Poli- va oligosakkarid Ulva Sp. Ferment yordamida ekstraksiyadan olingan fraksiyalar metabolizmni modulyatsiya qiladi 2

Iltimos, murojaat qilingoscar.xiao@wecistanche.comqo'shimcha ma'lumot uchun

3. Munozara

Bizning asosiy faoliyatimiz Ulon sp dan poli- va oligosakkarid fraksiyalarining potentsial biologik faolligini baholashdan iborat. Innovatsion ferment yordamida ekstraksiya (EAE) jarayonidan so‘ng olingan bo‘lib, bu ekstraksiya unumdorligini oshirishi [5] va inson terisida dermal fibroblastlarning metabolizmiga nisbatan maseratsiya [36] bilan solishtirganda ulvanlarning sezilarli qismini boyitish imkonini beradi. madaniyat.

Iltimos, ko'proq bilish uchun shu yerni bosing

Anabolik yo'lda (xususan, I va Ⅲ kollagenlar, GAG'lar va TIMP-1) va katabolik yo'lda (MMP-1) ishtirok etadigan teri hujayradan tashqari matritsa komponentlari (ECM) ifodasiga e'tibor qaratildi. proteomik va transkriptomik darajalarda. Ushbu ishda biz fraksiyalarning uglevodlar va uronik kislotalardagi yuqori tarkibi tufayli faollik ulvan (poli- va oligosaxaridlar) tarkibiga bog'liq deb taxmin qildik. Shunga qaramay, mualliflar Uloa sp.dan polisaxarid ulvanlarini e'tiborsiz qoldirmasliklari kerak. hujayra devori oqsillar bilan chambarchas bog'liq bo'lib, ular inson dermal fibroblastlarida in vitro umumiy kollagen va gialuron kislotasi ishlab chiqarishni rag'batlantirishi ham ma'lum [39]. Shunday qilib, mualliflar ushbu qo'lyozmada asosiy e'tibor ulvanlarga qaratilgan bo'lsa ham, bu harakatlar ulvanlar va oqsillar o'rtasidagi sinergiya bilan bog'liq bo'lishi mumkinligini ta'kidlaydilar. 3.1.EAE dan poli-va oligosakkarid Uloa fraksiyalarining ECM fibroblastlar metabolizmiga ta'siri

Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Uloa sp dan fraktsiyalar.Radiatsiyaga qarshi Cistanche ekstrakti(xom ulvanlar va past molekulyar og'irlikdagi ulvanlar) oddiy inson teri fibroblastlarining ko'payishini [36-38] modulyatsiya qilish qobiliyatiga ega. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, EAE ning poli- va oligosakkarid fraktsiyalari fibroblast metabolik faolligining sezilarli darajada oshishiga olib keldi (plyus 68 foizgacha). Ushbu natijalar mualliflarning [36] oldingi chop etilgan dastlabki ma'lumotlarini va 250 ug/ml gidrolizlangan Uloa ko'k yo'tal ekstrakti bo'yicha oldingi ishlarni tasdiqladi, bu esa sezilarli darajada oldingi va qarigan fibroblast proliferatsiyasini keltirib chiqardi [38]. Metabolik faollikning oshishi fraksiyalarning sitotoksik ta'siri bilan birga bo'lmadi (LDH tahlili bilan baholanadi), bu EAE poli- va oligosakkarid Uloa fraktsiyalarining bioaktivligi natijalari sinovdan o'tgan kontsentratsiyalar oralig'ida sitotoksik ta'sirga bog'liq emasligini anglatadi. Bizning natijamiz ulvanlarni turli xil hujayralar (makrofag hujayralari, ichak hujayralari, fibroblastlar, sichqoncha hujayralari va Vero hujayralari) sitotoksik bo'lmagan birikmalar sifatida ta'kidlagan oldingi tadqiqotlarga muvofiqdir [13,14,4]

cistanche qarishga qarshi bo'lishi mumkin

Kirish qismida aytib o'tilganidek, I va III turdagi kollagenlar va GAGlar dermisda ECM yig'ilishi uchun molekulyar tarmoqni yaratish uchun birgalikda o'zaro ta'sir qiladi. Shunday qilib, ushbu tadqiqotda poli- va oligosakkarid Ullon sp. ishtirokida dermis ECM asosiy komponentlarining (I va Ⅲ kollagenlari va GAGs yoki sulfatlangan va sulfatlanmagan) oqsil sintezi va mRNK darajasidagi ifodasi o'rganildi. EAE dan fraktsiyalar. Bundan tashqari, I-toifa kollagen degradatsiyasida ishtirok etuvchi asosiy ferment (EKM katabolizmi yo‘li) MMP-1 va uning regulyatsiyasida ishtirok etgan to‘qima inhibitori TIMP-1 ham oqsil va mRNK darajasida baholandi.

Natijalar shuni ko'rsatdiki, EAE dan poli- va oligosakkarid Ulva fraktsiyalari umumiy kollagen sintezini 1000 ug/ml ga oshirgan (Qizil sirius tahlili bilan baholangan plyus 2 foizgacha va DEP-AD PP-UEdan tashqari muhim natijalar). Bu natijalar xom furgonlar va past molekulyar og'irlikdagi ulvanlar umumiy kollagen sinteziga sezilarli ta'sir ko'rsatmagan oldingi tadqiqotdan farq qiladi [37]. Biroq, bizning natijalarimiz oldingi ishlarga mos keladi, bu Klebsiella pneumonia shtammlaridan L-ramnozga boy polisakkarid preparatlari (ROP) kollagen sintezini rag'batlantirishini ko'rsatdi [45]. Darhaqiqat, inson teri fibroblastlarida -L-ramnozni taniy oladigan lektin joyi mavjud [46]. Shunday qilib, ulvan fraksiyasining ramnoz qismi inson dermal fibroblasti tomonidan tan olinishi va keyin kollagen sintezini rag'batlantirishi mumkin. Xususan, ELISA (UE va DS-UE uchun muhim) va Western blot tahlillarida (NS) barcha fraktsiyalar uchun I turdagi kollagen sintezi oshdi. Bu natija gidrolizlangan Ulva ko'k yo'tal ekstrakti [38] va depolimerizatsiyalangan galaktofukanlar bo'yicha oldingi adabiyotlarga mos keladi.<10kda)from saccharina="" longicruris[47]="" which="" respectively="" increased="" the="" synthesis="" of="" type="" i="" pro="" and="" mature="" collagen.="" in="" our="" study,="" steady-state="" levels="" of="" col1al="" and="" col1a2="" were="" reduced="" after="" exposure="" to="" poly-and="" oligosaccharide="" ulva="" fractions(significant="" for="" col1a1="" at="" 1000="" ug/nnl="" for="" all="" fractions).expression="" in="" coordinated="" manner="" of="" col1al="" and="" col1a2="" genes="" complies="" with="" the="" fact="" they="" are="" both="" subunits="" of="" type="" i="" collagen="" protein="" [48].="" regulation="" between="" type="" i="" collagen="" protein="" production="" and="" mrna="" are="" different="" at="" the="" same="" observation="" time="" of="" 48="" h,="" which="" suggests="" a="" different="" potential="" time="" response="" regulation="" between="" protein="" and="" mrna[49].="" nevertheless,="" protein="" is="" the="" functional="" unit="" in="" ecm="" and="" exhibits="" an="" important="" increase="" after="" treatment="" with="" ulvans-derived="" eae="" fractions.="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" was="" increased="" (significantly="" for="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 1000="" ug/ml)="" and="" correlated="" to="" an="" ns="" increase="" of="" type="" iii="" collagen="" synthesis="" evaluated="" by="" wb.="" moreover,="" the="" results="" showed="" that="" polysaccharide="" uloa="" fractions="" from="" eae="" (ue="" and="" ds-ue)="" boosted="" significantly="" gags(sulfated="" and="" non-sulfated)="" synthesis="" at="" 1000="" ug/ml,="" while="" both="" oligosaccharide="" fractions="" had="" no="" effect.="" our="" observations="" are="" in="" partial="" accordance="" with="" the="" work="" of="" adrien="" etal.="" (2017)="" in="" which="" the="" increase="" in="" hyaluronic="" acid="" production="" in="" fibroblasts="" occurred="" with="" both="" ulvans="" extracts="" (crude="" and="" low="" molecular="" weight="" ulvans)="" [37].="">cistanche o'tDarhaqiqat, bizning tadqiqotimizda past molekulyar og'irlikdagi ulvanlar GAG ishlab chiqarishga ta'sir qilmadi (shu jumladan sulfatlanmagan GAG gialuron kislotasi).

Terining qarishi ECM komponentlarining nomutanosibligi (I va II turdagi kollagen va GAG darajasining pasayishi), Uloa sp.dan olingan poli- va oligosakkarid fraktsiyalari bilan tavsiflanganligi sababli. EAE davolashdan keyin qarishga qarshi strategiyalar qiziqish uyg'otadi, chunki ular I va III turdagi kollagenlarni va GAG sintezini rag'batlantiradi.

Biroq, bizning natijalarimiz poli-va oligosakkarid Uloa EAEdan olingan fraktsiyalar mavjudligida MP-1 sintezi, faolligi va gen ekspressiyasining o'sishini ham ta'kidladi. MMP-1 mRNK darajasining oshishi Ulondan olingan EAE fraksiyalari ishtirokida MMP-1 sintezining ortishi va polisakkarid fraksiyalari (UE va DS-UE) uchun sezilarli darajada oshishi bilan bog‘liq edi. MMP ning ko‘tarilishi. -1 ferment sintezi fraktsiyalar mavjudligida MMP-1 faolligining sezilarli bo'lmagan o'sishi bilan ham bog'liq. Natijamiz avvalgi adabiyotlardan farq qiladi, chunki gidrolizlangan Uloa koʻk yoʻtal ekstrakti qarigan fibroblastlarda[38] MMP-1 ifodasi va sekretsiyasini inhibe qilgan yoki fukoza oʻz ichiga olgan polisaxaridlar (fukoidanlar deb ataladi) UVB taʼsirida MMP-1 ifodasini inhibe qilgan. inson terisi fibroblastlarida [50]. Biroq, bizning natijamiz FRioux va boshqalarning tadqiqotiga mos keladi. (2013), chunki xom galaktofukanlar (638-1529 kDa) 6 kun davomida davolangan fibroblastlarning umumiy katalitik faolligi MMP (jumladan, MMP-1)ni oshirdi[47]. MMP darajasini oshirish haqidagi ma'lumotlarimiz ham Andres va boshqalarning ishlariga mos keladi. (2006), chunki RROPlar (Klebsiella pneumonia va K.planticola shtammlaridan olingan ramnozga boy oligo- va polisakkarid preparatlari) MMP-9 ifodasini kuchaytiradi [45]Kengaytirilgan MMP-1 sintezi odatda ECMning pasayishiga olib keladi. MMP-1 degradativ faolligi tufayli I turdagi kollagen kabi komponentlar miqdori ko'paygan, ammo bu bizning tadqiqotimizda ko'rsatilmagan, chunki I turdagi kollagenning ko'payishi sodir bo'lgan. Bundan tashqari, Uloa EAE-dan olingan fraktsiyalar mRNK ifoda darajasiga va MP{30}} to'qimalarining inhibitori bo'lgan TIMP-1 oqsil ishlab chiqarishiga (DEP-HD PP-dan tashqari) hech qanday ta'sir ko'rsatmadi (NS ortishi yoki kamayishi). Proteinning sezilarli o'sishi bilan UE, p<0.05,at 1000="" μg/ml）.it="" appears="" that="" the="" anabolic/catabolic="" balance="" of="" ecm="" could="" be="" in="" favor="" of="" collagen="" synthesis="" despite="" mmp-1="" synthesis="" stimulation="" and="" activity.="" in="" this="" study,="" the="" authors="" thus="" showed="" that="" both="" poly-="" and="" oligosaccharide="" fractions="" derived="" from="" ulloa="" sp.="" after="" eae="" treatment="" are="" promoting="" fibroblast="" metabolism="" activity,="" ecm="" protein="" synthesis,="" and="" skin="" matrix="" renewal="" and="" remodeling,="" which="" is="" of="" interest="" for="" dermo-cosmetic="" applications="" in="" anti-aging="">

3.2.Ulvanning ko'pligi, sulfat tarkibi va molekulyar og'irligining ECM fibroblast modulyatsiyasidagi roli

Ulvonlarning sulfatlanish darajasi, sulfatlanish tartibi, monosaxaridlar tarkibi, glikozidlar bogʻlanishlari, shoxlanish darajasi hamda molekulyar ogʻirligini oʻz ichiga olgan tuzilish xususiyati uning biologik faolligiga taʼsir qilishi maʼlum [10,1,37,40,44,51. ].

Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, polisaxaridlar yoki oqsil kabi bioaktiv birikmalarning molekulyar og'irligi uning fibroblast proliferatsiyasi va ECM modulyatsiyasiga ta'siri uchun asosiy omil bo'lib ko'rinadi [37,39,47]. Bizning tadqiqotimizda yuqori molekulyar og'irliklarga ega (Mw > 670 kDa) polisakkarid fraktsiyalari, UE va DS-UE fibroblast proliferatsiyasini oshirdi. Garchi oligosakkarid fraktsiyalari (Mw<10 kda)="" also="" raise="" fibroblast="" proliferation,="" a="" dep-ad="" pp-ue="" fraction="" with="" lower="" molecular="" weight="" (mw="" of="" 1.5="" kda)="" has="" lower="" activity="" than="" dep-hd="" pp-ue="" (mw="" of="" 8="" kda).="" similar="" results="" were="" obtained="" on="" fibroblasts="" treated="" with="" rrops,="" since="" lower="" rrops="" exhibited="" similar="" or="" lower="" proliferation="" activity="" compared="" to="" higher="" mw="" rrops[45].="" polysaccharide="" fractions="" treatment="" also="" enhanced="" gags="" synthesis,="" total="" and="" especially="" type="" i="" and="" iii="" collagen="" synthesis,="" mp-1="" synthesis="" by="" human="" skin="" fibroblasts,="" whereas="" oligosaccharide="" fractions="" (low="" molecular=""><10 kda)="" and="" in="" particular="" dep-ad="" pp-ue="" (1.5="" kda)="" have="" lower="" capacities.="" only="" dep-hdpp-ue="" stimulated="" significatively="" total="" collagen="" synthesis="" and="" mp-1="" synthesis,="" while="" dep-ad="" pp-ue="" with="" lower="" molecular="" weight="" had="" no="" significant="" boost="" effect.="" these="" results="" are="" in="" accordance="" with="" work="" of="" kidgell="" et="" al.="" (2020)="" where="" higher="" molecular="" weight="" ulvan="" fractions="" elicited="" a="" greater="" biological="" activity="" (immunomodulatory="" response)="" compared="" to="" lower="" mw="" van="" fractions[44].="" these="" results="" are="" also="" in="" agreement="" with="" work="" of="" bodin="" et="" al.="" (20),="" since="" enzymatic="" hydrolyzed="" proteins="" from="" uloa="" intestinalis="" did="" not="" stimulate="" ecm="" material="" biosynthesis="" (collagen="" and="" hyaluronic="">

Mualliflarning ta'kidlashicha, GAG sintezidagi yaxshi bioaktivlik sulfatlangan polisaxaridlarning xom ulvanlarda boyitilgan yuqori molekulyar og'irlikdagi fraktsiyalari bilan bog'liq. Bu sulfatlardagi ulvanlarning ichki tarkibi va uning molekulyar og'irligi bilan bog'liq bo'lishi mumkin, chunki oligosakkarid Ulva sp. sulfatlardan qisman to'liq xoli bo'lgan fraktsiyalar GAG sintezini rag'batlantirish qobiliyatiga ega emas.cistanche jinsiy olatni o'sishiYana bir tadqiqot Ulku sp. kimyoviy sulfatlangan Alvan fraktsiyasi, mahalliy polisakkariddan ikki baravar ko'paygan sulfat miqdori, kuchli antikoagulyant faollik [10]Bundan tashqari, DS-UE GAG, umumiy va I turdagi va Ⅲ kollagenga nisbatan ko'proq ECM modulyatsiyasini oshirdi. sintez, UE bilan solishtirganda. Bu yaxshi bioaktivlik boshqa fraksiyalar bilan solishtirganda dializ qilingan fraksiyadagi ulvanlarning ko'pligi va ko'proq sulfat guruhlari bilan bog'liq bo'lishi mumkin.

Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatdiki, poli-va oligosakkarid Uloa sp. fraksiyalari turli xil metabolik faollikni namoyon qildi, bu ulvanning ko'pligi, uning sulfatlanish darajasi va kimyoviy tuzilishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Bu ish, shuningdek, sulfat guruhlarini ko'rsatadigan yuqori molekulyar og'irlikdagi furgonlar uchun yaxshiroq faoliyatni ta'kidladi. Xom ulvanlarga boy polisakkarid fraktsiyalari (ya'ni, depolimerizatsiyalanmagan) ECM fibroblast metabolizmiga eng katta ta'sir ko'rsatishi kelgusi tadqiqotlar va uni dermo-kosmetik parvarishda kelajakda qo'llash uchun idealdir, chunki minimal qayta ishlash ishlab chiqarish xarajatlari va vaqtini kamaytiradi.

4. Materiallar va usullar

4.1.Makroalgal material

Yashil dengiz o'tlari, Ulva sp. (Chlorophyta, Ulvales, Ullvaceae) 2018-yil 28-may kuni tushdan keyin suvning pastligida Sarzo shahridagi (Brittaniya, Fransiya) Landrezac (47 daraja 30 daraja 17,9" N daraja 2 daraja 42 daraja 37,1" O) interyer plyajidan olingan. Materiallar musluk suvi bilan yuvilib, diametri 3 mm gacha maydalangan, -25 darajada muzlatilgan, muzlatilgan holda quritilgan (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Germaniya) va xonada saqlangan. qorong'uda harorat.

4.2.Poli-va oligosaxarid fraksiyalarining olinishi va xarakteristikasi

Fourniere va boshqalarning oldingi ishida. (2019), Ferment yordamida ekstraksiyadan (EAE) poli- va oligosakkarid fraktsiyalarini ishlab chiqarish batafsil tavsiflangan (9-rasm va 3-jadvalga qarang)[36].

Qisqacha xulosa qilish uchun Protamex [(Novozymes, Bagsverd, Daniya) endo-proteazasi quritilgan Uloa sp. dengiz o'tlari. Enzimatik gidroliz 50 daraja 3 soat davomida amalga oshirildi. Keyin, suvli ekstrakt xom ulvanlarga (UE) boy fraktsiyani olish uchun 244 soat davomida 4 darajada etanolik cho'kma (1: 5, v Fisher Scientific, Ilkirch, Frantsiya) o'tkazildi.

Keyin DS-UE fraksiyasi xom Evansga (10 mg/ml) boy fraksiyani 7 kun davomida 4 daraja (kesish 12-14 kDa, Spectra/Por94 dializ membranasi, Spectrum Laboratories, Fisher Scientific) dializidan so'ng ishlab chiqarildi. , Ilkirch, Frantsiya).

Ikki depolimerizatsiya protsedurasi (H-OZ bilan radikal depolimerizatsiya va ion almashinadigan qatronlar depolimerizatsiyasi) xom ulvanlarga boy fraktsiyadan (25 mg / ml) etanolik cho'kma eritmasida amalga oshirildi. Radikal depolimerizatsiya uchun vodorod peroksid (8 foiz, v/v) , Fisher Scientific, Ilkirch, Fransiya) 50 daraja haroratda 24 soat davomida eritmaga aralashtirildi va mahsulot 4 daraja haroratda 48 soat dializdan o‘tkazildi (kesish 500-1000 Da, Biotech CE Tubing). , Spectra/Por@, Fisher Scientific, IIllkirch, Fransiya). Kislotali depolimerizatsiya uchun Amberlite "FPC23H" qatroni (10 ml ekvivalenti, Sigma-Aldrich, Sent-Kventin Fallavier, Frantsiya) 80 darajada 24 soat davomida eritma bilan aralashtiriladi va mahsulot 48 soat davomida NaOH (0,1 va 1 M) bilan neytrallanadi. 4 daraja dializ (kesish 500-100 Da, Biotech CE Tubing, Spectra/Por", Fisher Scientific, Illkirch, Frantsiya).Cistanche salsa foydalariUshbu ikki protsedura H2OZ uchun DEP-HD PP-UE va DEP-AD PP-UE deb nomlangan oligosakkarid fraktsiyalariga va mos ravishda kislotali qatronlar protsedurasiga olib keldi.

Barcha fraktsiyalar muzlatilgan quritilgan (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanla-gen GmbH, Osterode am Harz, Germaniya) va tahlil qilishdan oldin 4 daraja haroratda saqlangan. Ushbu fraksiyalarning tavsifi: yuqori bosimli o'lchamli eksklyuziv xromatografiya (HPSEC, UHPLC Ultimate 300, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AQSH), biokimyoviy tarkibi, pulsatsiyalanuvchi anion almashinadigan kromatografiya bilan yuqori samarali monosaxaridlar tarkibi bo'yicha polisaxarid molekulyar og'irligini taqsimlash aniqlash (HPAEC-PAD, Dionex" ICS-5000* DC, Thermo Fisher Scientific, Illkirch, Fransiya) va matritsa yordamida lazerli desorbsiyani ionlash - parvoz massa spektrometriyasi (MALDI-TOF, Bruker, Billerica, Waltham, MA) , AQSh) oldingi tadqiqotda ham o'tkazilgan [36].

4.3.Hujayra madaniyati

Inson dermal fibroblast namunalari "Laboratoire Interactions Ep-itheliums Neurones" (LIEN, EA 4685), Brest, Frantsiya tomonidan taqdim etilgan. Inson terisi namunalari abdominoplastika operatsiyasidan o'tgan sog'lom donorlarning teri biopsiyalaridan olingan. Tadqiqot Xelsinki deklaratsiyasiga muvofiq o'tkazildi va barcha bemorlar xabardor qilingan rozilik kelishuv shaklini imzoladilar. Namuna to'plamlari mahalliy kelishuv komissiyasiga ("Comite de protect des personnes" Ouest VI) rioya qilingan va DC 2016-2833 ostida havola qilingan.

Oddiy inson teri fibroblastlari (NHDF) Dulbecco modifikatsiyalangan burgut muhitida (DMEM, Lonza, Bazel, Shveytsariya) 10% (v/v) homila sigir zardobida (FBS, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Fransiya) yetishtirildi. ), 1 foizli antibiotik eritmasi (v/v) (Penitsillin, Streptomisin 10, 000 U/ml, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Fransiya) va 1 foiz antifungal (v/v) (Fungizon, amfoterisin) B, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Frantsiya), 37 daraja haroratda 5 foiz CO2 bo'lgan harorat bilan boshqariladigan inkubatorda (Forma Steri-Cyclei160, Thermo Fisher Scientific Langenselbold, Germaniya). Hujayralar qo'shilish joyiga yetgandan so'ng tripsinizizatsiya (0,05 foiz) va EDTA (etilendiamintetraasetik kislota) eritmasi ((Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Fransiya) orqali subkultura qilindi. Barcha tajribalar 3 va 8-bo'laklar orasida o'tkazildi.

Hujayralar WST-1 va LDH (laktat dehidrogenaza) tahlillari uchun 96-quduqlar uchun 400 hujayra zichligidagi mikroplastinkalarga, 5{{8} zichlikdagi 12-quduq plastinkalariga ekilgan. Red sirius va Blue Alcian bo'yash va RT-qPCR tahlili uchun }} hujayralar/quduq va Elishay va Western blot tahlillari uchun 6-quduq plitalari 200 000 hujayra/quduq zichligida.

Barcha tajribalarda, 80 foiz konsentratsiyaga erishgandan so'ng, hujayralar DMEMda 2 foizli FBS bilan poli- va oligosakkarid fraktsiyalari mavjud bo'lmaganda yoki mavjud bo'lmaganda 48 soat davomida 50 va 1000 ug / ml da inkubatsiya qilindi.

4.4.WST-1 Hujayra proliferatsiyasi tahlili

WST-1, in vitro, tahlil tetrazoliy tuzi WST-1 (4-[3-(4-lodofenil){{5) ning konversiyasiga asoslangan. }}(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzol disulfonat) hujayra mitoxondrial dehidrogenazalari yordamida formazanga (apelsin boʻyoq) aylanadi. Rang o'zgarishi madaniyatdagi hujayralarning hayotiyligi va ko'payishi bilan to'g'ridan-to'g'ri proportsionaldir.

48 soatlik inkubatsiyadan so'ng muhit olib tashlandi va 100 uL WST{2}} reaktivi (WST-1 hujayra proliferatsiyasi to'plami, Roche Diagnostics, Meylan, Frantsiya; DMEMda 2 foizli FBS bilan 1:40 suyultirish) olindi. har bir quduqqa qo'shiladi. 5 foiz CO2 bilan 37 daraja haroratda 45 daqiqa inkubatsiyadan so'ng absorbans 450 da 630 nm ga qarshi mikroplata o'quvchi (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlyandiya) bilan o'lchandi. 4.5.LDH Sitotoksiklik tahlili

LDH sitotoksisitesi tahlili laktat dehidrogenaza (LDH) ni o'lchashga asoslangan bo'lib, u hujayra lizisida ajralib chiqadigan barqaror sitozolik ferment hisoblanadi. Madaniy supernatantlarda chiqarilgan LDH tetrazolium tuzini (iodonitrotetrazolium violet) qizil formazan mahsulotiga aylantirish orqali o'lchanadi.Cistanche tubulosa dozasi RedditO'lchangan qizil formazan miqdori lizizlangan hujayralar soniga proportsionaldir.

LDH tahlili (CytoTox96@, Promega, Madison, WI, AQSh) yetkazib beruvchi ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi. Ijobiy nazorat (LDH maksimal chiqishi) CytoTox969 reaktivini qo'shishdan oldin 45 daqiqa davomida 1{4}} uL lizis eritmasi 10×(Triton X-100 0,8 foizda) qo'shilishi orqali amalga oshirildi. Inkubatsiyadan so'ng, 50 mkl hujayra madaniyati supernatanti yangi 96-quduq mikroplakaga (steril bo'lmagan) o'tkazildi. Keyin 50 mL CytoTox96 daraja reaktivi qo'shildi. Mikroplastinka qorong'i joyda xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Keyin reaksiya 50 mkL "Stop eritmasi" qo'shilishi bilan to'xtatildi. LDH chiqishi 490 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlyandiya) mikroplata o'quvchi bilan absorbans miqdorini aniqlash orqali o'lchandi.

4.6.Glikozaminoglikanlar miqdorini aniqlash uchun Alcian Moviy bo'yash

Alcian ko'k rang berish - bu ikki turdagi glikozaminoglikanlarni (GAG) miqdorini aniqlashga imkon beruvchi rang berish usuli: sulfatlangan (geparan sulfat, keratan sulfat, xondroitin sulfat va dermatan sulfat) va sulfatlanmagan (gialuron kislotasi). PH 1 da alcian ko'k eritmasi sulfatlangan GAGlarni, pH2,5 dagi eritma esa sulfatlanmagan GAGlarni bo'yadi.

Inkubatsiya oxirida madaniy muhit olib tashlandi va hujayralar ikki marta PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, Irance) bilan yuvildi. Keyin hujayralar 5 daqiqa davomida 0.1N HCl (pH1, Fisher Scientific, Ilkirch, Fransiya) yoki 3M sirka kislotasi (pH2,5, Fisher Scientific, Ilkirch, Fransiya) bilan pH va pH darajasini pasaytirish uchun yuvildi. mos ravishda sulfatlangan va sulfatlanmagan glikozaminoglikanlarni aniqlang. Keyin hujayralar 30 daqiqa davomida HC10.1N eritmasida (pH1) yoki 3 foizli sirka kislotasi eritmasida (pH2.5) 1 foizli Alcian Blue (8GX, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Frantsiya) bilan bo'yalgan. Hujayralar ikki marta musluk suvi bilan 5 daqiqa davomida yuviladi, kaput ostida quritiladi va 5 daqiqa davomida distillangan suv bilan yuviladi. Keyin, bog'langan bo'yoq 6M guanidin gidroxlorid eritmasi (Sigma-Aldrich, Sent-Kventin Fallavier, Frantsiya) bilan 5 daqiqa davomida xona haroratida aralashtirib eriydi. Rangli eritma yangi 96-quduq mikroplastinasiga o‘tkazildi va absorbansni o‘qish 600 nm da amalga oshirildi (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlyandiya).

4.7.To'liq kollagen miqdorini aniqlash uchun qizil Sirius bo'yash

Qizil Siriusni bo'yash jarayoni umumiy kollagen miqdorini aniqlash imkonini beradi. Pikrosirius qizil, oltita sulfonat guruhini o'z ichiga olgan kuchli chiziqli anion bo'yoq, kationik kollagen tolalari bo'ylab birlashadi.

Inkubatsiyadan so'ng madaniyat muhiti olib tashlandi va hujayralar ikki marta PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, Frantsiya) bilan yuvildi. Keyin har bir quduqqa 1 ml Bouin eritmasi Gigma-Aldrich, Sent-Kventin Fallavier, Frantsiya) qo'shildi va hujayralar xona haroratida 1 soat davomida bo'yalgan. Keyin hujayralar ikki marta distillangan suv bilan yuviladi va qopqoq ostida quritiladi. Hujayralar 1 ml Red Sirius eritmasi (Sirius Red 80 suvli to'yingan pikrik kislota eritmasi, Sigma-Aldrich, Sent-Kventin Fallavier, Frantsiya) bilan 1 soat davomida bo'yalgan. Bo'yashdan keyin eritma olib tashlandi va hujayralar ketma-ket distillangan suv va HC10.01N bilan yuvilib, bog'lanmagan bo'yoqni olib tashladi. Bog'langan bo'yoq 30 daqiqa davomida NaOH0,1N bilan eriydi. Rangli eritma yangi 96-quduq mikroplatasiga o‘tkazildi va 550 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlyandiya) da absorbsiyani o‘qish o‘tkazildi. 4.8.I-toifa kollagen va MMP-1 Elishay

Inkubatsiyadan so'ng hujayralar PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, Frantsiya) bilan ikki marta yuvildi. Fibroblastlar proteaz inhibitör kokteyli (Sigma-Aldrich, Sent-Kventin Fallavier, Fransiya) bilan to'ldirilgan RIPA (radioimmunopresipitatsiya tahlili) buferida (Sigma-Aldrich, Sent-Kventin Fallavier, Frantsiya) 1 soat davomida 4 daraja lizislangan. Hujayralar qirib tashlangan va namunalar 30 daqiqa davomida vortekslangan va santrifüj qilingan (4 daraja 30 daqiqa davomida 12,{7}}xg). Hujayra ichidagi oqsillarni o'z ichiga olgan supernatantlar to'planib, so'ngra oqsilni aniqlash va Western blot tahlili uchun tahlil qilinmaguncha -80 darajada saqlanadi. Protein kontsentratsiyasi Pirs BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AQSh) tomonidan standart sifatida sigir zardobi albumini (BSA) yordamida aniqlangan.

Hujayra madaniyatining supernatanti yig'ildi va hujayra qoldiqlarini olib tashlash uchun santrifüj qilindi (4 daraja haroratda 10 daqiqa davomida 200 × g) va tahlil qilinguncha -80 darajada saqlanadi.

I-toifa kollagen va MMP{0}} o‘lchovlari ishlab chiqaruvchi ko‘rsatmalariga muvofiq Abcam to‘plamlari (ab210966 Human Pro-Collagen I alpha 1 SimpleStep ELISA Kit va ab215083 Human MMP1 SimpleStep ELISA Kit, Kembrij, MA, AQSh) bilan madaniy muhitda baholandi. . Absorbsiya 450 nm da mikroplastinka o'quvchi bilan o'lchandi (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlyandiya). Natijalar avval aniqlangan hujayra oqsillari konsentratsiyasi bilan normallashtirildi. 4.9.Western BlotProtein namunalarini olish avvalgi 4.8-bo'limda tasvirlangan. Laemmli buferli oqsil namunalari (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frantsiya) 95 daraja haroratda 5 daqiqa qaynatiladi va keyin 16, 000 × g haroratda 1 daqiqa davomida santrifüj qilindi. Teng miqdorda oqsil (10 ug) 7,5 foiz yoki 4-15 foiz TGX bo‘yoqsiz gel (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Fransiya) va Precision Plus Protein “bo‘yalmagan oqsil” quduqlariga tushirildi. standart (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Fransiya) Jel ​​200 V kuchlanishda 30 daqiqa davomida ishladi (PowerPac"Basic with Mini-PROTEAN Tetra System, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Fransiya). Proteinni jeldan mini PVDF (poliviniliden ftorid) membranasiga (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frantsiya) o'tkazish Trans-Blot Turbo Transfer tizimi (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frantsiya) yordamida amalga oshirildi. ).Membrana TBST (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Fransiya) da 3 foizli BSA Gigma-Aldrich, Sent-Kventin Fallavier, Fransiya) yoki 5 foizli yog‘siz quruq sut bilan 1 soat davomida xona haroratida va TBST bilan yuviladi. Membrana I turdagi kollagen (Novotec, Reuver, Niderlandiya), III turdagi kollagen (Novotec, Reuver, Niderlandiya), MMP-1 (EnoGene, Nyu-York, NY, AQSH) yoki TIMP{{43} bilan tekshirildi. }}(RayBiotech, Peachtree Corners, GA, AQSH) antikorlari; keyin, u TBST bilan bir necha marta yuvilgan va ikkilamchi peroksidaza bilan konjugatsiyalangan antikorlar bilan xona haroratida 1 soat davomida inkubatsiya qilingan (Jekson ImmunoResearch, Ely, Buyuk Britaniya). Keyin G'arbiy ECL substrati (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frantsiya) aniqligi edi. membranalarga 5 daqiqa davomida qo'llangan va vahiy ChemiDoc XRS plus Molecular Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frantsiya) yordamida amalga oshirilgan. Protein darajasi ImageLab v6.01.1 dasturi yordamida aniqlangan.

4.10.Zimografiya

Inanc va boshqalarga ko'ra kollagenaz MMP-1 faol shaklini tahlil qilish uchun zimografiya o'tkazildi. (2017) moslashtirilgan usul [52].

SDS-PAGE jellari (10% poliakrilamid, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Fransiya) 1 mg/ml I turdagi kollagen kalamush dumi Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Fransiya) bilan sopolimerlangan. Protein namunalar (5 ug) kamaytirmaydigan namuna buferi (62,5 mM Tris HCl pH 6,8,20 foiz glitserin, 4 foiz SDS, 0,01 foiz bromofenol ko'k) bilan aralashtirildi, 1 daqiqa 4 daraja santrifüj qilindi, quduqlarga yuklandi. gel, Precision Plus Protein bilan birgalikda barcha Blue standartlari (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Fransiya) va keyin 2 soat davomida 4 daraja 110 V da elektroforezlangan gel ikki marta 2,5 foiz Triton X{{26 SDSni olib tashlash uchun har safar }} (v/v) 15 daqiqa davomida. Keyin, gel Zimogram rivojlanish buferida (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frantsiya) 48 soat davomida 37 daraja haroratda inkubatsiya qilindi. , jel 1 soat davomida 0,5 foizli Coomassie Blue R-250 (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Fransiya) eritmasi (h/v) bilan bo‘yalgan va keyin 40 foizli metanol va 10 foiz muzlik sirka kislotasida bo‘yalgan. yechim (Sigma-Aldrich, Sent-Kventin Fallavier, Fransiya).MMP-1 faolligi Coomassie koʻk rangli jel fonida aniq chiziq sifatida aniqlandi. Miqdori ChemiDoc XRS plus Molecular Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Fransiya) da Image Lab 6.01.1 versiyasi (Bio-Rad) bilan amalga oshirildi. 4.11.RNK izolyatsiyasi va real vaqtda RT-PCR

48 soatlik inkubatsiyadan so'ng umumiy RNK TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, AQSH) va xloroform (Acros Organics, Fisher Scientific, Illkirch, Fransiya) bilan ekstraksiya qilindi, izopropanol bilan cho'ktirildi (Fisher Scientific, Illkirch, Frantsiya), etanol bilan yuvildi75 foiz , DEPC (dietilpirokarbonat) bilan ishlangan suvda qayta suspenziya qilishdan oldin qopqoq ostida quritiladi (Fisher Scientific, IIlkirch, Frantsiya). RNK miqdori va tozalik darajasi (1,8 va 2.0 oralig'ida) mikroplastinka o'quvchida (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlyandiya) 260 va 280 nm da drop TM Plate (Thermo Fisher) yordamida absorbans o'lchovi bilan baholandi. Science, Waltham, MA, AQSH).

Bir mikrogram umumiy RNK DNK ifloslantiruvchi moddalarni olib tashlash uchun DNaseI (iScript Dnase Master Mix, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frantsiya) bilan 5 daqiqa davomida 25 darajadan ishlov berildi. Ferment 75 daraja haroratda 5 daqiqa davomida faolsizlantirildi.

Teskari transkripsiya iScript teskari transkripsiya (RT) Supermix (Bio-rad, Marnes-La-Coquette, Frantsiya) yordamida avval DNase I bilan ishlov berilgan jami RNKning 1 ug bo'yicha amalga oshirildi. cDNa sintezi uchun keyingi bosqichlar 25 gradusda 5 minut edi. 46 gradusda 20 minut, 95 gradusda 1 minut.

Shablon bo'lmagan boshqaruv elementlari PCR tajribalariga kiritilgan. qPCR 96-quduq plastinkalarida jami hajmi 2{28}} mkL boʻlgan RT dan olingan 1 uL 1∶15 suyultirilgan cDNK namunasi, 1 mkl primer (qarang. 4-jadval, Bio-Rad, Marnes) -La-Coquette, Fransiya）, 10 mkl iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Fransiya) va 8 mkl yadrosiz suv. Kuchaytirish shartlari 95 gradusda 2 minut, keyin 95 gradusda 5 soniyadan 40 ta tsikl va 60 gradusda 30 soniyadan iborat bo'lib, erish egri chizig'i protokoli oldidan 95 gradusda 5 soniya va 65 gradusda 5 soniya bilan tugaydi: 65 darajadan 0,5 darajaga ko'tariladi. 95 daraja. PCR tajribalari CFX 96 tizimida (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frantsiya) o'tkazildi va natijalar Bio-Rad CFX Manager v3.1 dasturidan (Marnes-La-Coquette, Frantsiya) to'plandi. mRNK miqdori RPL13A mRNK ga normallashtirildi va nisbiy gen ifodasi tahlili 2-AACt usuli yordamida hisoblandi.

4.12. Statistik tahlil

Barcha qiymatlar o'rtacha n tajriba ± standart xato (SE) sifatida ifodalangan.

Statistik tahlillar Addinsoft (2020) yordamida amalga oshirildi. Ma'lumotlarning normal taqsimlanishini baholash Shapiro-Uilk testi yordamida baholandi. Nazorat va eksperimental namunalar o'rtasidagi sezilarli farqlar normal taqsimot sodir bo'lganda Student's-t-test (mustaqil, ikki tomonlama) va normal taqsimot rad etilganda Mann-Whitney testi bilan tahlil qilindi. Statistik test bo'yicha nazorat bilan solishtirganda sezilarli farqlar yulduzcha bilan ko'rsatilgan (*p<><0.01 and=""><0.001). differences="" that="" are="" not="" statistically="" significant="" are="" named="" "ns"="" in="" the="" text="" and="" are="" characterized="" by="" the="" absence="" of="" asterisks="" on="" the="">

5. Xulosalar

Bu ish shuni ko'rsatadiki, Uloa sp.dan yashil yangi EAE texnologiyasidan so'ng ulvanlar bilan boyitilgan poli- va oligosakkarid fraktsiyalari fibroblastlarning ko'payishiga, ECM oqsilining sinteziga, matritsaning yangilanishiga va qayta tuzilishiga ta'sir qiladi. Kosmetik qarishga qarshi strategiyalarda potentsial qo'llanilishi mumkin, chunki terining qarishi kollagen sintezining pasayishi bilan tavsiflanadi. Shunday qilib, teri matritsasi yangilanishi bu kontekstda foydalidir. Shunday qilib, ulvanlar, Ulva sp.dan. EAE dan so'ng olingan fraktsiyalar inson terisi fibroblastlari metabolizmida biologik faoldir. Mualliflar bu faoliyat fraksiyalarning ulvan ko'pligi, sulfat tarkibi va molekulyar og'irligiga bog'liqligini ta'kidlaydilar. Mualliflarning fikriga ko'ra, bu sulfatlangan ramnozga boy molekulalar membrana fibroblastlarining lektin joylari tomonidan tan olingan va keyinchalik ularning metabolik faolligini ham anabolik, ham katabolik nuqtai nazardan rag'batlantiradigan signalizatsiya molekulalariga mos keladi. Biroq, poli-va oligosakkarid Ulou sp tomonidan faollashtirilgan molekulyar mexanizmni chuqur baholash uchun qo'shimcha tadqiqotlar zarur. transkripsiya omillari darajasidagi fraksiyalar, 3D teri yoki ex vivo teri eksplant modellarida yuqori va past molekulyar og'irlikdagi ulvanlarning kirib borish qobiliyati va qarishga qarshi maqsad uchun ushbu modellarda Uloa EAEdan olingan fraktsiyalar bilan ECM modulyatsiyasining ushbu natijalarini tasdiqlang.

Ushbu maqola Mar. Drugs 2021, 19, 156 dan olingan. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs