hujayralarga PBT434 ga oldindan ta'sir qilish temirni qabul qilishni vaqtincha kuchaytiradi. Kutilmaganda, PBT{14}}oldindan ishlov berish ham qabul qilish va to‘planishning o‘sishini ko‘rsatdi (9B-rasm), lekin bu ta’sir PBT434 tomonidan ko‘rsatilgandek sezilarli yoki doimiy emas edi.
Biz 59Fe-transferrindan temirning so'rilishini plazma membranasida ferro-qaytarilish va ferro-o'tkazuvchanlik bilan qo'llab-quvvatlashini ko'rsatdik [50, 51]. Ushbu TBI temirni qabul qilish modelini qo'llab-quvvatlovchi eksperimental natijalardan biri ekstra-sitoplazmatik ferrireduktaza faolligini inhibe qilish orqali bu qabul qilishning ishdan chiqishi edi; yana bir natija kuchli temirli temir xelatlovchi agenti bo'lgan ferrozin tomonidan TBI temirining so'rilishini 60 foizga inhibe qilish edi [50]. Ushbu oxirgi strategiya PBT434 ning PBTga mos kelmasligi{10}}, shuningdek, TBI temirining so'rilishini inhibe qilishini ko'rsatish uchun ishlatilgan (10-rasm).
5. PBT434 Fpn-ga bog'liq 55Fe2 ortiqcha oqimni rag'batlantiradi
PBT434 deferipronning Fe2 ning aniq stimulyatsiyasi va neyron hujayralaridan oqib chiqishini hosil qilish qobiliyatining taxminan 20 foiziga ega [30]. Biz nazorat hujayralarida yoki mini-gepcidin, PR73 bilan davolash qilingan hujayralarda PBT434 yo'qligi yoki mavjudligida hBMVEC dan 55Fe2 plus ning chiqishini baholadik. Gepcidin ham tizimli, ham miya interstitiumida joylashgan peptid gormoni bo'lib, Fpn bilan bog'lanadi va degradatsiya uchun tashuvchini maqsad qiladi. Gepsidinning Fpn ning temir eksport funktsiyasiga ta'siri keng qamrovli o'rganilgan [52-54]. Biz ilgari hBMVEC dan Fe2 plus oqimining Fpn ga bog'liqligini ko'rsatdik [35, 49]. PR73 GFP reportyor tahlilida Fpn degradatsiyasi uchun ~4 nM EC50 ga ega [55]. Mono qatlamlardagi hBMVEC PR73 yo'qligi yoki mavjudligida 24 soat davomida 55Fe2 plus bilan yuklangan. 55Fe-efluks keyin 5 soat davomida PR73 ning yo'qligi yoki mavjudligi PBT434 yo'qligi va mavjudligi bilan birgalikda aniqlandi (11-rasm). PR73 ham nazorat, ham PBT{31}}davolangan kulturalardan 55Fe oqimini yo'q qilgan bo'lsa, PBT434 mini-gepsidin tufayli inhibisyonni qisman bostirdi. PBT434 yoʻq boʻlganda, PR{35}}davolangan kulturalardan temirning chiqishi ~75 foizga kamaydi, PBT bilan ishlov berilgan kulturalarda esa atigi ~50 foizni tashkil etdi (11-rasm va 2-jadval). Ushbu natijalardan ikkita xulosa chiqarish mumkin. Birinchidan, Fpn ning PR73 tomonidan nokdaun qilinishi PBT434 mavjudligida ham, yo'qligida ham 55Fe-effluxni pasaytiradi. Ikkinchidan, har ikkala holatda ham PBT434 temir oqimining kichik bo'lsa-da sezilarli stimulyatsiyasini qo'llab-quvvatlaydi.
Ma'lumotnomalar
1. Hatcher HC, Singh RN, Torti FM, Torti SV. Sintetik va tabiiy temir xelatatorlari: terapevtik salohiyat va klinik foydalanish. Future Med Chem. 2009; 1(9):1643–70.
2018-03-22 Nuñez MT, Chana-Cuevas P. Neyrodegenerativ kasalliklarni davolash uchun temir xelat terapiyasining yangi istiqbollari. Farmatsevtika (Bazel). 2018; 11(4):109.
3. Tosato M, Di Marko V. Metall xelyatsiya terapiyasi va Parkinson kasalligi: Tegishli metall ionlari va istiqbolli yoki tasdiqlangan dorilar o'rtasida kompleks hosil bo'lish termodinamikasini tanqidiy ko'rib chiqish. Biomolekulalar. 2019; 9(7).
4. Hedera P. Wilson kasalligini klinik boshqarish bo'yicha yangilanish. Appl Clin Genet. 2017; 10:9–19.
5. Xia S, Zhang W, Huang L, Jiang H. Deferoksamin, deferipron va deferasiroksning og'ir talassemiyaga nisbatan qiyosiy samaradorligi va xavfsizligi: 16 ta randomizatsiyalangan nazorat ostidagi sinovlarning meta-tahlili. PLoS One. 2013 yil; 8(12):e82662.
6. Buettner GR, Jurkiewicz BA. Katalitik metallar, askorbat va erkin radikallar: oldini olish kerak bo'lgan birikmalar. Radiat Res. 1996 yil; 145(5):532–41. PMID: 8619018
7. Singh A, Kukreti R, Saso L, Kukreti S. Oksidlanish stressi: Neyrodegenerativ kasalliklarda asosiy modulyator. Molekulalar. 2019; 24(8).
8. Ashraf A, Clark M, So PW. Temir odamning qarishi. Oldindan qarish nevrologiyasi. 2018; 10:65.
9. Ghadery C, Pirpamer L, Hofer E, Langkammer C, Petrovic K, Loitfelder M va boshqalar. Miya temirining R2 * xaritasi: normal qarishda bilish bilan bog'liqlik. Neyrobiol qarishi. 2015; 36(2):925–32.
10. Zecca L, Youdim MBH, Riederer P, Connor JR, Crichton RR. Temir, miyaning qarishi va neyrodegenerativ kasalliklar. Nat Rev Neurosci. 2004; 5(11):863–73.
11. Di Meo I, Tiranti V. NBIA sindromlarining tasnifi va molekulyar patogenezi. Eur J Paediatr Neurol. 2018; 22(2):272–84.
12. Levi S, Finazzi D. Miya temirining to'planishi bilan neyrodejeneratsiya: patogen mexanizmlar bo'yicha yangilanish. Old Farmakol. 2014 yil; 5:99–.
13. Levi S, Tiranti V. Miyada temir to'planishining buzilishi bilan neyrodegeneratsiya: Temir cho'kmasining patogenezini tushunishga qaratilgan qimmatli modellar. Farmatsevtika (Bazel). 2019; 12(1).
14. Meyer E, Kurian MA, Hayflick SJ. Miyada temir to'planishi bilan neyrodegeneratsiya: genetik xilma-xillik va patofizyologik mexanizmlar. Annu Rev Genomika Hum Genet. 2015; 16:257–79.
15. Tonekaboni SH, Mollamohammadi M. Miyada temir to'planishi bilan neyrodegeneratsiya: umumiy ko'rinish. Iran J Child Neurol. 2014 yil; 8(4):1–8. PMID: 25657764
16. Cozzi A, Orellana DI, Santambrogio P, Rubio A, Cancellieri C, Giannelli S va boshqalar. Neyroferritinopatiyaning ildiz hujayralarini modellashtirish neyronlarning qarishi davrida temirning qarish va ferroptozning aniqlovchisi sifatida namoyon bo'ladi. Ildiz hujayra hisobotlari. 2019; 13(5):832–46.
17. Liu JL, Fan YG, Yang ZS, Vang ZY, Guo C. Temir va Altsgeymer kasalligi: patogenezdan terapevtik ta'sirga qadar. Old nevrologiya. 2018; 12:632.
18. Llorens QK, Soriano S, Calap-Quintana P, Gonsales-Kabo P, Molto MD. Fridreyxning ataksiyasida temirning roli: inson to'qimalari va uyali va hayvonlar modellaridagi tadqiqotlardan olingan tushunchalar. Old nevrologiya. 2019; 13:75.
19. Puschmann A. Irsiy Parkinson kasalligi yoki Parkinsonizmni keltirib chiqaradigan yangi genlar. Curr Neurol Neurosci Rep. 2017; 17(9):66.
20. Crielaard BJ, Lammers T, Rivella S. Dori-darmonlarni topish va etkazib berishda temir metabolizmini maqsad qilib olish. Nat Rev Drug Discov. 2017; 16(6):400–23.
21. Guralnik JM, Eisenstaedt RS, Ferrucci L, Klein HG, Woodman RC. Qo'shma Shtatlarda 65 yosh va undan katta odamlarda kamqonlikning tarqalishi: tushunarsiz anemiyaning yuqori darajasining dalillari. Qon. 2004; 104 (8): 2263–8.
22. Pepe A, Meloni A, Kapra M, Cianciulli P, Prossomariti L, Malaventura C va boshqalar. Talassemiya bilan og'rigan asosiy bemorlarda deferasiroks, deferipron va desferrioksaminni davolash: yurakdagi temir va funktsiyani miqdoriy magnit-rezonans tomografiya bilan aniqlangan taqqoslash. Gematologik. 2011; 96(1):41–7.
23. Pandolfo M, Arpa J, Delatycki MB, Le Quan Sang KH, Mariotti C, Munnich A va boshqalar. Fridreyx ataksiyasida deferipron: 6- oylik randomize nazorat ostida sinov. Ann Neurol. 2014 yil; 76(4):509–21.
24. Martin-Bastida A, Ward RJ, Newbould R, Piccini P, Sharp D, Kabba C va boshqalar. Parkinson kasalligi bo'yicha randomizatsiyalangan ikki marta ko'r-ko'rona platsebo-nazorat ostidagi klinik sinovning 2-bosqichida deferipron bilan miya temir xelatatsiyasi. Sci Rep. 2017; 7(1):1398.
25. Devos D, Moreau C, Devedjian JC, Kluza J, Petrault M, Laloux C va boshqalar. Parkinson kasalligida terapevtik usul sifatida xelatli temirni nishonga olish. Antioksid oksidlanish-qaytarilish signali. 2014 yil; 21(2):195–210. https://doi. org/10.1089/ars.2013.5593 PMID: 24251381
26. Singh S, Epemolu RO, Dobbin PS, Tilbrook GS, Ellis BL, Damani LA va boshqalar. Odam va kalamushlarda 1,2-dimetil- va 1,2-dietil almashtirilgan 3-gidroksipiridin-4-ning siydikdagi metabolik profili. Dori vositalarining metabolizmi va joylashishi. 1992 yil; 20(2):256. PMID: 1352218
27. Khodaverdian V, Tapadar S, MacDonald IA, Xu Y, Xo PY, Bridges A va boshqalar. Deferiprone: Pan-selektiv giston lizin demetilazni inhibe qilish faolligi va strukturaviy faoliyat munosabatlarini o'rganish. Sci Rep. 2019; 9(1):4802.
28. Hider R. Og'iz orqali faol temir xelatatorlariga qaratilgan so'nggi ishlanmalar. Talassemiya haqida hisobot. 2014 yil; 4 (2).
29. Kosman DJ. Aeroblarda temir metabolizmi: temir temir gidrolizini va temirning avtooksidlanishini boshqarish. Coord Chem Rev. 2013; 257(1):210–7.
30. Finkelstein DI, Billings JL, Adlard PA, Ayton S, Sedjahtera A, Masters CL va boshqalar. PBT434 yangi birikmasi Parkinson kasalligining bir nechta modellarida temir vositachiligidagi neyrodegeneratsiya va alfa-sinuklein toksikligini oldini oladi. Acta Neuropathol Commun. 2017; 5(1):53.
31. Heras-Garvin A, Refolo V, Shmidt C, Bredberi M, Stamler D, Stefanova N, muharrirlar. PBT434 dopaminerjik neyronlarni saqlaydi, alfa-sinuklein oligomerizatsiyasini kamaytiradi va transgenik murine ko'p tizimli atrofiya modelida vosita funktsiyasini yaxshilaydi. Nevrologiya yilnomalari; 2020: Wiley 111 River St, Hoboken 07030–5774, NJ AQSh.
32. Heras-Garvin A, Stefanova N. MSA: Asosiy mexanizmlardan eksperimental terapevtikagacha. Parkinsonizm bilan bog'liq kasallik. 2020; 73:94–104.
33. Dauson VL, Dauson TM. Parkinson kasalligi uchun kasallikni o'zgartiruvchi davolash usullari. Ilmiy tarjima tibbiyoti. 2019; 11(520):eaba1659.
34. Eigenmann DE, Xue G, Kim KS, Musa AV, Gamburger M, Oufir M. Inson miyasining to'rtta o'lmas kapillyar endotelial hujayra chizig'ini, hCMEC/D3, hBMEC, TY10 va BB19ni qiyosiy o'rganish va madaniyat sharoitlarini optimallashtirish, dori o'tkazuvchanligini o'rganish uchun in vitro qon-miya to'sig'i modeli. Markaziy asab tizimining suyuqliklari va to'siqlari. 2013 yil; 10(1):33.
35. Makkarti RC, Kosman DJ. Glial hujayrali seruloplazmin va gepsidin miya mikrovaskulyar endotelial hujayralaridan temirning chiqishini differentsial tartibga soladi. PLoS One. 2014 yil; 9(2):e89003.
36. Steimle BL, Smit FM, Kosman DJ. ZIP8 va ZIP14 erituvchi tashuvchilar miya mikrovaskulyar endotelial hujayralarida marganets to'planishini tartibga soladi va miya marganets darajasini nazorat qiladi. J Biol Chem. 2019; 294(50):19197–208.
37. Stins MF, Badger J, Sik Kim K. Transfektsion inson miyasi mikrovaskulyar endotelial hujayralarida bakterial invaziya va transsitoz. Mikrob patogen. 2001; 30(1):19–28.
38. Stamler D, Bredberi M, Vong C, Offman E. PBT434 ni inson o'rganishda birinchi bo'lib, sinuklein agregatsiyasining yangi kichik molekula inhibitori (S4.001). Nevrologiya. 2019; 92 (15 Qo'shimcha): S4.001.
39. Stamler D, Bredberi M, Vong C, Offman E. Kattalar va kattalar ko'ngillilarida Sinuklein agregatsiyasining yangi kichik molekula inhibitori PBT434 ning 1-bosqich tadqiqoti (4871). Nevrologiya. 2020; 94 (15 qo'shimcha): 4871.
40. Makkarti RC, Kosman DJ. In vitro qon-miya to'sig'i modeli tizimida qo'shni inson miyasi endoteliyasidan olingan interleykinlar tomonidan C6 glioblastoma hujayrasi seruloplazmin ifodasini faollashtirish. Hujayra aloqasi va signalizatsiyasi: CCS. 2014 yil; 12:65.
41. McCarthy RC, Park YH, Kosman DJ. sAPP temir temir eksportchisi ferroportinni barqarorlashtirish orqali miya mikrovaskulyar endotelial hujayralaridan temir oqimini modulyatsiya qiladi. EMBO hisobotlari. 2014 yil; 15(7):809–15. https://doi. org/10.15252/embr.201338064 PMID: 24867889
42. Hentze MW, Muckenthaler MU, Galy B, Camaschella C. Tangoga ikkita: sutemizuvchilar temir metabolizmini tartibga solish. Hujayra. 2010; 142(1):24–38. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.06.028 PMID: 20603012
43. Chjou ZD, Tan EK. Temirni tartibga soluvchi protein (IRP) - temirga sezgir element (IRE) insonning neyrodegenerativ kasalliklarida signalizatsiya yo'li. Molekulyar neyrodegeneratsiya. 2017; 12(1):75. https://doi.org/10. 1186/s13024-017-0218-4 PMID: 29061112
44. Crichton RR, Dexter DT, Ward RJ. Nevrologik kasalliklarda miyada temir almashinuvi va uning buzilishi. J Neural Transm. 2011; 118(3):301–14. https://doi.org/10.1007/s00702-010-0470-z PMID: 20809066
45. Patel SJ, Frey AG, Palenchar DJ, Achar S, Bullough KZ, Vashisht A va boshqalar. PCBP1-BolA2 chaperon kompleksi sitozolik [2Fe-2S] klaster yig‘ilishi uchun temirni yetkazib beradi. Nat Chem Biol. 2019; 15(9):872–81. https://doi.org/10.1038/s41589-019-0330-6 PMID: 31406370
46. Mukhopadhyay CK, Mazumder B, Fox PL. Temir tanqisligi bilan seruloplazminning transkripsiya faollashuvida gipoksiya qo'zg'atuvchi omil-1 roli. J Biol Chem. 2000; 275(28):21048–54.
47. Strowitzki MJ, Cummins EP, Taylor CT. Gipoksiyani qo'zg'atadigan omil (HIF) gidroksilazlari bilan oqsil gidroksillanishi: noyob yoki hamma joyda? Hujayralar. 2019; 8(5).
48. De Domeniko I, Vaughn MB, Li L, Bagley D, Musci G, Ward DM va boshqalar. Ferritin temirining ferroportin vositachiligida mobilizatsiyasi proteazoma tomonidan ferritinning parchalanishidan oldin sodir bo'ladi. Embo j. 2006; 25(22):5396–404.
49. Makkarti RC, Kosman DJ. Ferroportin va ekzositoplazmatik ferroksidaza faolligi miya mikrovaskulyar endotelial hujayra temirining chiqishi uchun talab qilinadi. Biologik kimyo jurnali. 2013 yil; 288(24):17932– 40.
50. Makkarti RC, Kosman DJ. BBB ning endotelial hujayralari tomonidan temir to'planishining mexanik tahlili. Biometallar. 2012; 25(4):665–75.
51. Kosman DJ. Eukaryotik temir va mis savdosida metallo-qaytarilish va metallo-oksidlanish telosi. Metallomika. 2018; 10(3):370–7. https://doi.org/10.1039/c8mt00015h PMID: 29484341
52. Aschemeyer S, Qiao B, Stefanova D, Valore EV, Sek AC, Ruwe TA va boshqalar. Ferroportinning strukturaviy-funksional tahlili gepsidinning bog'lanish joyini va muqobil ta'sir mexanizmini aniqlaydi. Qon. 2018; 131(8):899–910.
53. Ganz T, Nemeth E. Hepcidin va temir gomeostazi. Biochim Biophys Acta. 2012; 1823(9):1434–43.
54. Qiao B, Sugianto P, Fung E, Del-Castillo-Rueda A, Moran-Ximenez MJ, Ganz T va boshqalar. Ferroportinning gepsidin bilan induktsiyalangan endositozi ferroportinning ubiquitinatsiyasiga bog'liq. Hujayra Metab. 2012; 15(6):918–24.
55. Fung E, Chua K, Ganz T, Nemeth E, Ruchala P. Tioldan olingan minihepsidinlar biologik faollikni saqlaydi. Bioorg Med Chem Lett. 2015; 25(4):763–6.
Danielle K. BaileyID, Uitni Klark, Daniel J. Kosman
Jeykobs tibbiyot va biotibbiyot fanlari maktabi biokimyo boʻlimi, Buffalodagi Nyu-York shtat universiteti, Buffalo, NY, Amerika Qoʻshma Shtatlari
