Oenothera Biennisning qarigan inson teri fibroblastlariga promitotik ta'siri 1-qism

Abstrakt: Qarigan dermal fibroblastlarning to'planishi terining qarishiga olib keladi. Proliferatsiyani qayta faollashtirish hujayra qarishini modulyatsiya qilish strategiyalaridan biridir. Yaqinda biz Oenothera biennis hujayra madaniyatining (ObHEx) hidrofilik ekstraktining aniq kimyoviy tarkibi haqida xabar berdik va terining qarishga qarshi xususiyatlarini ko'rsatdik. Ushbu ish uning biologik ta'sirini, xususan, hujayra qarishiga baholashga qaratilgan. ObHEx ta'siri o'ta chuqur proteomik tahlil orqali stress bilan qo'zg'atilgan erta qarish (SIPS) ga duchor bo'lgan oddiy inson dermal fibroblastlarida baholandi va shu paytgacha eng global qarish bilan bog'liq proteomaga olib keldi. Mass-spektrometriya ma'lumotlari shuni ko'rsatadiki, ObHEx bilan davolash qarigan hujayralarda kuchli regulyatsiya qilingan muhim mitotik oqsillar darajasini qayta tiklaydi. Proteomika topilmalarimizni tasdiqlash uchun biz ObHEx qisman qarigan hujayralarning eng keng tarqalgan belgisi bo'lgan "karilik bilan bog'liq-ß-galaktosidaza" faolligini tiklashi mumkinligini isbotladik. Bundan tashqari, mitotik oqsil darajasining ko'tarilishi hujayra siklining qayta kirishiga olib keladimi yoki yo'qligini baholash uchun FACS tajribalari ObHEx tomonidan qarigan hujayralar proliferatsiyasining kichik, ammo sezilarli darajada qayta faollashishini ko'rsatdi. Xulosa qilib aytganda, bu erda nashr etilgan chuqur qarish bilan bog'liq global proteom profili SIPS tomonidan tartibga solinmagan yuzlab oqsillar panelini taqdim etadi, ular jamiyat tomonidan qarish va yangi potentsial modulyatorlarning ta'sirini yanada tushunish uchun ishlatilishi mumkin. Bundan tashqari, proteomik tahlil ObHEx ning qarigan hujayralarga o'ziga xos pro-mitotik ta'sirini ko'rsatdi. Shunday qilib, biz ObHEx ni terining qarishi bilan bog'liq qarishga qarshi kuchli yordamchi sifatida taklif qilamiz.

Sistanx glikozidi, shuningdek, yurak va jigar to'qimalarida SOD faolligini oshirishi va har bir to'qimalarda lipofusin va MDA tarkibini sezilarli darajada kamaytirishi, turli xil reaktiv kislorod radikallarini (OH-, H₂O₂ va boshqalar) samarali tozalash va DNKning shikastlanishidan himoya qilishi mumkin. OH-radikallar tomonidan. Cistanche feniletanoid glikozidlari erkin radikallarni kuchli tozalash qobiliyatiga ega, S vitaminiga qaraganda yuqori darajada kamaytirish qobiliyatiga ega, sperma suspenziyasida SOD faolligini yaxshilaydi, MDA tarkibini kamaytiradi va sperma membranasi funktsiyasiga ma'lum bir himoya ta'siriga ega. Cistanche polisaxaridlari D-galaktoza sabab bo'lgan eksperimental qarigan sichqonlarning eritrotsitlari va o'pka to'qimalarida SOD va GSH-Px faolligini oshirishi, shuningdek o'pka va plazmadagi MDA va kollagen miqdorini kamaytirishi va elastin miqdorini oshirishi mumkin. DPPHga yaxshi tozalash ta'siri, qarigan sichqonlarda gipoksiya vaqtini uzaytirish, sarumdagi SOD faolligini yaxshilash va eksperimental qarigan sichqonlarda o'pkaning fiziologik degeneratsiyasini kechiktirish Hujayra morfologik degeneratsiyasi bilan tajribalar Cistanche yaxshi antioksidant qobiliyatiga ega ekanligini ko'rsatdi. va terining qarish kasalliklarini oldini olish va davolash uchun dori bo'lish potentsialiga ega. Shu bilan birga, Cistanchedagi echinacoside DPPH erkin radikallarini tozalashning muhim qobiliyatiga ega va reaktiv kislorod turlarini tozalashi, erkin radikallar keltirib chiqaradigan kollagen degradatsiyasini oldini olishi mumkin, shuningdek, timin erkin radikal anionining shikastlanishiga yaxshi ta'sir ko'rsatadi.

Cistanche Tubulosa qo'shimchasini bosing

【Batafsil ma'lumot uchun:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Kalit so'zlar: Oenothera biennis gidrofil ekstrakti; qarilik; fibroblastlar; proteomika; massa spektrometriyasi; diaPASEF; mitoz; terining qarishi

1.Kirish

Qarish qarilik va yoshga bog'liq kasalliklarning asosiy sababidir. Yosh hujayralar telomerlarning fiziologik eroziyasiga (replikativ qarish) yoki stress triggerlariga, shu jumladan DNK shikastlanishiga, oksidlovchi stressga, organellalar shtammiga va onkogen faollashuviga (stress ta'siridan erta qarish, SIPS) javob sifatida proliferatsiyani to'xtatadi. DNKning zararlanishiga javoban (DDR) o'sishning to'xtatilishiga qaramay, qarigan hujayralar yuqori metabolik holat va lizosomal faollikni namoyon qiladi, bu ularning sekretor faolligini oshirish uchun juda muhimdir, bu keksalik bilan bog'liq sekretor fenotip (SASP) [2,3]. SASP omillari eruvchan (interleykinlar, kimyokinlar, o'sish omillari, ajratilgan proteazlar) va erimaydigan (ajraladigan erimaydigan oqsillar va hujayradan tashqari matritsa komponentlari) oqsillarning bir nechta oilalarini o'z ichiga oladi, ular atrofdagi to'qimalarga salbiy ta'sir qiladi va surunkali past darajadagi yallig'lanish holatini keltirib chiqaradi.

Dermada qarigan fibroblastlarning to'planishi terining qarishiga olib keladi, hujayradan tashqari matritsaning (ECM) yaxlitligini va qo'shni mikrovaskulyar endotelial hujayralar, epidermal melanotsitlar va keratinotsitlar funktsiyasini buzadi [4-6]. Qarishning oldini olishning uchta asosiy strategiyasi quyidagilarni o'z ichiga oladi: (i) apoptoz yoki immun faollashuvni qo'zg'atish orqali qarigan hujayralarni tozalash; (ii) SASP ning modulyatsiyasi va (iii) hujayra proliferatsiyasining qayta faollashishi. Darhaqiqat, qarilik dastlab qaytarilmas hujayra tsiklining to'xtatilishi sifatida tasvirlangan bo'lsa-da, hozirgi dalillar proliferatsiyani tiklash mumkinligini ko'rsatmoqda [7-9].

Ushbu stsenariyda hujayra qarishini oldini olish va/yoki modulyatsiya qilish mumkin bo'lgan ingredientlar terining qarishiga qarshi kurashda qimmatbaho qurol sifatida kosmetik sohada katta qiziqish uyg'otadi. Xususan, Onagraceae oilasiga mansub Oenothera biennis (O. biennis, Evening Primrose) turidan olingan ekstraktlar yallig'lanishga qarshi va antioksidant ta'siri tufayli an'anaviy ravishda kosmetik maqsadlarda qo'llaniladi [10]. Havo qismlaridan va suvli barglar ekstraktidan tayyorlangan metanolik ekstraktlar asosan fenolik kislotalar va flavonoidlarni o'z ichiga oladi, ildizlardan olingan metanolik ekstraktlar esa asosan sterollar va triterpenlarni o'z ichiga oladi [11]. Alkogolli va gidroalkogolli havo qismi ekstraktlarining biologik faolligi isbotlangan boʻlsa-da [12-14], O. biennisning eng koʻp qoʻllaniladigan ekstraktlari yogʻ kislotalariga nihoyatda boy boʻlgan urugʻlardan olingan moylardir. Darhaqiqat, linoleik kislota (LA) va -linolenik kislota (GLA) ko'p bo'lganligi sababli, O. biennis urug'i moylari terining to'g'ri ishlashini yaxshilaydi va ayniqsa, ular surunkali dermatitli bemorlarda foydali ta'sir ko'rsatdi [11, 15].

Yaqinda O. biennis hujayra madaniyatidan olingan ekstraktlar o'z-o'zidan paydo bo'ladigan o'simliklardan olingan ekstraktlarni to'liq almashtirish uchun taklif qilindi, chunki ular biologik barqaror, ifloslantiruvchi moddalarsiz va standartlashtirilgan ikkilamchi metabolit aralashmalaridir [16]. Aynan birikmalarning sinergik ta'siri bilan kombinatsiyasi botanika ekstraktlarining umumiy faolligi uchun javobgardir [17].

Bu erda biz lignanlar va triterpenlarga boy O. biennis hujayra madaniyatining (ObHEx) gidrofil ekstraktiga e'tibor qaratdik, chunki u in vitro va ex vivo modellarida sinovdan o'tkazilganda terining qarishga qarshi xususiyatlarini ko'rsatdi [18]. Ushbu ekstraktning massa spektrometriyaga asoslangan kimyoviy tavsifi uning bir nechta qiziqarli ikkilamchi metabolitlarini o'z ichiga olganligini ko'rsatdi. Ular lignanlarga (salvadorazid va liriodendron) va triterpenlarga (muriatik kislota, arjunolik kislota, aspartik kislota va hederagenin) tegishli bo'lib, ularning ba'zilari ilgari inson fibroblastlarida pro-kollagen I ishlab chiqarish bilan bog'liq edi [19,20]. Xususan, ObHEx matritsa kollagen qisqarishini, aktin polimerizatsiyasini va ECM oqsillarini ishlab chiqarishni rag'batlantiradi, shu bilan miyozin engil zanjiri kinaz (MYLK) gen ekspressiyasini oshirish orqali terining qattiqligi va elastikligini yaxshilaydi.

Bugungi kunga qadar ObHEx ning terining qarishi va hujayra qarishiga ta'sirining molekulyar mexanizmlari, xususan, o'rganilmagan. Ushbu ish qarigan inson teri fibroblastlaridagi ObHEx faoliyatini o'rganishga qaratilgan. Ta'sir mexanizmi haqida maslahatlar olish va uni tekshirish va tekshirish uchun bio-ortogonal usullarni olish uchun biz ma'lumotlarga bog'liq bo'lmagan massa spektrometriyasining ultra chuqur proteomik yondashuvidan foydalandik (1-rasm).

2. Natijalar

Stressdan kelib chiqqan erta qarish (SIPS) vodorod periks (H2O2) bilan davolash orqali oddiy inson dermal fibroblastlarida (NHDF) amalga oshirildi. Oksidlanish stressidan kelib chiqqan keksa hujayralar qarish tadqiqotlari uchun ajoyib in vitro modeldir va H2O2 bunga erishish uchun keng qo'llaniladi [21,22].

ObHEx tomonidan qarigan NHDF hujayralarida o'zgartirilgan biologik yo'llarni tushunish uchun biz ultra chuqur proteomik yondashuvdan foydalandik. SIPS va nazorat xujayralari 48 soat davomida 0.01 foiz (p/v) da ekstrakt bilan ishlov berildi yoki davolanmadi, chunki [18] da xabar qilingan MTT tahlilidan buning natijasida bu eng yuqori konsentratsiyaga olib keladi. 48 soatlik inkubatsiyadan keyin har qanday hujayra toksikligi.

Keyin hujayra lizatlari triptik hazm qilish va nano-UPLC MS/MS tahlilidan o'tkazildi. Proteomaning optimal chuqurligini olish uchun massa spektrometriya ma'lumotlari Ma'lumotlardan mustaqil yig'ish (DIA) rejimida olindi, bu esa 9650 ta oqsilning ishonchli miqdorini aniqlashga imkon berdi (jadval S1), ma'lumotlarning to'liqligi 98 foiz. Bizning tadqiqotimiz hozirgi kunga qadar qarigan hujayralarning eng to'liq proteom tahlilini bildiradi.

2.1. Stress sabab erta qarish (SIPS) baholash

Avvalo, biz NHDFda qarish induktsiyasi muvaffaqiyatli bo'lganligini tekshirdik, H2O{1}}NHDF ning global proteomini massa spektrometriyasi (MS) orqali tahlil qildik va oqim sitometriyasi orqali ularning morfologiyasini o'rgandik.

2.1.1. Mass-spektrometriya (MS) orqali SIPS baholash

SIPS induksiyasini baholash uchun biz H2O2-davolangan NHDF hujayralarining umumiy proteomasini davolanmaganlar bilan solishtirdik. Deregulyatsiya qilingan 3256 ta oqsil orasida qarilikning bir nechta biomarkerlari sezilarli darajada o'zgarganligi aniqlandi (2A, B-rasm). Birinchidan, biz qarigan hujayralarning eng ko'p qo'llaniladigan biomarkeri, "karilik bilan bog'liq-ß-galaktosidaza" (SA- -gal, GLB1) ning yuqori regulyatsiyasini kuzatdik. Lizosomal fermentlarning GLB1 va to'qima alfa-L-fukosidaza (FUCA1) darajasining ortishi, shuningdek, MS tomonidan yuqori tartibga solinishi aniqlangan, qarigan hujayralar lizosomal tarkibidagi xarakterli o'sishni aks ettiradi [23,24]. Darhaqiqat, lizosomalar katabolik jarayonlarni qo'llab-quvvatlaydi, bu esa qarish bilan bog'liq sekretsiya uchun zarur bo'lgan energiya va xom ashyoni ta'minlaydi [25].

Ikkinchidan, DDR signalizatsiyasida ishtirok etadigan serin/treonin-protein kinaz ATR va serin-protein kinaz ATM ning oqsil darajasi ham ortganligi aniqlandi [26]. DDR yadroviy DNKning shikastlanishi bilan faollashadi, odatda hujayra qarishining o'rnatilishi bilan bog'liq va u p53 o'simta bostiruvchi faollashuviga aylanadi. Bunga qo'shimcha ravishda, giston 2A variantlari MACROH2A1 va MACRO2A2 ning yuqori regulyatsiyasi ham kuzatildi. Ushbu oqsillar qarigan hujayralarga xos bo'lgan zich va repressiv xromatin tuzilmalarining ATRga bog'liq bo'lgan Senescence Associated Heteroxromatin Foci (SAHFs) shakllanishida ishtirok etadi [1,2,27].

Nihoyat, siklinga bog'liq kinaz inhibitori 1A yoki p21 (CDK1NA) va proliferatsiya belgisi protein Ki-67 (MKI67) ning tartibga solinmagan darajalari G2 fazasida qarigan hujayra siklini to'xtatishni aks ettiradi [28,29]. Haqiqatan ham, p21 darajalarni oshiradi, bu DNKning shikastlanishi bilan qo'zg'atilgan p53 yo'li bilan yordam beradi va CDK2-siklin E kompleksini inhibe qiladi. Bu retinoblastoma oqsilining (RB) fosforillanishiga olib keladi, u o'zining gipo-fosforlangan holatida hujayra siklining rivojlanishiga yordam beruvchi transkripsiya omili E2F ni sekvestr qiladi [2].

Qarishning allaqachon ma'lum bo'lgan belgilaridan tashqari, H2O2 tarkibidagi eng ko'p tartibga solinadigan oqsillarni nazorat qilish hujayralariga nisbatan boyitish yo'llarining kengroq tahlili DNK shikastlanishi natijasida kelib chiqqan p53/p21 yo'lining faollashuviga ishora qiladi (2C-rasm, S2-jadval). Buning o'rniga, proliferatsiya va mitoz bilan bog'liq bo'lgan oqsillar pastga qarab tartibga solinadi, natijada proliferatsiyaning to'xtatilishiga ishora qiladi (2D-rasm, S3-jadval).

2.1.2. Oqim sitometriyasi orqali SIPS baholash

SIPS ham oqim sitometriyasi tahlili bilan tasdiqlangan. Biz qarigan hujayralardagi lizosomalar soni va hajmining ortishi hisobiga H2O2-davolangan hujayralarning sitoplazmatik granularligining oshishini kuzatdik (rasm S1A, B). Bu disfunktsional lizosomalarning bosqichma-bosqich to'planishi va yangilarini ishlab chiqarish o'rtasidagi muvozanat natijasidir [25]. Bundan tashqari, biz lizosomal ichidagi lipofusin agresomalarining to'planishini ham aniqladik: oqim sitometrining 525/50 nm tarmoqli kanalida avtofluoresansning ko'payishi bilan bog'liq bo'lgan bu o'sish lizosomal nosozlik bilan bog'liq qarishning yana bir belgisidir (S-rasm, S1C). D) [30].

2.2. ObHEx qisman tiklangan mitotik oqsillar qarigan NHDF hujayralarida tartibga solinmaydi.

ObHEx bilan davolash qarigan holatda tartibga solinmagan 71 ta oqsil darajasini qisman tiklashga muvaffaq bo'ldi (ikki tomonlama ANOVA testi q-qiymati < 0.05). Aniqrog'i, 46 ta oqsil ekstrakti tomonidan pastga tushirilgan va 25 tasi yuqori tartibga solingan (3A-rasm, S4 va S5 jadvallari).

ObHEx tomonidan darajalari pasaytirilgan 46 ta oqsilning reaktom bilan boyitish tahlili shuni ko'rsatadiki, ekstrakt p53 yo'lining faollashuvini kamaytirishi va fosfatidilinositol metabolizmiga va kirpi signaliga ta'sir qilishi mumkin, ularning o'zgarishlari qarishda aniqlangan [31,32] (3B-rasm, S6-jadval).

25 ta yuqori tartibga solingan oqsillarga kelsak, boyitish tahlili mitotik hujayra sikli yo'lining qayta faollashishiga, xususan, DNKning ochilishi va replikatsiyasiga, xromosoma kondensatsiyasiga va opa-singil xromatidlarning rezolyutsiyasiga ishora qiladi (3C-rasm, S7-jadval).

Chuqur tahlil shuni ko'rsatadiki, tiklangan 25 ta oqsildan 18 tasi bir-biriga kuchli to'planadi (4A-rasm). Ushbu klasterda CDK1 ni, kondensin I kompleksining barcha bo'linmalarini (SMC2, SMC4, NCAPD2, NCAPH va NCAPG), uchta kinetoxor bilan bog'liq oqsillarni (KNTC1, NUF2 va TRIP13), barcha oltita subbirliklarni ajratish mumkin. replikativ minixromosoma ta'minoti (MCM) kompleksining (MCM2-7) IQGAP3, PBK va DHFR bilan birga.

ObHEx ning ushbu oqsillar darajasini qisman tiklash qobiliyati 4B-rasmdagi profil chizmalarida yaxshi ko'rsatilgan: ekstrakt bilan ishlov berilgan yoki o'tkazilmagan proliferatsiya qiluvchi hujayralarda oqsillarni ifodalash darajasi asosan o'zgarmagan, qarigan hujayralarda tushib ketgan va keyin qisman ortgan. ObHEx bilan davolash.

2.3. Biologik tahlillar ObHEx promitotik ta'sir mexanizmini tasdiqladi

Qarigan hujayralarning eng keng tarqalgan belgisi bu bo'yash tahlili bilan baholanishi mumkin bo'lgan SA{0}}gal faolligining oshishi hisoblanadi. Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, H2O2 bilan davolash SA{3}}gal musbat hujayralar (ko'k) sonining 4,7 foizdan 22,9 foizgacha sezilarli o'sishiga olib keldi (5A, B-rasm). ObHEx inkubatsiyasi SA{9}}gal faolligini 38,4 foizga (p <0,01) sezilarli darajada kamaytirdi.

Bundan tashqari, ObHEx tomonidan mitotik oqsil ifodasini tiklash hujayra siklining qayta faollashishiga olib keladimi yoki yo'qligini baholash uchun nazorat va qarigan hujayralar 72 soat davomida ekstrakt bilan ishlov berildi yoki ishlamadi va Floresan faollashtirilgan hujayralarni saralash (FACS) tajribalari o'tkazildi. Qarigan hujayralar natijalari hujayra siklining G2/M fazalarida bloklanganligini ko'rsatdi (36,8 foiz), nazorat hujayralarining atigi ancha past qismi (7,2 foiz) adabiyotga ko'ra, qo'shilish nuqtasiga yetganligi sababli bu fazalarda bo'lgan. 33] (5C, D-rasm). Qarigan hujayralarni ObHEx bilan davolash G2/M populyatsiyasini 4,3 foizga kamaytirishga muvaffaq bo'ldi (p < 0.05). Shunisi e'tiborga loyiqki, SIPSdan so'ng hujayraning qarish qismi (22,9 foiz) bilan bog'liq bo'lsa, G2/M ning qochishi 18,9 foizni tashkil qilishi mumkin. 48 soat davomida bir xil ObHEx bilan davolash amalga oshirildi, ammo natijalar statistik ahamiyatga ega emas edi.

【Batafsil ma'lumot uchun:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】