Oldindan shartlash bilan faollashtirilgan AKT MDM2-p53 yo'li orqali ishemiyaga neyronlarning bardoshliligini nazorat qiladiⅠ

Abstrakt

Oldindan konditsionerlik vositasida neyroproteksiyaning eng muhim mexanizmlaridan biri bu hujayra apoptozini susaytirish, keyingi shikastlangan ishemiyadan so'ng miya tolerantligini keltirib chiqarishdir. Shu nuqtai nazardan, antiapoptotik PI3K / AKT signalizatsiya yo'li hujayralar differentsiatsiyasi va omon qolishini tartibga solishda asosiy rol o'ynaydi.

Cistanche tubulosa kukuni uchun bosingneyroproteksiya

Faol AKT saraton hujayralarining omon qolishiga yordam berish uchun p53 ni beqarorlashtiradigan E{2}}ubikitin ligazasi bo'lgan sichqonchaning ikki daqiqali-2 (MDM2) ifodasini oshirishi ma'lum. Neyronlarda biz yaqinda MDM2-p53 o'zaro ta'siri NMDA glutamat retseptorini subtoksik stimulyatsiyaga asoslangan farmakologik oldindan shartlash orqali kuchayganligini ko'rsatdik, bu ishemiyadan kelib chiqqan neyron apoptozini oldini oladi.

Biroq, bu mexanizm ishemik oldindan shartlash (IPC) paytida neyronlarning bardoshliligiga hissa qo'shadimi yoki yo'qmi noma'lum. Bu erda biz IPC Ser473 da AKT ning PI3K vositachiligida fosforillanishini keltirib chiqarganligini ko'rsatamiz, bu esa o'z navbatida Ser166 da MDM2 ni fosforlangan. Ushbu fosforillanish MDM2 ning yadroviy barqarorlashuvini qo'zg'atdi, bu p53 beqarorligiga olib keldi va shu bilan ishemik insultda neyron apoptozning oldini oldi. PI3K/AKT yo'lini wortmannin bilan yoki AKT jimligi bilan inhibe qilish IPC tomonidan qo'zg'atilgan neyroproteksiyani bekor qiluvchi sitozolik MDM2 to'planishiga olib keldi.

Shunday qilib, IPC PI3K / AKT signalizatsiya yo'lining faollashuvini kuchaytiradi va MDM2-p53 o'zaro ta'sirini nazorat qilish orqali neyronal tolerantlikni rivojlantiradi. Bizning topilmalarimiz AKT signalizatsiyasini modulyatsiya qilish orqali IPC tomonidan qo'zg'atilgan neyroproteksiyada ishtirok etadigan yangi mexanik yo'lni taqdim etadi, bu AKT ishemik shikastlanishga qarshi potentsial terapevtik maqsad ekanligini ko'rsatadi. Kalit so'zlar: AKT; MDM2; p53; PI3K; ishemik bardoshlik; oldindan shartlash

1.Kirish

Odamlarda vaqtinchalik ishemik hujum (TIA) mavjudligi insult bilan og'rigan bemorlarda funktsional natijalarning afzalliklari bilan endogen oldindan shartli holat sifatida aniqlangan [1-3]. Ishemik oldindan shartlash (IPC) deb nomlanuvchi qisqa, subtoksik ishemik stimul tomonidan qo'zg'atilgan endogen neyroproteksiya ishemik shikastlanishga qarshi neyroproteksiyaning rivojlanayotgan sohasida strategiya hisoblanadi [4-6].

Dalillar shuni ko'rsatadiki, IPC tomonidan qo'llab-quvvatlanadigan neyroproteksiya transkripsiya, tarjima va post-translatsiya mexanizmlariga bog'liq bo'lib, ishemiyadan keyin asosiy oqsillarning funktsiyasini o'zgartiradi [6-11]. Biroq, IPC tomonidan qo'zg'atilgan ishemik bardoshlik (IT) bilan bog'liq mexanizm inson miyasida to'liq aniqlanmagan [12,13].

IPC vositachiligida neyroproteksiyani tushunish uchun yangi eksperimental yondashuvlarni ishlab chiqish miyaning IT [6] asosidagi endogen mexanizmlarni ochish uchun kuchli vosita bo'lib, insultli bemorlarda miya shikastlanishini minimallashtirishga qaratilgan yangi terapevtik maqsadlarni ochish potentsialiga ega. So'nggi yigirma yil ichida apoptotik neyron hujayralarining o'limi o'zini miya ishemik shikastlanishida ishtirok etadigan muhim mexanizm sifatida ko'rsatdi [14-16]. Shu ma'noda, protein kinaz B yoki AKT, serin/treonin kinaz bo'lib, u funktsional fosfoinositid kinaz (PI3K) faollashishini talab qiladi, ishemiyadan keyin neyroprotektiv terapiya uchun muhim maqsad hisoblanadi [17,18].

Yaqinda biz PI3K / AKT signalizatsiya yo'lining inhibisyonu neyronlarning eksitotoksiklikka sezgirligini oshirishini ko'rsatdik [19]. AKT kompleks anti-apoptotik signalizatsiya tarmog'ida ishtirok etadi [20], uning tarkibiy qismlari to'qimalarning turiga qarab turli subhujayra joylarida bo'lishi mumkin [21,22]. Yurakda AKT oldindan konditsionerlik bilan kardioproteksiyada ishtirok etgan [23].

Dalillar, shuningdek, fosforlangan AKT miya ishemiyasining boshlanishida neyronlarning omon qolishiga yordam berishini ko'rsatadi [24]. AKT faollashuvi miyada IT induksiyasiga hissa qo'shishi mumkin bo'lsa-da [25], uning IPC vositachiligida faollashuvini o'z ichiga olgan aniq mexanizm tushunarsizligicha qolmoqda. O'simta hujayralarida PI3K/AKT signalizatsiya yo'lining faollashishi Ser166/186 da MDM2 fosforillanishiga olib keladi, bu MDM2 ning yadro translokatsiyasini rag'batlantiradi [26,27] va uning ubiquitinatsiya faolligini oshiradi [28].

Yadroda MDM2 p53 bilan bog'lanadi va uning ubiquitinatsiyasiga va keyinchalik p53 funktsiyasini inhibe qiluvchi proteazoma degradatsiyasiga yordam beradi [29]. Stress sharoitida p53, shuningdek, MDM2 haddan tashqari ifodalanishini qo'zg'atishi mumkin, bu esa aksincha, salbiy teskari aloqa halqasida p53 faollashuvini bostiradi [30]. PI3K inhibisyonu AKT faollashuvini [31] va oldindan shartlangan yurakda MDM2 fosforillanishini oldini oladi [32].

Shu nuqtai nazardan, biz ilgari MDM2 protein darajasining ifodasini oshirib, in vivo jonli miyaning oldindan shartlashi vaqtinchalik o'rta miya arteriyasi okklyuziyasidan (tMCAO) keyin infarkt hajmini kamaytirishini aniqladik. Shunday qilib, MDM2-p53 kompleksi birlamchi kortikal neyronlarda p53/PUMA/kaspaz{5}} signalizatsiya yo'lining ishemiya bilan qo'zg'atilgan faollashuvini susaytirdi [33].

Bu erda biz keyingi ishemik shikastlanishga qarshi IPC vositachiligidagi neyronal bardoshlikdagi PI3K / AKT signalizatsiya yo'lining rolini, shuningdek, asosiy mexanizmni o'rganamiz va biz asosan AKT faollashuvi va MDM2-p53 kompleksi o'rtasidagi potentsial aloqaga e'tibor qaratamiz. .

2. Natijalar

2.1. IPC tomonidan targ'ib qilingan neyroproteksiya

Ser473 da AKT ning fosforillanishi, Ser166 da MDM2 ning fosforlanishi va p53 destabilizatsiyasi orqali vositachilik qiladi Biz MDM2-p53 o'zaro ta'sirining ishemiya [34] va IT [33] ga neyronlarning sezgirligiga ta'sirini ilgari tasvirlab bergan edik. Bu erda biz MDM2-p53 yo'lida ishtirok etish uchun nomzod sifatida IPC vositachiligidagi neyroproteksiyada AKTning potentsial rolini o'rganib chiqdik.

Birinchidan, biz ishemiya neyronlarda AKT faollashuviga yordam berishini tasdiqladik, buni Ser473 da AKT fosforillanishi tasdiqlaydi. Shakl 1A da ko'rsatilganidek, qisqa (20 daqiqa) OGD p (Ser473) AKT va MDM2 ifodasini sezilarli darajada induktsiya qildi, AKT protein darajasi esa o'zgarmadi (rasm S1A). Biroq, neyronlar uzoq muddatli OGD (90 min) ga duchor bo'lganda, AKT fosforilatsiyasi kuzatilmadi. Bundan tashqari, MDM2 protein darajasi pastroq edi, bu 1A-rasmda ko'rsatilganidek, p53 oqsilining yuqori ifodasiga mos keladi.

OGD dan keyin Mdm2 ifodasining vaqtga bog'liq holda ko'tarilishi (1B-rasm) subakut ishemiya OGD dan keyin p53 stabilizatsiyasini oldini olish mexanizmlarini qo'zg'atish uchun muhim bo'lishi mumkinligini tasdiqlaydi [33]. Biz IPC modeli sifatida qisqa OGD (20 min), keyin 2 soat reoksigenatsiyadan foydalandik (rasm S1B) [33]; Shunday qilib, biz OGD (OGD / R) dan keyin yoki IPC protokoli (IPC plus OGD / R) oldidan OGD dan keyin 4 soat reoksigenatsiyada to'plangan neyron ekstraktlarini tahlil qildik. Bunga parallel ravishda, neyronlar normoksiya (Nx) yoki oldindan shartlash (IPC) sozlamalarida inkubatsiya qilindi (rasm S1B).

1C-rasmda va S1C-rasmda ko'rsatilganidek, IPC Ser473 [35] da fosforillanish orqali aniqlanganidek, AKT ning erta faollashishiga olib keldi, keyin MDM2 oqsilining barqarorlashuvi va Ser166 da fosforlanishi. IPC shuningdek, OGD/R tomonidan qo'zg'atilgan p53 stabilizatsiyasini oldini oldi (1C-rasm). Qizig'i shundaki, 1D-rasmda ko'rsatilgan immunofluoresans tasvirlari IPC asosan yadroda to'plangan neyronlarda Ser473 da AKT fosforillanishiga yordam berganligini va oldindan shartlanmagan neyronlar (OGD) bilan solishtirganda OGD / R (IPC plus OGD / R) dan keyin p53 stabilizatsiyasini kamaytirganini ko'rsatdi. /R).

Shunday qilib, IPC mos ravishda oqim sitometriyasi (S1D-rasm) va florimetriya tahlillari (S1E-rasm) bilan o'lchanadigan OGD/R sabab bo'lgan neyron apoptozi va kaspaza-3 faollashuvining oldini oldi. IPC vositachiligida neyroproteksiyada p53 rolini tasdiqlash uchun biz (yovvoyi turdagi; og'irlik) yoki yo'q (nokaut; ko) p53 oqsilini ifodalovchi neyronlardan foydalandik. Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, p53 (S1F-rasm) yo'q neyronlar p53 wt neyronlariga qaraganda OGD tomonidan qo'zg'atilgan apoptozga chidamliroq edi.

Bundan tashqari, p53KO neyronlaridagi apoptoz darajalari oldindan shartlangan (IPC plus OGD/R) og'ir neyronlarda kuzatilganlarga o'xshash edi (S1G-rasm), bu IPC vositachiligida neyroproteksiyada p53 beqarorlashuvining asosiy rolini tasdiqlaydi [33]. Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, IPC Ser473 da AKT ning fosforillanishi, MDM2 stabilizatsiyasi va Ser166 da fosforillanishi va p53 destabilizatsiyasini o'z ichiga olgan mexanizm orqali ishemik insultga qarshi neyroproteksiyani keltirib chiqardi.

2.2. IPC PI3K/AKT yo'li orqali Ser166 da MDM2 fosforillanishini ishga tushiradi

PI3K/AKT signalizatsiya yo'li in vitro [36] va in vivo [37] neyronal ITda ishtirok etadi. Biroq, MDM2-p53 kompleksini tartibga solishda PI3K / AKT yo'lining IPC vositachiligida faollashuvining roli o'rganilmagan bo'lib qolmoqda. Buni aniqlashtirish uchun neyronlar PI3K/AKT yo'lining qaytarilmas va o'ziga xos inhibitori wortmannin bilan inkubatsiya qilindi [19].

Shakl 2A da ko'rsatilganidek, wortmannin 1D-rasmda ko'rsatilganidek, IPC bilan kuchaytirilgan (Ser473) AKT fosforlanishini va p53 beqarorlashuvini bekor qildi. Bu natijalar AKT faollashuvi va p53-vositalangan neyronal apoptozning inhibisyonu (S1D-rasm) va OGD/R dan keyin induktsiya qilingan kaspaza{7}} faollashuvi (S1E-rasm) o'rtasida to'g'ridan-to'g'ri bog'liqlikni ko'rsatadi. P53 stabilizatsiyasining asosiy regulyatori MDM2 Ser166 va Ser186 [26] da MDM2 ni fosforillaydigan AKT [26] ning maqsadi hisoblanadi. Wortmannin bilan PI3K inhibisyonu IPC tomonidan qo'zg'atilgan ikkala (Ser473)AKT va (Ser166)MDM2 ning fosforillanishini oldini oldi (2B-rasm).

IPC tomonidan qo'zg'atilgan Ser166 da MDM2 ning o'ziga xos Akt vositachiligida fosforillanishi kortikal neyronlarda yuqori darajada ifodalangan AKT1 oqsiliga (siAkt) qarshi maxsus ishlab chiqilgan va ishemiyadan keyin neyronlarning omon qolishi uchun faolligi muhim bo'lgan kichik interferent RNK (siRNK) yordamida tasdiqlangan. 38]. 3-rasmda ko'rsatilganidek, siAkt HEK-293T hujayralarida (3A-rasm) va kortikal neyronlarda (3B-rasm) transfeksiyadan so'ng 3-kunida siAkt umumiy AKT va p(Ser473)AKT protein darajasini pasaytirdi.

Bundan tashqari, AKT nokdaunti (siAkt) (Ser166) MDM2 fosforillanishini oldini oldi (3B-rasm). Ushbu natijalar IPC-faollashtirilgan PI3K / AKT signalizatsiya yo'li MDM2 fosforilatsiyasini Ser166 da rag'batlantirishini ko'rsatadi, bu MDM2 stabilizatsiyasi va natijada ishemik shikastlanishdan keyin p53 beqarorlashuvi uchun javobgar bo'lishi mumkin.

2.3. IPC-faollashtirilgan AKT ishemiyadan keyin yadro MDM2 oqsilini barqarorlashtirishni ishga tushiradi

AKT faollashuvi o'simta hujayralarida MDM2 ning yadroviy translokatsiyasida ishtirok etgan [26]. Ishemiya [34] dan keyin neyronlarning omon qolishi uchun yadro MDM2 stabilizatsiyasining ahamiyatini va aniqrog'i IPCdagi neyroprotektiv rolini [33] hisobga olib, biz MDM2 ning hujayra osti lokalizatsiyasini tartibga solishda PI3K / AKT signalizatsiya yo'lining ahamiyatini yanada chuqurroq o'rganishga qaror qildik. oqsil.

Shunday qilib, neyronlar yoki HEK{0}}T hujayralari inson MDM2-belgilangan oqsili (MDM2-GFP) bilan transfektsiya qilindi. To'rt xil tajriba sharoitida (Nx, IPC, OGD/R va IPC plus OGD/R) so'ng inson MDM2 oqsilini ektopik tarzda ifodalovchi neyronlarning transfektsion HEK-293T hujayralari va tasvirlari 4A va S1H-rasmda ko'rsatilgan. , mos ravishda.

MDM2- GFP ning ektopik ifodasi, yadro/sitozolik floresans nisbatini aniqlash orqali aniqlanganidek, IPC oldindan shartlanmagan ishemik (OGD/R) yoki normoksik (Nx) neyronlar (4A, B-rasm) bilan solishtirganda MDM2 yadro to'planishiga yordam berishini tasdiqladi. (S2B-rasm) va MDM2-GFP ning yadro floresansi intensivligi (S2C-rasm).

2.4. IPC p(Ser473)AKT va MDM2 o'zaro ta'sirini rag'batlantiradi, bu yadrodagi MDM2 barqarorligini oshiradi va ishemiyada induktsiya qilingan neyron apoptozini kamaytiradi.

MDM2 ning yadroviy barqarorlashuvida PI3K/AKT yo'lining IPC tomonidan kuchaytirilgan faollashuvining rolini namoyish etgandan so'ng, biz p (Ser473) AKT va MDM2 yadro ichida o'zaro ta'sir qilishini tekshirdik (6A-rasm). Yadro oqsili ekstraktlaridan MDM2 immunoprecipitatsiyasi, so'ngra MDM2 va p(Ser473)AKT ga qarshi immunoblotatsiya, IPC OGD/R dan keyin p(Ser473)AKT va MDM2 o'rtasidagi o'zaro ta'sirni kuchaytirganligini va shu bilan OGD/R tomonidan qo'zg'atilgan yadro p53 stabilizatsiyasini oldini olishini ko'rsatdi. yadro kiritishda ko'rsatilganidek (6A-rasm).

Nihoyat, biz PI3K / AKT yo'lining buzilishining neyron apoptoziga zararli ta'sirini o'rgandik (6B-rasm). AKT inhibisyonu OGD dan oldin IPC ning himoya ta'siriga qarshi chiqdi, bu AKT-MDM2 ning IT kontekstida neyroprotektiv rolini tasdiqlaydi. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, IPC Ser166da MDM2 fosforillanishini va p (Ser473)AKT bilan o'zaro ta'sir qiladigan yadro translokatsiyasini rag'batlantiradigan AKT ning fosforillanishi va faollashuvini keltirib chiqaradi. Ushbu mexanizm MDM2 ning yadroviy barqarorlashuvini kuchaytirishga yordam berishi mumkin, bu IPC tomonidan qo'zg'atilgan ishemik bardoshlikda muhim rol o'ynaydi.

Cistanche neyronlarni qanday himoya qiladi?

Cistanche apoptozni (dasturlashtirilgan hujayra o'limi) kamaytirish va neyronlarning omon qolishini rag'batlantirish orqali neyronlarni himoya qilishi mumkinligini ko'rsatadigan ba'zi dalillar mavjud. Apoptoz - bu zararlangan yoki istalmagan hujayralarni olib tashlash uchun tanada sodir bo'ladigan tabiiy jarayon, ammo u haddan tashqari yoki noto'g'ri sodir bo'lganda zararli bo'lishi mumkin. Laboratoriya tadqiqotlarida Cistanche apoptozni inhibe qilishi aniqlangan va bu ta'sir neyronlarni shikastlanishdan himoya qilishga yordam beradi.

Bundan tashqari, Cistanche neyroprotektiv ta'sirga ega bo'lgan bir qator bioaktiv birikmalarni o'z ichiga oladi. Misol uchun, u neyronlarni oksidlovchi stress va yallig'lanishdan himoya qiladigan ekinakozidni o'z ichiga oladi. Shuningdek, u yallig'lanishga qarshi va antioksidant xususiyatlarga ega ekanligi aniqlangan akteozidni o'z ichiga oladi.

Davomi bor...

Emiliya Barrio 1,†, Rebeka Vesino 1,2,†, Iren Sanches-Moran 1, Kristina Rodriges 1,2,3, Alberto Suares-Pindado 1, Xuan P. Bolaños 1,2,3,4, Anjeles Almeyda 1 2,3 va Mariya Delgado-Esteban 1,2,3,*

1 Funktsional biologiya va genomika instituti, Salamanka universiteti, CSIC, 37007 Salamanka, Ispaniya; emibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (RV); irene_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 Salamanka biotibbiy tadqiqotlar instituti, Salamanka universiteti kasalxonasi, Salamanka universiteti, CSIC, 37007 Salamanka, Ispaniya

3 Biokimyo va molekulyar biologiya kafedrasi, Salamanka universiteti, 37007 Salamanca, Ispaniya 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Corres Madrid, Ispaniya *{5} ; Tel.: plus 34-923-29-4908