RNK ketma-ketligi asosida buyrak qarishida LncRNK rolini bashorat qiling Ⅱ

lncRNA Gm43360 va uning potentsial maqsadli mRNKlarining korrelyatsiyasi

LncRNA Gm43360 o'rganish uchun tanlangan, chunki u ikkita lncRNA-mRNA birgalikda ifodalash tarmog'ini bog'lagan. Adra1a ifodasi darajasi Gm43360 bilan ijobiy korrelyatsiya qilingan (rho=0.8650, p=0.026), Csnk1a1 (kazein kinaz 1A1) manfiy korrelyatsiya qilingan (rho{{12) }}.8084, p=0.0084) (5a-rasm). lncRNA Gm43360 va uning potentsial maqsadli mRNKlari Adra1a va Csnk1a1 korrelyatsiyasini yanada tekshirish uchun ushbu tadqiqotda lncRNA Gm43360 ning haddan tashqari ifodalangan plazmidi ishlab chiqilgan. Csnk1a1 ifodasi kutilganidek kamaydi va Adra1a ifodasi ham kamaydi, lekin sezilarli darajada emas. Keyinchalik, biz lncRNA Gm43360 ni siRNA tomonidan uning maqsadli mRNKlarining ifodasiga ta'sir qilganligini aniqlash uchun urib tushirdik. Kutilganidek, Csnk1a1 siRNA manfiy nazorat guruhiga nisbatan lncRNA Gm43360 nokdaun hujayralarida ortdi (5b-rasm). O'n, biz hujayra siklida lncRNA Gm43360 rolini aniqladik. Hujayralarni hisoblash to'plami-8 (CCK-8) natijalari lncRNA Gm43360 hujayra hayotiyligini oshirishini ko'rsatdi (5c-rasm). Natijalar shuni ko'rsatdiki, lncRNA Gm43360 salbiy nazorat bilan solishtirganda S fazali hujayralar foizini oshirdi va G1 fazali hujayralar foizini kamaytirdi (5d-rasm). Te p53 va p21 oqsillari hujayra siklini tartibga solishda ishtirok etgan va shuning uchun hujayra qarishi belgilari edi. p53 va p21 ifoda darajalari nazorat guruhiga nisbatan haddan tashqari ifodalash guruhida sezilarli darajada kamaydi. p53 va p21 ning ifoda darajalari siRNA guruhida siRNA nazorat guruhiga nisbatan sezilarli darajada oshdi (5e-rasm). lncRNA Gm43360 ning haddan tashqari ifodalanishi SA{46}}gal-musbat hujayralar sonini kamaytirdi va transfekt Gm43360 guruhida -gal-musbat hujayralar ko'paydi (5f-rasm). Birgalikda bu natijalar shuni ko'rsatdiki, lncRNA Gm43360 buyrak tubulali epiteliya hujayralarining qarishini inhibe qilgan.Csnk1a1 ifodasini inhibe qilish.

BUYRAK FONKSIYASI UCHUN 25% EKINAKOSID VA 9% AKTEOSID BILAN TABIY ORGANIK SİSTANCHE EKSTRAKTINI OLISH UCHUN SHU YERGA BOSING

Munozara

Ushbu tadqiqotda biz yosh va keksa sichqonchaning buyraklaridagi mRNK ifodasi ma'lumotlarini baholadik va aberrantly ifodalangan mRNKlarning funktsiyalarini ochib beruvchi bio-axborot tahlillarini o'tkazdik. Biz 347 yuqori regulyatsiya qilingan mRNK va 355 pastga regulyatsiya qilingan mRNK, shuningdek 130 yuqori tartibga solinadigan lncRNA va 91 pastga regulyatsiya qilingan lncRNKni kuzatdik.sichqonchaning eski buyraklari yosh sichqonchaning buyraklari bilan solishtirganda. Bundan tashqari, bu mRNKlar qarish bilan bog'liq yo'llarda ishtirok etishi ko'rsatilgan, masalanoksidlovchi fosforlanish, AMPK signalizatsiya yo'li, Wnt signalizatsiya yo'li, Rap1 signalizatsiya yo'li va buyrak qarishi patogenezida differensial ifodalangan mRNKlarning funktsiyalarini ko'rsatadigan yoshga bog'liq kasallik.

Uzoq kodlanmagan RNK NEAT1 buyrak tubulyar epiteliya hujayralarida buyrak fibrozining rivojlanishida himoya omil hisoblanadi [21]. Tasodifan, bizning ketma-ketlik natijalarida lncRNA NEAT1 keksa sichqonlarning buyraklarida yosh sichqonlarga qaraganda pastroq darajada ifodalangan, bu avvalgi topilmalar bilan mos keladi. LincRNA-Gm4419 diabetik nefropatiyada NF-kB/NLRP3 yallig'lanish mexanizmlari orqali yallig'lanish va fibrozni tezlashtiradi [22]. Bizning ketma-ketlik natijalarida biz Gm4419 ning ifodasi yosh sichqonlarga qaraganda keksa sichqonlarning buyraklarida yuqori ekanligini aniqladik, ammo sezilarli farq yo'q edi. LncRNA Gm43360 5-xromosomada joylashgan (Chr5: 122494022–122,494,908, 2887 bp). UCSC Genome Browser ma'lumotlariga ko'ra, Gm43360 Atp2a2 protein kodlovchi geni intronda joylashgan. Biroq, hozirgi kunga qadar lncRNA Gm43360 ning kasalliklarga aloqadorligi haqida hech qanday ma'lumot yo'q. Ushbu tadqiqotda lncRNA Gm43360 ning ishdan chiqishi buyrak tubulyar epiteliya hujayralarining qarishiga yordam berdi. Bundan tashqari, biz ketma-ketlik natijalarida ko'plab differentsial ifodalangan lncRNAlarni aniqladik va ularni tekshirdik.

LncRNA lar lncRNA tartibga solish mexanizmlari asosida cis-regulyatsiya yoki trans-regulyatsiyaga bo'lingan. Cis-ta'sir etuvchi lncRNA'lar qo'shni genlarning ekspressiyasiga cis-ta'sir qiluvchi elementlarga, masalan, promotorlar, kuchaytirgichlar va tartibga soluvchi ketma-ketliklar, lncRNAlar va mRNKlar orasidagi masofa 100 kb dan kam bo'lgan ta'sir ko'rsatishi mumkin. Trans-ta'sir qiluvchi lncRNKlar transfeksiya joyini tark etuvchi va uzoq joylarda ishlaydigan lncRNKlarni bildiradi (ya'ni, lncRNK va mRNK orasidagi masofa 100 kb dan ortiq) [23]. LncRNA MAAT cis-regulyatsiya moduli orqali qo'shni Mbnl1 genining ifodasini oshiradi [24]. lncRNA Pnky kortikal rivojlanishda trans-aktyor regulyator rolini o'ynaydi [25]. Ushbu tadqiqotda lncRNA Gm43360 va Csnk1a1 o'rtasida transregulyatsiya aloqasi mavjud edi. Csnk1a1 o'simtani bostiruvchi gen [26] bo'lib, hujayra siklida va hujayra bo'linish jarayonida ishtirok etuvchi oqsilni kodlaydi [27]. Csnk1a1 pastga regulyatsiyasini induktsiya qiladiqarilik bilan bog'liq yallig'lanishkolorektal o'smalarda o'sishning to'xtab qolishi bilan javob beradi [26]. Gm43360 yuqori tartibga solinganida Csnk1a1 pastga tushirildi; Shunday qilib, lncRNA Gm43360 ishtirok etishi mumkinbuyrak qarishitomonidanCsnk1a1 ifodasini tartibga solish.

Xulosa

Bizning lncRNA-mRNK koekspressiya tarmog'ini tekshirishimizbuyrak qarishilncRNA ni aniqladi, lncRNA Gm43360, buyrak qarishida himoya rolini o'ynashi mumkin va bu bilan bog'liq mexanizmlar haqidagi tushunchamizni kengaytirdi.buyrak qarishi

Materiallar va usullar

Yosh (3-oylik) va eski (24-oylik) erkak C57BL/6J sichqonlarining namunalari Xiamen universitetining Eksperimental hayvonlar markazidan sotib olindi va standart muhitda yetishtirildi. Barcha sichqonlar oziq-ovqat va suvdan bepul foydalanishlari mumkin edi. Qurbonlik qilishdan oldin sichqonlar bir oy davomida yangi muassasaga moslashgan. Namuna olishdan oldin sichqonlar 750 mg/kg dozada intraperitoneal in'ektsiya yo'li bilan uretan bilan behushlik qilindi. Yosh va qari sichqonlar bir kunda qurbonlik qilingan.Sichqonchaning qoldiq buyragihar bir tahlilda ketma-ketlik uchun to'qima ishlatilgan. RNK-seq va gistopatologiya o'tkazildialohida buyraklarxuddi shu sichqonchadan. Buyrak to'qimalari sichqonlardan yig'ilgan. Bir buyrak zudlik bilan 10% neytral tamponlangan formalinga botirilib, keyingi bo'limga joylashtirildi, ikkinchi buyrak esa bir nechta to'qimalarga bo'lindi va darhol suyuq azotga joylashtirildi va keyin -80 darajada saqlanadi. Tadqiqot Sian Jiaotong universiteti (Shansi, Xitoy) birinchi filiali kasalxonasining Etika qo'mitasi tomonidan qo'llab-quvvatlandi (№ 2018-G-164). Barcha usullar hayvonlar etikasi qoidalari va qoidalariga muvofiq amalga oshirildi. Ushbu tadqiqot ARRIVE ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi.

Buyrak gistopatologiyasi

Yosh va qari sichqonlarning buyrak to'qimalari namunalari bir kechada 10% paraformaldegid eritmasida fiksatsiya qilindi. O'nta bo'lim suvsizlangan, kerosin bilan qoplangan va 4- mikron qalinlikda bo'lingan. PAS va Massonning trikromatik binoni standart protokollar yordamida amalga oshirildi. Rasmlar kamera tomonidan suratga olindi va binoni-musbat joy o'lchandi. Gistopatologik kamera tasvirlari uchun maydon Image-Pro Plus 6.0 bilan hisoblab chiqilgan.

SA‑ ‑gal bo‘yash

SA{0}}gal faoliyati ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq SA- -gal boʻyash toʻplami (Cell Signaling Technology #9860) yordamida tahlil qilindi. Ijobiy binoni maydoni o'lchandi va SA- -gal-musbat hujayralar Image-Pro Plus 6.0 yordamida hisoblandi.

RNK ekstraktsiyasi kutubxonasining tuzilishi va ketma-ketligi

Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7.0 ketma-ketlik kutubxonasini yaratish uchun ishlatilgan. Umumiy RNK ekstraktsiyasidan so'ng, mRNK umumiy RNKdan (5ug) Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, CA, AQSH) yordamida ikki marta tozalash bilan tozalandi. Tozalashdan so'ng, mRNK yuqori haroratlarda ikki valentli kationlar yordamida qisqa bo'laklarga bo'lindi (magniy RNK parchalanish moduli (NEB, e6150, AQSH) 94 daraja 5-7 min ostida). Keyin ajralgan RNK fragmentlari SuperScript™ II teskari transkriptaza (Invitrogen, kat. 1,896,649, AQSH) yordamida cDNKni olish uchun teskari transkripsiya qilindi, ular keyinchalik E. coli DNK polimeraza I bilan U-belgilangan ikkinchi zanjirli DNKlarni sintez qilishda foydalanildi. NEB, cat.m0209, AQSH), RNase H (NEB, cat.m0297, AQSH) va dUTP Solution (Termo Fisher, cat.R0133, AQSh). Keyin har bir ipning to'mtoq uchlariga A-bazasi qo'shildi va ularni indekslangan adapterlarga bog'lash uchun tayyorladi. Har bir adapterda adapterni A-dumli parchalangan DNKga bog'lash uchun T-asosli o'simta mavjud edi. Ikki indeksli adapterlar fragmentlarga bog'langan va o'lcham tanlash AMPureXP boncuklar bilan amalga oshirilgan. Issiqlikka chidamli UDG fermenti (NEB, cat.m0280, AQSh) U-belgili ikkinchi zanjirli DNKlarni davolashdan so'ng, bog'langan mahsulotlar quyidagi shartlar bilan PCR bilan kuchaytirildi: 3 daqiqa davomida 95 daraja dastlabki denatürasyon; 15 soniya davomida 98 daraja denaturatsiyaning 8 tsikli, 15 soniya davomida 60 daraja tavlanish va 30 soniya davomida 72 daraja uzaytirish; va keyin 72 daraja 5 daqiqaga yakuniy uzaytirish. Yakuniy cDNK kutubxonalari uchun o'rtacha kiritish uzunligi 300±50 bp edi. Nihoyat, ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq Illumina Novaseq™ 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd., Xanchjou, Xitoy) da biz 2×150 bp juft uchli ketma-ketlikni (PE150) amalga oshirdik [28].

Bioinformatika tahlili Toza o'qishlar ketma-ketligi va filtrlash

dan birlashtirilgan RNK dan texnologiya asosida qurilgan cDNK kutubxonasibuyrak namunalarisichqonlar ketma-ketligi va Illumina NovaseqTM 6000 ketma-ketlik platformasi bilan ishlagan. Illumina juftlashtirilgan RNK-seq yondashuvidan foydalanib, biz transkriptomani ketma-ketlashtirdik, jami million million 2 × 150 bp juftlashtirilgan o'qishlar hosil qildik. Sekvensiya mashinalaridan olingan o'qishlar quyidagi yig'ish va tahlilga ta'sir qiladigan adapterlar yoki past sifatli asoslarni o'z ichiga olgan xom o'qishlarni o'z ichiga oladi. Shunday qilib, yuqori sifatli toza o'qishlarni olish uchun o'qishlar Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, version:cutadapt-1.9) tomonidan yanada filtrlangan. Parametrlar quyidagicha edi:

1) adapterlarni o'z ichiga olgan o'qishlarni olib tashlash;

2) poliA va polini o'z ichiga olgan o'qishlarni olib tashlash;

3) noma'lum nukleotidlarning (N) 5% dan ko'prog'ini o'z ichiga olgan ko'rsatkichlarni olib tashlash;

4) 20% dan ortiq past sifatli (Q-qiymati 20 dan kam yoki teng) asoslarni o'z ichiga olgan past sifatli o'qishlarni olib tashlash.

O'nta ketma-ketlik sifati FastQC [30] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/ fastqc/, 0.11.9) yordamida tekshirildi. toza ma'lumotlarning Q20, Q30 va GC tarkibini o'z ichiga oladi. Shundan so'ng, jami G bp tozalangan, juftlashtirilgan o'qishlar ishlab chiqarildi. Xom ketma-ketlik ma'lumotlari GSE154223 kirish raqamiga ega NCBI Gen Expression Omnibus (GEO) ma'lumotlar to'plamiga topshirildi.

Yoʻnaltiruvchi genom/annotatsiya Mus_musculus.GRCm38 edi. Tahlillar uchun ishlatiladigan gen izohining manbai va versiyasi Ensembl_v88 edi.

Transkriptlar yig'ilishi

Birinchidan, Cutadapt [29] adapter ifloslanishi, past sifatli asoslar va aniqlanmagan asoslarni o'z ichiga olgan o'qishlarni olib tashlash uchun ishlatilgan. O'nta ketma-ketlik sifati FastQC (http://www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/) yordamida juda oziqlangan. Biz Bowtie2 [31] va Hisat2 [32] dan sichqoncha genomiga oʻqishlarni xaritalash uchun foydalandik. Har bir namunaning xaritalangan o'qishlari StringTie [33] yordamida yig'ilgan. O'nta, barcha transkriptlardanbuyrak namunalariPerl skriptlari yordamida keng qamrovli transkriptomani qayta tiklash uchun birlashtirildi. Yakuniy transkriptom yaratilgach, StringTie [33] va edgeR [34] barcha transkriptlarning ifoda darajalarini baholash uchun ishlatilgan.

LncRNA identifikatsiyasi

Avvalo, ma'lum mRNKlar bilan bir-biriga mos keladigan transkriptlar va 200 bp dan qisqaroq transkriptlar o'chirildi. Keyin biz kodlash potentsiali bo'lgan transkriptlarni bashorat qilish uchun CPC [35] va CNCI [36] dan foydalandik. CPC balli bilan barcha transkriptlar<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.

Differensial ifodalangan tahlil genlari (DGE) tahlili

StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2 ta differensial ifodalangan genlar hisoblangan.

Maqsadli genlarni bashorat qilish va lncRNAlarning funktsional tahlili

LncRNA funktsiyasini o'rganish uchun biz lncRNAlarning cis-maqsadli genlarini taxmin qildik. LncRNA qo'shni maqsadli genlarga ta'sir qilishda cis rolini o'ynashi mumkin. Ushbu tadqiqotda 100,{2}} yuqori va quyi oqimdagi kodlash genlari Perl skripti tomonidan tanlangan. Keyin biz BLAST2GO [39] skriptlari yordamida lncRNA uchun maqsadli genlarning funktsional tahlilini ko'rsatdik. Jamoat domeniga toʻliq buyruqlar havolasi Jie-Li/README.md edi, asosiy sahifada · dandan-li/Jie-Li (github.com).

Gen ontologiyasi (GO) toifalari va Kioto genlar va genomlar entsiklopediyasi (KEGG) tahlili

RNK ketma-ketligi uchun bioinformatika tahlili OmicStudio vositalari (http://www.omicsudio. cn/tool) yordamida amalga oshirildi. Gen ontologiyasi (GO) funktsional boyitish tahlili va Kioto genlar va genomlar ensiklopediyasi (KEGG) [37-39] boyitish tahlili bashorat qilingan maqsadli genlarning biologik funktsiyalarini tahlil qilish uchun ishlatilgan. GO tahlili asosiy biologik jarayonlarni uchta jihat orqali aniqlaydi: hujayra tarkibi, molekulyar funktsiyalar va biologik jarayonlar (http://www.geneontology.org/). Avval tahlil barcha differentsial ifodalangan genlar va fon genlarini GO ma'lumotlar bazasiga joylashtiradi. Har bir element xaritaga tushiriladi, har bir elementdagi genlar soni hisoblab chiqiladi va boyitish natijasining P qiymatini olish uchun gipoteza testini o'tkazish uchun gipergeometrik taqsimot qo'llaniladi. P qiymati qanchalik past bo'lsa, boyitish natijasi shunchalik muhim bo'ladi. KEGG maqsadli genlar bilan bog'liq muhim yo'llarni o'rganish uchun genetik biologiya tomonidan differentsial tarzda ifodalangan mRNKlarni tahlil qiluvchi ma'lumotlar bazasi resursidir (https://www.genome.jp/kegg/). Natijalar p-qiymatlari bilan ifodalanadi; p-qiymati qanchalik past bo'lsa, boyitish natijasi shunchalik muhim bo'ladi.

qRT-PCR

GAPDH endogen nazorat sifatida ishlatilgan. Keyin noma'lum genlarning nisbiy ifoda darajalari hisoblab chiqildi. Barcha primerlar ushbu tajriba uchun maxsus ishlab chiqilgan va sintez qilingan. GAPDH uchun primerlar tijoratlashtirildi. Adra1a va Csnk1a1 primerlarining o'ziga xosligi eritma egri chizig'ining yagona cho'qqisi bilan aniqlandi.

mRNA‑lncRNA koekspression tarmog'ini yarating

Transregulyatsiya tadqiqotga asoslangan edi, keyin esa trans energiyasi hisoblab chiqildi. Trans energiyasi qanchalik kichik bo'lsa, bog'lanish ehtimoli shunchalik yuqori bo'ladi. Keyin mRNK-lncRNKning korrelyatsiya koeffitsienti ham hisoblab chiqildi. mRNK-lncRNA tarmog'i 0 dan oshiq Spearman korrelyatsiya koeffitsientini tanlash orqali qurilgan.9. mRNA-lncRNA birgalikda ifodalash tarmog'i Cytoscape dasturi (v3.7.1) yordamida qurilgan.

Hujayra madaniyati

Sichqoncha buyrak proksimal quvurli epitelial hujayralari (MRPT-EpiCs) 2% homila sigir zardobi (FBS, Cat. # 0010) va epitelial hujayra o'sishi qo'shimchasi-hayvonni o'z ichiga olgan o'rta hayvon epitelial hujayrasida (EpiCM-a, Cat. # 4131) o'stirildi. (EpiCGS-a, Cat. # 4182) 37 daraja va 5% CO2 da namlangan inkubatorda antibiotiklarsiz. Madaniyat muhiti har 2-3 kunda o'zgartiriladi. Logarifmik o'sish bosqichidagi hujayralar o'sish 90% ga etganida subkultura qilingan. Tripsin tomonidan hazm qilingan hujayra suspenziyasi har bir quduqda 2*104 -5*104 hujayradan iborat 6-quduq plastinkalariga ekilgan. Transfeksiya uchun ishlatiladigan hujayralar 2 va 5 avlodlar orasida edi.

Plazmid tuzilishi va hujayra transfeksiyasi

lncRNA Gm43360 haddan tashqari ifodalangan plazmid GeneChem (Shanxay, Xitoy) tomonidan yaratilgan. Plazmid magistral GV658 edi va CMV promouteri lncRNA ifodasini harakatga keltirdi. Klonlangan nukleotidlar ketma-ketligi qo'shimcha materialda keltirilgan. lncRNA Gm43360 ishdan chiqishi uchun uchta lncRNA ENS 00000197656-nishon siRNAlarni (lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm43360-CAGU5CA'CA'RNA) SHART UGAAGUUTT-3'; va lncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAUAACUCAAUGGGTT-3') GenePharma (Shanxay, Xitoy) da ishlab chiqilgan va sintez qilingan. Ishlab chiqaruvchining protokoliga ko'ra, hujayralar har bir quduqqa 2500 ng plazmid yoki 100 pmol siRNK bilan 6 µl Lipofektamin™ 2000 Transfektsiya Reagenti (Invitrogen, AQSh) bilan transfektsiya qilindi. RNK va oqsillarni ifodalash darajalari transfeksiyadan keyin 48 soatda aniqlandi va har bir tajriba kamida uch marta takrorlandi. Haqiqiy vaqtda miqdoriy PCR lncRNA Gm43360 haddan tashqari ifodasi va nokdaunning samaradorligini tekshirish uchun ishlatilgan.

Western blot tahlili

O'stirilgan hujayralar muzli sovuq PBS bilan yuvildi, 120 µl RIPA buferi (Yurak, Xitoy) qo'shildi va proteaz inhibitori va PMSF (Yurak, Xitoy) muz ustida 30 daqiqa qo'shildi. Turli mikrotsentrifuga naychalarida hujayralarni to'plagandan so'ng, oqsil kontsentratsiyasi miqdori aniqlandi. Har bir namunaga yuklash buferi qo'shildi va keyin 7 daqiqa qaynatiladi. 30 mikrogram namuna 12% SDS-PAGE (Beyotime, Xitoy) bilan ajratilgan va PVDF membranalariga (Thermo Fisher, AQSh) elektrotransfer qilingan. Keyin membranalar 5% sut bilan bloklanadi. Membranalar maxsus birlamchi antikorlar bilan inkubatsiya qilindi: anti-p21 (1:1000, Abcam, ab109199), anti-p53 (1:1000, Proteintech, 10442-1-AP) va anti-GAPDH (1:3000, Profintech). , 60004-1-Ig) kechasi 4 daraja. TBST bilan yuvilgandan so'ng, membranalar xona haroratida 1 soat davomida ikkilamchi antikor bilan inkubatsiya qilindi. Protein bantlari xemiluminesans to'plamidan foydalangan holda kuzatildi (Millipore, AQSh). GAPDH ifodasi protein darajasini normallashtirish uchun ishlatilgan.

Hujayra proliferatsiyasi tahlili

Hujayra ko'payish qobiliyati hujayralarni hisoblash to'plami-8 (CCK-8) tahlili bilan aniqlandi. Transfeksiyadan 48 soat o'tgach, har bir quduqqa 90 µl yangi muhit va 10 µl CCK{5}} eritmasi qo‘shildi (Beyotime, C0042). Hujayralar 1-4 soat davomida 37 gradusda 5% CO2 da inkubatsiya qilindi va universal mikroplata o'quvchi (Bio-Tek, AQSh) tomonidan 450 nm da o'lchandi.

Oqimning sitometrik tahlili

Hujayralar transfeksiyadan bir kun oldin 6-quduq plastinkalariga yotqizilgan. Transfektsiyadan 48 soat o'tgach, hujayralar tripsinlanadi va 1000 rpm da 5 daqiqa davomida santrifüj qilindi. Keyin hujayralar kamida 4 soat davomida 70% etanolda 4 daraja haroratda o'rnatildi. Santrifüjdan so'ng hujayralarga RNase A va propidium yodid (PI) bo'yash eritmasi qo'shildi va hujayralar qorong'i joyda xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Te-bo'yalgan hujayralar ACEA NovoCyte (Biosciences, AQSh) yordamida tahlil qilindi.

Statistik tahlil

Oddiy taqsimot bo'yicha o'lchov ma'lumotlari o'rtacha ± SD sifatida taqdim etiladi. Ikki xil guruh orasidagi farq ikki dumli juftlashtirilmagan Student t-testlari yordamida aniqlandi va p-qiymati < 0.05 statistik jihatdan ahamiyatli deb hisoblandi. Barcha hisob-kitoblar GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., AQSh) yordamida amalga oshirildi.

Ma'lumotnomalar

1. Docherty MH, O'Sullivan ED, Bonventre QK, Ferenbach DA. Buyrakdagi hujayra qarishi. J Am Soc Nephrol. 2019;30(5):726–36.

2. Partridge L, Deelen J, Slagboom PE. Qarishning global muammolariga qarshi turish. Tabiat. 2018;561(7721):45–56.

3. Pan JX. LncRNA H19 MAPK va NF-kB signalizatsiya yo'llarini tartibga solish orqali aterosklerozga yordam beradi. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017;21(2):322–8.

4. Wasson CW, Abignano G, Hermes H, Malaab M, Ross RL, Jimenez SA, Chang HY, Feghali-Bostwick CA, Del Galdo F. Uzoq kodlanmagan RNK HOTAIR EZH2-miyofibroblast faollashuvini tizimli ravishda boshqaradi. NOTCH ning miRNK 34a ga bog'liq faollashuvi orqali skleroz. Ann Revmatik Dis. 2020;79(4):507–17.

5. Luo J, Vang K, Yeh S, Sun Y, Liang L, Xiao Y, Xu V, Niu Y, Cheng L, Maity SN va boshqalar. LncRNA-p21 EZH2/STAT3 signalizatsiyasini modulyatsiya qilish orqali antiandrogen enzalutamid tomonidan qo'zg'atilgan prostata saratoni neyroendokrin differentsiatsiyasini o'zgartiradi. Nat Commun. 2019;10(1):2571.

6. Vang Y, Yang L, Chen T, Liu X, Guo Y, Zhu Q, Tong X, Yang V, Xu Q, Huang D va boshqalar. Yangi lncRNA MCM3AP-AS1 miR-194-5p/FOXA1 o'qini yo'naltirish orqali gepatotsellyulyar karsinoma o'sishiga yordam beradi. Mol saratoni. 2019;18(1):28.

7. Vu YY, Kuo HC. Neyrodegenerativ kasalliklar patogenezida kodlanmaydigan RNKlarning funktsional rollari va tarmoqlari. J Biomed Sci. 2020;27(1):49.

8. Li Z, Vang Z. Qarish buyrak va qarish bilan bog'liq kasallik. Adv Experiment Med Biol. 2018;1086:169–87.

9. Vang X, Vrtiska TJ, Avula RT, Walters LR, Chakkera HA, Kremers WK, Lerman LO, Rule AD. Yosh, buyrak funktsiyasi va xavf omillari buyrakning kortikal va medullar hajmlari bilan turlicha bog'liq. Buyrak Int. 2014;85(3):677–85.

10. Lin Q, Hou S, Dai Y, Jiang N, Lin Y. LncRNA HOTAIR RAB3IP orqali Parkinson kasalligining rivojlanishini rag'batlantirish uchun miR-126-5p ni maqsad qiladi. Biol Chem. 2019;400(9):1217–28.

Wecistanche-ning qo'llab-quvvatlovchi xizmati - Xitoydagi eng yirik cistanche eksportchisi:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Batafsil texnik xususiyatlar uchun xarid qiling:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop