qo'shimcha ma'lumot uchun:ali.ma@wecistanche.com

Qism: II kattalar zebra baliqlarida sistinoz modelidagi buyrak va buyrakdan tashqari ko'rinishlar

2.3.5. Ctns−/− zebrafish hozirgi vaqtda shox pardaning qalinligi oshgan

Sistinozko'zlarga ta'sir qiladi, bu esa ìrísí, kon'yunktiva va retinal epiteliy kabi bir nechta to'qimalarda sistin to'planishiga olib keladi, ammo shox parda sistin to'planishi tufayli eng ko'p ta'sirlangan qismdir [19] va qalinlikni oshiradi [20]. H&E bo'yashidan foydalanib, biz ctns-/-zebrafish yovvoyi turdagi zebrafish bilan solishtirganda shox pardaning stromal qatlamining qalinlashganini ko'rsatdi (10A, B, E-rasm). Biroq, biz ctns-/-zebrafishning retinal epiteliyasida aniq anormalliklarni aniqlamadik (10C, D-rasm).

9-rasm. Yovvoyi va ctns-/-zebrafishlarda o'rtacha suzish tezligi. O'rtacha tezlik ctns-/-zebrafishlarda ikkala jinsdagi yovvoyi turga nisbatan kamayadi. O'rtacha suzish tezligi piksel/sekundda o'lchanadi. Har bir nuqta bitta zebrafishni ifodalaydi, jami n ta=6 yovvoyi va n=6 ctns−/−18- oylik zebrafish. Fisherning eng kam ahamiyatli farqi (PLSD) testi bilan ikki tomonlama ANOVA: ** p <>

1-rasm0. Yovvoyi turdagi va ctns-/- zebrafishlarda ko'z gistologiyasi. (A, B) Yovvoyi tipdagi (A) va ctns−/− (B) 18- oylik zebrafish shox pardasining reprezentativ tasvirlari. Shox pardaning stromal qatlami (qora o'qlar va qora chiziqlar). H&E bo'yash. O'lchov chiziqlari 50 mikronni tashkil qiladi. (C, D) Yovvoyi tipdagi (A) va ctns−/− (B) zebrafishlar retinasining vakillik tasvirlari. H&E bo'yash. O'lchov chiziqlari 50 mikronni tashkil qiladi. (E) Shox pardaning stromal qatlami qalinligining nisbiy miqdori. Har bir nuqta shox pardaning stromal qatlami qalinligining bitta fiksiyasini ifodalaydi. Welchning tuzatishi bilan juftlashtirilmagan t-testi, ikki dumli: * p <>

2.3.6. Qo'shimcha Ctns−/− Zebrafish fenotiplari

Yuqorida aytib o'tilgan fenotiplarga qo'shimcha ravishda, biz miya va qon tomirlarining gistologik tahlilini -/- va yovvoyi tipdagi baliqlar o'rtasida farq qilmasdan o'tkazdik. Bundan tashqari, biz ctns-/- va yovvoyi turdagi zebrafishlarning tana uzunligini va vaznini 18 oyda baholadik va biz tana vazni ortib bordi-/-zebrafish, shu bilan birga, har ikkala jinsdagi ctns-/-zebrafishda tana uzunligining ortishi aniqlandi (Qo'shimcha rasm 1).

3. Munozara

Oxirgi oʻn yilliklar davomida,sistinozbolalik davridagi halokatli kasallikdan davolanib bo'ladigan metabolik kasallikka aylandi, bunda bemorlar balog'at yoshida omon qolishi va keksa yoshga etishi mumkin [21,22]. Bemorlarning uzoq umr ko'rishlari kasallikning yangi fenotiplarini ochib berdi va terapiyaning patogenezi va uzoq muddatli ta'siri bo'yicha yangi savollar tug'dirdi. Shu munosabat bilan, sistinozning kattalar hayvonlari modellarini o'rganish tobora dolzarb bo'lib bormoqda.

Joriy tadqiqotda biz buyrak va ekstrarenalni tekshirdik 40-50 yoshdagi inson yoshiga to'g'ri keladigan 18 oylik sistinozinanadultzebrafishmodelining namoyon bo'lishi [23,24]. Birinchidan, biz kattalar ctns-/- zebrafish modeli butun tanada va turli organlarda sistin to'planishini taqdim etishini tasdiqladik. Inbuyrak, gistologik darajada biz ko'plab gialinga o'xshash eozinofil tomchilar, sitoplazmatik vakuolalar va cho'tka chegaralarining qisman yo'qolishi bilan aks ettirilgan PTEC shikastlanishining belgilarini kuzatdik. Bundan tashqari, ctns-/-erkak zebrafish glomerulyar gipertrofiyani rivojlantirdi. Nihoyat, biz ctns-/-zebrafishning buyrak PTECida ajralgan-kaspaza 3 ifodasi ortganligini ko'rsatdik, bu apoptozning zebrafishdagi nefropatik sistinoz patogenezida ishtirok etishini ko'rsatadi. berisistinozbemorlarda ekstrarenal ham bor Biz zebrafish modelimizdagi ctns-/− mutatsiyasining boshqa organlarga ta'sirini o'rganib chiqdik. Qizig'i shundaki, biz ctns-/-mutatsiyasining teri anatomiyasining buzilishiga olib kelishi va unumdorlikka, tayanch-harakat faolligiga va ko'zlarga ta'sir qilishini aniqladik.

Lizosomalar hujayra ichidagi ovqat hazm qilish joylari bo'lib, hujayra metabolizmining muhim koordinatorlari hisoblanadi [25]. Lizosomal saqlash kasalligi bo'lib, asosiy xususiyatisistinozlizosomal sistin to'planishidir [26,27]. Qizig'i shundaki, biz yovvoyi turga nisbatan sistinoz zebra balig'ining butun tanasida 54-baravar ko'payganini aniqladik, avvalgi tadqiqotimizda [10] urug'lantirilgandan keyin 6 kun ichida sistinoz zebra balig'i 13- barobar ortishi. Umuman olganda, bu ma'lumotlar sistin zebrafish sistinozida hayot davomida to'planishini ko'rsatadi. Suyuqlik xromatografiyasi va massa spektrometriya tahlili shuni tasdiqladiki, barcha organlar orasidabuyraksistin to'planishi uchun afzal qilingan joy sare. Lizosomalar ichidagi lizosomal shish va gialinga o'xshash eozinofil tomchilar sistin yuklangan PTEC [28,29] va inson biopsiyalarida sistin kristallari interstitsial makrofaglar va PTEC sitoplazmasida polimorf shakldagi bo'shliqlar sifatida ko'rinadi [27]. Inson to'qimalarida sistinning to'planishi va kristallanishi hayot davomida sodir bo'ladigan kümülatif jarayondir. Lichinkalar bosqichida ctns-/-zebrafishda inline, sistin kristallari aniqlanmadi [10], bizning tajriba tajribalarimizda biz sistin kristallarining polimorf shakli 3 va 6 oylik yoshda paydo bo'lishini va aniq ko'rinib turishini aniqladik. 18-oylik yoshida sistinoz ta'sirining tobora kuchayib borishini ko'rsatadi.buyrak.

ga bosingBuyrak kasalligi uchun Cistanche ta'siri

Glomeruliyalarning gistologik o'zgarishlarini baholash uchun biz Bowman kapsulasi, glomerulyar tutam va Bowmanning ctns-/-zebrafish bo'shlig'ining PAS bilan bo'yalgan qismlarida sirt maydonlarini o'lchadik. Biz ctns-/-zebrafish glomerulyar gipertrofiyani rivojlantirganini aniqladik, bu esa giperfiltratsiyani ko'rsatadi. -/-zebrafishda kuzatilgan yumshoq glomerular zarar zebrafishning tiklanish qobiliyati bilan bog'liq bo'lishi mumkin.buyrak, yangi nefronlarni qo'shish imkoniyatiga ega bo'lish, shuningdek, mavjud nefronlarni ta'mirlash [30].

Gistologik shikastlanishga qo'shimcha ravishda, sistin to'planishi proteinkinazni PTECning apoptozisini faollashtirishi ko'rsatilgan [12]. Shunday qilib, biz PTEC-da kesilgan kaspaza-3 ifodasini baholadik va ctns-/-zebrafish ortib borayotgan kaspaza-3 va yadro parchalanishini ko'rsatdi. Parchalangan kaspaza-3 mavjudligi asosan sitoplazmatik vakuolalarni to'plagan hujayralarda topilgan, bu apoptozning shikastlangan PTEKda sodir bo'lishini ko'rsatadi. Apoptozning kuchayishini tushuntirishi mumkin bo'lgan qo'shimcha mexanizmlardan biri sistin to'planishi bilan bog'liq bo'lgan glutationning kamayishi tufayli reaktiv kislorod turlarining mavjudligi bo'lishi mumkin [31]. Biroq, bu mexanizm ctns-/-zebrafishlarda ham sodir bo'lishini baholash uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab qilinadi.

GarchibuyraklarBirinchi va eng og'ir ta'sirlangan organlar;sistinozko'p tizimli kasallik bo'lib, unda teri, jinsiy bezlar, ko'zlar va mushaklar kabi turli organlar ishtirok etadi. Adabiyotlardan ma'lumki, sistinozli bemorlarda terining erta qarishi, sarg'ish sochlar va ochiq teri rangi ko'pincha namoyon bo'ladi [13]. Oxirgi fenotip sistinozin transporterining melaninsintez regulyatsiyasi[32] va yangi kashf etilgan sistein tashuvchisi MFSD12 [33] orqali quyuqroq pigmentatsiyani saqlab turishi bilan bog'liq. Ajablanarlisi shundaki, bizning kattalar ctns-/-zebrafish modelimiz hipopigmentatsiyalangan va dog'li teri naqshini taqdim etdi va lichinka bosqichida kuzatilmagan melanin tarqalishini ko'rsatdi [10].

Qo'shimcha,sistinozerkaklarda bepushtlikka olib keladi, ayollar esa unumdor bo'lishi ma'lum [14]. So'nggi ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, bepushtlik moyakning progressiv degeneratsiyasi, bu sperma sifatining o'zgarishiga olib kelishi yoki erkaklarning ajralib chiqish tizimining aniqlanmagan qismidagi obstruktsiya tufayli bo'lishi mumkin. To'siq bo'lgan tuzilmalar sperma sifatiga ta'sir qilishi mumkin, ayniqsa kanallari juda kichik diametrga ega bo'lgan hududlarda, masalan, rettestis[16]. Inzebrafish, genicprocessis uchun sperma sutemizuvchilarga juda o'xshaydi; ammo asosiy farqlardan biri spermatogenezning kistalarda sodir bo'lishidir [34]. Bizning tadqiqotimizda biz ctns-/-zebrafish spermatogen kistasida spermatozoidlarning ko'payishini aniqladik, ammo biz moyak degeneratsiyasi belgilarini topmadik. Shunday qilib, tavsiflangan fenotip moyak darajasidagi obstruktsiyani ko'rsatishi mumkin, bu esa spermatozoidlarning atrof-muhitga kamroq chiqishiga olib keladi, ammo bu farazni tasdiqlash uchun qo'shimcha tadqiqotlar o'tkazish kerak. Funktsional darajada tuxum sonining kamayishi va urug'langan tuxumlarning kamayishi ctns-/-zebrafishlarning unumdorligining buzilishini aks ettiradi.

Yana bir klinik ko'rinishsistinoz, odatda, hayotning ikkinchi o'n yilligidan boshlab bemorlarga ta'sir qiladigan miyopatiya, mushaklarning zaifligi va zaifligi bilan tavsiflanadi [1]. Qizig'i shundaki, biz ctns-/-katta zebrafishning nazorat bilan solishtirganda tayanch-harakat faolligini kamaytirganini aniqladik, bu esa mushaklarning buzilgan funktsiyasini ko'rsatadi. Shunisi e'tiborga loyiqki, bu fenotip lichinkalarda mavjud emas edi [10], bu kasallikning keyingi bosqichida ctns-/-zebrafishlarga ta'sir qilishini ko'rsatadi. Shunga qaramay, mushaklarda ko'rinadigan gistologik farqlar aniqlanmadi. Lokomotor faollikning pasayishi mitoxondriyal disfunktsiyaga bog'liq bo'lishi mumkin, uni muntazam gistologik tadqiqotlar bilan aniqlab bo'lmaydi [35-37]. Demak, sistinoz zebrafishdagi mitoxondriyalarning har tomonlama tavsifi qo'shimcha baholashni talab qiladi.

Yuqorida qayd etilgan fenotiplarga qo'shimcha ravishda, bir nechta tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, sistinozli bemorlarda fotofobi va blefarospazm [1] kabi ko'z belgilari ham namoyon bo'ladi, shox parda ko'zning eng ko'p zararlangan qismlaridan biri bo'lib, sistin kristallarining to'planishi va qalinligi oshishiga olib keladi [20]. Biroq, shox pardaning qalinligining oshishi sabablari haqida kam narsa ma'lum. Masalan, tasvirlangan fenotip epiteliya va/yoki endotelial hujayralarning subklinik disfunktsiyasi tufayli tostromaledemaga olib keladi [20]. Bizning tadqiqotimizda ctns−/−adultzebrafishdisplaying ortishi shox pardaning stromal qatlamining qalinligi ekanligini aniqladik, bu bizning modelimiz shox parda disfunktsiyasi belgilarini ko'rsatishini ko'rsatadi.sistinoz.

Cistanche uchunbuyrakfunktsiyasi

Har tomonlama tushunish uchun to'ldirish kerak bo'lgan asosiy bo'shliqlardan birisistinozinson kasalligini to'liq aks ettiruvchi hayvon modelining yo'qligi. Sichqonchaning bir nechta modellari ishlab chiqilgan bo'lib, ular sistin to'planishini ko'rsatadi, ammo to'liq qayta ishlab chiqara olmaydi.buyrakfenotipi [8,26]. Xususan, C57BL/6 sichqonchasi bir necha organlarda sistin to'planishini ko'rsatdi, bu yosh bilan ortadi [8]. Bundan tashqari, C57BL / 6 sichqoncha modeli 6 oylik yoshdan boshlab proksimal quvurli lezyonlarni ko'rsatadi. Xuddi shunday, bizning modelimizda proksimal quvurli lezyonlar vaqt o'tishi bilan yomonlashadi. Biroq, glomerulyar darajada, C57BL / 6 sichqoncha modeli normal fenotipni taqdim etdi, bizning kattalar zebrafish modeli esa glomerulyar gipertrofiyani ko'rsatadi. Bundan tashqari, C57BL/6 sichqoncha modeli odamlarda kuzatilgan tug'ilishning buzilishiga taqlid qila olmaydi, ctns-/-zebrafish modeli esa spermatozoidlar bilan boyitilgan spermatogen kistalarni va tuxum ishlab chiqarishni kamaytiradi. Ko'z darajasida ikkala sichqoncha [38] va boshqa -/-zebrafish modelida ko'zning anormalliklari mavjud. Aksincha, teri darajasida ushbu sichqoncha modeli melatonin ishlab chiqarishning buzilishini ko'rsatmaydi [8], bu kattalar zebrafish modelida hipopigmentatsiyalangan teri namunasi sifatida namoyon bo'ladi. Nihoyat, xulq-atvor darajasida bizning ctns-/- zebrafish modelimiz tayanch-harakat faolligining pasayishini ko'rsatadi, bu mitoxondrial funktsiyaning buzilishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin yoki bu og'irlikning ko'payishining ikkilamchi ta'siridan kelib chiqishi mumkin.sistinozzebrafish. Umuman olganda, bizning ctns−/− zebrafish modelimiz inson kasalligini yaxshiroq aks ettiradi. Yaqinda Shimizu va boshqalar. taqdim etilgan kalamush shtammida yangi tug'ma Ctnugl mutatsiyasini o'rnatdibuyraklizosomalaridagi lezyonlar va sistin kristallaribuyrakkorteks [7]. Biroq, modelning batafsil tavsifi hali ham mavjud emas. Shu sababli, inson kasalliklarini takrorlaydigan yangi funktsional modellarni ishlab chiqish va tavsiflashga shoshilinch ehtiyoj bor.

Xulosa qilib aytganda, biz kattalardagi ctns-/- zebrafish modelimiz sistin qumtepasining bir nechta inson fenotiplarini ko'paytirishini ko'rsatdik, bu kattalardagi kasallikning patogenezini o'rganish va buyraklar va ekstraktlarni tuzatish uchun yangi dorilarning uzoq muddatli ta'sirini sinab ko'rish uchun foydali bo'lishi mumkin.buyrakko'rinishlari.

4. Materiallar va usullar

4.1. Zebrafishlarni parvarish qilish va ko'paytirish

Zebrafish KU Leuven hayvonlar farovonligi qoidalariga (Axloqiy tasdiqlash №142/2019) muvofiq ishlov berilgan va parvarish qilingan. Ushbu tadqiqot uchun biz 18 oylik ctns−/−zebrafish va ikkala jinsdagi yovvoyi turdagi nazorat zebrafishlarini kiritdik. Ctns-/-zebrafish yaratish tafsilotlari bizning oldingi tadqiqotimizda tasvirlangan edi [10].

4.2. Sistinni o'lchash

Tsistin darajalari zebra baliqlarida (yovvoyi tipli baliq, n=3va ctns−/−erkak baliqlarda, n=3) o'lchandi va miqdori nmol/mg oqsillar sifatida ifodalandi. Birinchidan, zebrafishlar trikain metansulfonat MS-222 (300 mg/L) ga botirilib qurbon qilindi, so‘ngra to‘qima namunalari 200 mL 5 mM N-etilmaleimid (NEM,) ishtirokida sonikatsiya qilindi. Sent-Luis, MO, AQSH, Sigma-Aldrich E3876) Dulbekkoning fosfat-buferli tuzida (PBS), har bir lizat uchun maksimal 200 mg to'qimalar uchun. Keyinchalik, har bir gomogenatga 100 µL 12% sulfosalitsil kislotasi (SSA) qo‘shildi va namunalar 12,{15}} g haroratda 10 daqiqa, 4◦C davomida santrifüj qilindi. Tarkibida sistin boʻlgan supernatantlar tahlil vaqtigacha -80◦C da saqlanadi, granulalar esa 300 µL 0,1 M NaOHda 4◦C da kechasi davomida eritiladi va Pirs BCA Protein Assay Reagent Kit yordamida oqsil oʻlchanguncha -80◦C da saqlanadi. Keyinchalik, sistin miqdori (nmol) har bir namunadagi protein miqdori (mg) ga normallashtirildi. Keyinchalik, 50 mkL ichki standart eritma (Cystine d6) bilan sistin o'z ichiga olgan supernatantning 50 mkL qismi siqildi va 5 soniya davomida vortekslandi; keyin aralashma 200 mkl asetonitril bilan ekstraksiya qilindi, 30 soniya davomida vortekslandi va keyin 16,{31}} g haroratda 9 daqiqa davomida santrifüj qilindi. Suyuqlik xromatografiyasi va massa spektrometriyasi tahlili musbat ion (ESI plus) rejimida ishlaydigan ESI-JET-STREAM manbai bilan jihozlangan UHPLCAgilent1290InfinityII6470(Agilent texnologiyalari, Santa Clara, CA, AQSH) tomonidan amalga oshirildi. Ushbu uskunani boshqarish va ma'lumotlarni tahlil qilish uchun dastur MassHunter (Ish stantsiyasi Agilent Technologies, Barselona, ​​Ispaniya) edi. Ishlatilgan ajratish ustuni InfinityLab Poroshell 120 HILIC 1,9 µm 100×2,1 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, AQSH).

4.3. Gematoksilin va eozin va davriy kislotali bo'yash

Zebrafish (yovvoyi tipdagi urgʻochi baliq, n=3; yovvoyi tipdagi erkak baliq, n=3; ctns−/− urgʻochi baliq, n=3; ctns−/−erkak baliq, n=3) trikain metansulfonat MS-222 (300 mg/l) ga botirish bilan qurbon qilindi, soʻngra butun zebrafish 4 foizli tamponlangan paraformaldegidga (4 foiz PFA) 4 ◦C da 1 hafta davomida mahkamlandi. . Ikki marta PBS bilan yuvilgandan so'ng, zebra baliqlari yana 1 hafta davomida dekaltsifikatsiya qilish uchun EDTA eritmasiga (100 mM, pH=8) o'tkazildi, so'ngra kerosin ichiga singdirildi. Parafin oʻrnatilgan zebrafish toʻqimasi kesilgan(4-mkm qalinlik)onaLeicamicrotome(LeicaBiosystems, Wetzlar, Germaniya). Bo'limlar standart protokollarga muvofiq H&E va PAS bilan bo'yalgan.

Forgistologik tadqiqotlar zebra baliqlari ko'zlari (yovvoyi tipdagi ayol baliqlari, n =3vactns-/− urg'ochi baliqlar, n=3), ko'zlar enukleatsiya qilingan va xona haroratida 4 soat davomida 4 foizli PFAda o'rnatilgan. Optimal kesish harorati muhitiga quyidagi kiritish (Tissue-Tek® VIP®; Sakura Finetek, Yaponiya), 10-mkm kriyosektsiyalar amalga oshirildi (Cryostar NX70, Thermofisher Scientific, Tokio, Yaponiya). Bo'limlar standart protokollarga muvofiq H&E bilan bo'yalgan. Tasvirlar Leica yorqin maydon mikroskopi (Leica DM6, Vetslar, Germaniya) yordamida olingan.

4.4. Immunogistokimyo (Yorilgan kaspaza-3 bo'yash)

Yangi uzilgan zebrafish to'qimalariga ega bo'laklar deparafinizatsiya qilindi va regidratatsiya qilindi. Bo'limlar 10 mM sitrat buferi (pH=6) yordamida issiqlik bilan induktsiya qilingan antigen olishdan o'tkazildi. dPBSda 5 foizli Oddiy echki zardobi (NGS) bilan bloklangandan so'ng, bo'limlar quyonlarga qarshi bo'linishga qarshi kaspaza-3 (Cell Signaling, Danvers, MA, AQSH, 1:200 suyultirish) va keyin quyonga qarshi inkubatsiya qilindi. -Envision, HRP bilan belgilangan ikkilamchi antikor (Dako Products, Agilent, Santa Clara, CA, AQSH). Salbiy nazorat sifatida oddiy quyon sarumidan foydalanilgan. Xromogen sifatida diaminobenzidin (DAB, DAKO, Glostrup, Daniya) ishlatilgan. Keyinchalik, bo'limlar H&E bilan bo'yalgan, suvsizlangan va o'rnatilgan.

Buyrak kasalligini davolash: Cistanche

4.5. Toluidinli ko'k bo'yash va TEM

zebrafishbuyrakto'qimalar (yovvoyi turdagi erkak zebrafish, n=3 va ctns-/-erkak zebrafish, n=3) yig'ib olindi va EM fiksatsiya tamponida (soat 1,5 foiz glutaraldegid/1 foiz paraformaldegid) o'rnatildi. . Keyinchalik, buyrak to'qimalari fiksatsiya tamponida (0,1 mol/L kakodilatlar, 0,1 mol/l saxaroza, pH 7,4) va 1,5 foizli glutaraldegid/1,2 foiz akrolein bilan mahkamlangan. foiz osmiy tetroksidni tashkil qiladi va qatronga singdiriladi. Yarim yupqa qismlar (0.5-mkm qalinligi) toluidin ko'k bilan bo'yalgan. Ultra yupqa bo'laklar uranil asetat bilan bo'yalgan. Tasvirlar JEM{22}} EX transmissiya elektron mikroskopi (JEOL Ltd, Tokio, Yaponiya) yordamida turli kattalashtirish bilan yig‘ilgan.

4.6. Raqamli tasvir tahlili

Bo'yalgan slaydlar Philips Ultra-Fast Scanner 1.6 RA (Philips, Eyndxoven, Niderlandiya) yordamida raqamlashtirildi.

4.6.1. Glomerulyar gipertrofiya tahlili

Zebrafishlarda glomerulyar gipertrofiyani tahlil qilish uchun PAS bilan bo'yalgan slaydlarda Bowman kapsulasi, Bowman bo'shlig'i va glomerulyar tupining sirt maydoni (mk2) o'lchandi. Har bir bo'limda mavjud bo'lgan barcha glomerullar kiritilgan va ImageJ dasturi yordamida o'lchangan. Statistik tahlil uchun har bir zebrafishning o'rtacha o'lchovlari ishlatilgan.

4.6.2. Cleaved Caspase-3 Ifoda tahlili

Twoobserversscoredthecleavedcaspase-3expressioninthetubulesofeachzebrafish. The semiquantitative score was conducted on the three randomized tubular fields in each zebrafish(20×magnification). Thepercentageofcaspase-3positivearearelativetothetotal area of tubules was scored as 1 (negative staining), 2 (1–10% positive staining), 3 (10%–25% positive staining), 4 (>25 foiz ijobiy bo'yash). Statistik tahlil uchun har bir zebrafishning o'rtacha balli ishlatilgan.

4.6.3. Korneal stroma tahlilining qalinligi

Zebrafish shox pardasi stromasining qalinligi (10 × kattalashtirish) zebrafishdagi ImageJ dasturi yordamida ko'z markazidan bir xil masofada o'lchandi. Har bir rasm uchun ko'z bo'limining turli joylarida (markaziy, o'rta, periferiya) n=7 o'lchov 100 mkM oraliqda shox parda bo'ylab olingan. Statistik tahlil uchun o'lchovlarning o'rtacha qiymati ishlatilgan.

4.7. Fertillikni o'rganish

Fertillik urgʻochi va erkak zebra baliqlarining (yovvoyi turdagi erkak baliq, n=4 va yovvoyi tipdagi urgʻochi baliq, n=6 va ctns−/−erkak baliq, n=4 juftlanishi orqali baholandi. va ctns−/−urg‘ochi baliq, n=6) yumurtlama tepsisidagi. Ertasi kuni ertalab, yorug'likdan bir soat o'tgach, embrionlar yig'ildi va ishlab chiqarilgan tuxumlarning umumiy soni qayd etildi. Urug'langan tuxumlar skriningdan o'tkazildi va yorug'lik mikroskopi yordamida unumsiz tuxumlardan hisoblandi. Ko'paytirish haftada bir marta ketma-ket n=7 marta amalga oshirildi. Yovvoyi turdagi va ctns-/-zebrafishlarda bir vaqtning o'zida tuxum ishlab chiqarilmaydigan ikkita tajriba chiqarib tashlandi.

4.8. Harakatlanish faoliyati

Zebrafish (yovvoyi tipdagi urgʻochi baliq, n=6; yovvoyi tipdagi erkak baliq, n=6; ctns−/− urgʻochi baliq, n=6; ctns−/−erkak baliq, n=6) oddiy turar-joy binolariga joylashtirildi va 5 daqiqalik moslashish vaqtidan so'ng, 5 daqiqa davomida filmga tushirildi. Videoyozuv rezervuarning tepasida joylashgan GoPro® HERO 7 yordamida amalga oshirildi va bu baliq suzishning yuqoridan ko'rinishini taqdim etdi. Ruxsat va kvadrat tezligi mos ravishda 1080 p (1920 × 1080) va 30 fps ga o'rnatildi. Tajriba davomida videolar individual zebrafshth traektoriyalarini kuzatib borish. Keyinchalik har bir guruhda o'rtacha harakat tezligini (piksel/sek) olish uchun traektoriyalar maxsus piton kodi bilan tahlil qilindi [39].

Cistanche-buyrak

4.9. Tana vazni va uzunligi o'lchovlari

Zebrafish 300mg/Loftrikainemetansülfonat MS-222 ichiga immersion bilan zararsizlantirildi. Tashqi stimulyatorlarga javob yo'qligi aniqlangandan so'ng, evtanizatsiya qilingan zebrafish qog'oz ro'molchaga joylashtirildi va quritildi. Evtanizatsiya qilingan zebrafishning uzunligi og'izning uchidan kaudal pedunkulgacha o'lchangan kaliper yordamida baholandi. Evtanizatsiya qilingan zebrafishning vazni analitik shkala bilan baholandi.

4.10. Statistik tahlil

Statistik tahlil SPSS (IBM, Nyu-York, NY, AQSh) va GraphpadPrism (GraphPadSoftware, LaJolla) yordamida amalga oshirildi. Ikki dumli Welch tuzatishi bilan juftlashtirilmagan t-testidan foydalangan holda ma'lumotlarning ikki guruxlari tahlil qilindi. Ikki toifali mustaqil o'zgaruvchilarning ma'lumotlari Fisherning eng kam ahamiyatli farqi (PLSD) testi bilan ikki tomonlama ANOVA bilan tahlil qilindi. p < 0.05="" bilan="" farqlar="" statistik="" jihatdan="" ahamiyatli="" deb="">

4.11. Fertillikni o'rganish

Yovvoyi turdagi va ctns-/-zebrafish o'rtasidagi tuxum ishlab chiqarish sur'atlarini taqqoslash uchun stavkalarning tajribalar bilan o'zaro bog'liqligini hisobga olish uchun mustahkam standart xatolarga ega bo'lgan umumlashtirilgan taxminiy tenglamalar yordamida Puasson regressiya tahlili o'tkazildi. Imkoniyatlarni taqqoslash uchun yovvoyi turdagi va ctns-/−zebrafish o'rtasida ishlatilgan tuxumlardan foydalanilgan. Eksperimentlar ichidagi koeffitsientlarning korrelyatsiyasini hisobga olish uchun mustahkam standart xatolarga ega bo'lgan umumlashtirilgan taxminiy tenglamalar yordamida alogistik regressiya tahlili o'tkazildi.

Qo'shimcha materiallar: Quyidagilar https://www.mdpi.com/article/ 10.3390/ijms22179398/s1 saytida mavjud.

Muallif hissalari: Konseptualizatsiya, SPB, JH, LvdH, HJB, EL; metodologiya, SPB, JH, LDG, HT, TN, PB, SC, BG; dasturiy ta'minot SPB, JH, LDG, HT, TN; tekshirish, SPB, JH, LDG, PB, LvdH, HJB va EL; rasmiy tahlil, SPB, JH, LDG, HT, TN; tergov, LvdH, HJB, EL; resurslar, HJB va EL; ma'lumotlar kuratsiyasi, SPB, JH, LDG, LvdH, HJB, EL; yozish-asl qoralama tayyorlash SPB, JH; yozish - ko'rib chiqish va tahrirlash, LvdH, HJB, EL; vizualizatsiya, LvdH, HJB, EL; nazorat, PdW, LvdH, HJB, EL; loyiha ma'muriyati, LvdH, HJB, EL; moliyalashtirish sotib olish, HJB, EL Barcha mualliflar qo'lyozmaning nashr etilgan versiyasini o'qib chiqdilar va rozi bo'ldilar.

Moliyalashtirish: Mualliflar KULeuvenC1GranttoE.L.ning ichki fondini tan olishni istaydi. (C14/17/113), Xitoy stipendiya kengashi JHga grant (CSC n◦ 201508500109) va FWO LDG (12I3820N) uchun doktorlikdan keyingi stipendiya.

Institutsional Tadqiq Kengashining bayonoti: Tadqiqot Xelsinki Deklaratsiyasining ko'rsatmalariga muvofiq o'tkazildi va KU Leuven Etika qo'mitasi tomonidan n.142/2019 tomonidan tasdiqlangan. Minnatdorchilik: Biz minnatdorchilik bildiramiz: Didye Kannini ctns−/− va yovvoyi tipdagi miya gistologiyasini baholagani uchun, KathleeenLambaerts, FredérikHendrikxandKimvanKelst, KU Leuven aquatics uchun texnik yordami va yordami uchun. TEM va Ron Wolterbeek statistik tahlil uchun.

Manfaatlar to'qnashuvi: Mualliflar manfaatlar to'qnashuvini e'lon qiladilar. Tadqiqot loyihasining asoschisi; ma'lumotlarni yig'ish, tahlil qilish yoki talqin qilishda; qo'lyozmani yozishda yoki natijalarni nashr etish to'g'risidagi qarorda.

Ma'lumotnomalar

1. Elmonem, MA; Veys, KR; Soliman, NA; van Deyk, M.; van den Heuvel, LP; Levtchenko, E. Sistinoz: ko'rib chiqish. Yetim J. Rare Dis. 2016, 11, 47. [CrossRef]

2. Jezegu, A.; Llinares, E.; Anne, C.; Kifer-Jaquinod, S.; O'Regan, S.; Aupetit, J.; Chablis, A.; Sagne, C.; Debacker, C.; ChadefauxVekemans, B.; va boshqalar. Geptahelik protein PQLC2 lizosomal kationik aminokislota eksportchisi bo'lib, sisteamin ta'siri ostida yotqiziladi.sistinozterapiya. Proc. Natl. akad. Sci. AQSh 2012, 109, E3434–E3443. [CrossRef] [PubMed]

3. Besouw, MT; Levtchenko, EN Nefropatik sistinozning prognozini yaxshilash. Int. J. Nefrol. Renova. Dis. 2014, 7, 297–302. [CrossRef]

4. Brodin-Sartorius, A.; Tete, MJ; Niaudet, P.; Antignac, C.; Mehmon, G.; Ottolenghi, C.; Charbit, M.; Moyse, D.; Legendre, C.; Lesavre, P.; va boshqalar. Sisteamin terapiyasi kech o'smirlar va kattalardagi nefropatik sistinozning rivojlanishini kechiktiradi. BuyrakInt. 2012, 81, 179–189. [CrossRef]

5. Cherqui, S. Sisteamin terapiyasi: shifo emas, sistinozni davolash. Buyrak Int. 2012, 81, 127–129. [CrossRef]

6. Devid, D.; Prinsiero Berlingerio, S.; Elmonem, MA; Oliveyra Arkolino, F.; Soliman, N.; van den Heuvel, B.; Gijsbers, R.; Levtchenko, E. Sistinozning molekulyar asoslari: geografik taqsimot, CTNS genidagi mutatsiyalarning funktsional oqibatlari va tuzatish potentsiali. Nefron 2019, 141, 133–146. [CrossRef] [PubMed]

7. Shimizu, Y.; Yanobu-Takanashi, R.; Nakano, K.; Xamase, K.; Shimizu, T.; Okamura, T. Ctns genining o'chirilishi LEA/Tohm kalamushlarida buyrak tubulyar disfunktsiyasi va sistin to'planishiga olib keladi. Onam. Genom 2019, 30, 23–33. [CrossRef]

8. Nevo, N.; Chol, M.; Bailleux, A.; Kalatzis, V.; Morisset, L.; Devuyst, O.; Gubler, MC; Antignac, C. ning buyrak fenotipisistinozSichqoncha modeli genetik fonga bog'liq. Nefrol. Tering. Transplantatsiya 2010, 25, 1059–1066. [CrossRef] [PubMed]

9. Elmonem, MA; Berlingerio, SP; van den Heuvel, LP; de Witte, Pensilvanya; Lou, M.; Levtchenko, EN GenetikaBuyrakKasalliklar: Zebrafish modellarining paydo bo'lgan roli. Hujayralar 2018, 7, 130. [CrossRef] [PubMed]

10. Elmonem, MA; Xalil, R.; Xodaparast, L.; Xodaparast, L.; Arkolino, FO; Morgan, J.; Pastore, A.; Tylzanowski, P.; Ny, A.; Lou, M.; va boshqalar. Sistinoz (ctns) zebrafishmutantlari pronefrikglomerulyar va quvurli disfunktsiyani ko'rsatadi. Sci. Rep. 2017,7, 42583. [CrossRef]

11. Lusko, MA; Najafian, B.; Alpers, CE; Fogo, ABAJKDA buyrak patologiyasi:Sistinoz. Am. J.KidneyDis. 2017,70,e23–e24. [CrossRef]

12. Park, MA; Pejovich, V.; Kerisit, KG; Junius, S.; Thoene, JG Sistinotik fibroblastlarda apoptozning kuchayishi vabuyrakproksimal tubula epitelial hujayralari protein kinaz C deltasining sisteinillanishidan kelib chiqadi. J. Am. Soc. Nefrol. 2006, 17, 3167–3175. [CrossRef]

13. Veys, KRP; Elmonem, MA; Dhaenens, F.; Van Deyk, M.; Yansen, M.; Kornelissen, EAM; Xohenfellner, K.; Reda, A.; Quatresoz, P.; van den Heuvel, B.; va boshqalar. Nefropatik sistinozda terining yaxshilangan ichki qarishi yuqori aniqlikdagi optik kogerent tomografiya bilan baholanadi. J. Invest. Dermatol. 2019, 139, 2242–2245. [CrossRef]

14. Besouw, MT; Kremer, JA; Janssen, MC; Levtchenko, EN Sisteamin bilan davolangan erkak sistinozli bemorlarda tug'ilish holati. Fertil. Steril. 2010, 93, 1880–1883. [CrossRef]

15. Veys, KR; D'Hauwers, KVt; van Dongen, A.; Janssen, MC; Besouw, MTP; Gossens, E.; van den Heuvel, LP; Vetzels, A.; Levtchenko, EN Erkak sistinozli bemor tomonidan qo'zg'atilgan birinchi muvaffaqiyatli kontseptsiya. JIMD Rep. 2018, 38, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

16. Rohayem, J.; Xaffner, D.; Cremers, JF; Hus, S.; Vistuba, J.; Vaytsel, D.; Kliech, S.; Hohenfellner, K. Infantil nefropatik sistinozli erkaklarda moyak funktsiyasi. Hum. Qayta ishlab chiqarish. 2021, 36, 1191–1204. [CrossRef] [PubMed]

17. Bleyk, X.; Proudfoot-Jons, J.; Noks, E.; Lipkin, G. Sistinozli ayollarda homiladorlik. Klin. Buyrak J. 2019, 12, 855–858. [CrossRef]

18. Dogulu, CF; Tsilou, E.; Rubin, B.; Fitzgibbon, EJ; Kaiser-Kupper, MI; Rennert, OM; Gahl, WA Sistinozda idiopatik intrakranial gipertenziya. J. Pediatr. 2004, 145, 673–678. [CrossRef] [PubMed]

19. Dikson, P.; Kristofer K.; Chauhan, A. Sistinozli bemorlarda sistin kristallanishida stromal kollagenning potentsial roli. Int. J. Pharm. 2018, 551, 232–240. [CrossRef]

20. Katz, B.; Melles, RB; Schneider, JA; Rao, NA Nefropatik sistinozda shox parda qalinligi. Br. J. Oftalmol. 1989, 73, 665–668. [CrossRef] [PubMed]

21. Nesterova, G.; Gahl, WA Sistinoz: davolash mumkin bo'lgan kasallikning evolyutsiyasi. Pediatr. Nefrol. 2013, 28, 51–59. [CrossRef] [PubMed]

22. Ariseta, G.; Giordano, V.; Santos, F. Bemorlarda uzoq muddatli sisteamin bilan davolashning ta'sirisistinoz. Pediatr. Nefrol. 2019, 34, 571–578. [CrossRef] [PubMed]

23. Gilbert, MJ; Zerulla, TC; Tierney, KB Zebrafish (Danio rerio) qarish va mashqlarni o'rganish uchun namuna sifatida: Jismoniy qobiliyat va mashq qilish qobiliyati yoshga qarab kamayadi. Exp. Gerontol. 2014, 50, 106–113. [CrossRef] [PubMed]

24. Gerxard, GS; Kauffman, EJ; Vang, X.; Styuart, R.; Mur, JL; Kasales, CJ; Demidenko, E.; Cheng, KC. Zebrafishning ikkita shtammida (Danio rerio) hayot davomiyligi va qarilik fenotiplari. Exp. Gerontol. 2002, 37, 1055–1068. [CrossRef]

25. Saftig, P.; Klumperman, J. Lizosoma biogenezi va lizosomal membrana oqsillari: savdosi funktsiyaga javob beradi. Nat. Ruhoniy Mol. Hujayra Biol. 2009, 10, 623–635. [CrossRef]

26. Cherki, S.; Sevin, C.; Hamard, G.; Kalatzis, V.; Sich, M.; Pequignot, MO; Gogat, K.; Abitbol, ​​M.; Broyer, M.; Gubler, MC; va boshqalar. Sistinozsiz sichqonlarda intralizosomal sistin to'planishi, sistinozda nuqsonli protein. Mol. Hujayra. Biol. 2002, 22, 7622–7632. [CrossRef]

27. Raggi, C.; Luciani, A.; Nevo, N.; Antignac, C.; Terrin, S.; Devuyst, O. Endolizosomal bo'linmaning dedifferentsiyasi va aberatsiyasi nefropatik sistinozning dastlabki bosqichini tavsiflaydi. Hum. Mol. Genet. 2014, 23, 2266–2278. [CrossRef]

28. Hard, GC. To'qson kunlik toksiklik tadqiqotlarida gialin tomchisi nefropatiyasini gistologik aniqlashga yordam beradi. Toksikol. Patol. 2008, 36, 1014–1017. [CrossRef]

29. Sakarjon, A.; Timmons, C.; Baum, M. Sistin yuklangan proksimal tubulalarda sistinning hujayra ichidagi taqsimlanishi. Pediatr. Res. 1994, 35, 447–450. [CrossRef]

30. Kroeger, PT, Jr.; Wingert, RA Buyrak rivojlanishi va regeneratsiyasi paytida podotsitlar genezini o'rganish uchun zebrafishdan foydalanish. Ibtido. 2014, 52, 771–792. [CrossRef]

31. Sumayao, R.; MakEvoy, B.; Newsholme, P.; McMorrow, T. Lizosomal sistin to'planishi mitoxondriyal depolarizatsiya va inson buyragi proksimal quvur hujayralarida redoksga sezgir genlarning indüksiyasiga yordam beradi. J. Fiziol. 2016, 594, 3353–3370. [CrossRef]

32. Chiaverini, C.; Sillard, L.; Flori, E.; Ito, S.; Briganti, S.; Vakamatsu, K.; Fontas, E.; Berard, E.; Cailliez, M.; Chat, P.; va boshqalar. Sistinosin melanin sintezini tartibga soluvchi melanosoma oqsilidir. FASEB J. 2012, 26, 3779–3789. [CrossRef]

33. Adelmann,CH;Traunbauer,AK;Chen,B.;Condon,KJ;Chan,SH;Kunchok,T.;Lyuis,CA;Sabatini,DMMFSD12sisteinni melanosoma va lizosomalarga olib kirishda vositachilik qiladi. Tabiat 2020, 588, 699–704. [CrossRef]

34. Leal, MC; Kardoso, ER; Nobrega, RH; Batlouni, SR; Bogerd, J.; Franka, LR; Schulz, RW. Spermatogonial avlodlarga e'tibor qaratgan holda zebrafish (Danio rerio) spermatogenezini gistologik va stereologik baholash. Biol. Qayta ishlab chiqarish. 2009, 81, 177–187. [CrossRef] [PubMed]

35. Sansanval, P.; Sarval, MM Nefropatikda anormal mitoxondriyal autofagiyasistinoz. Autofagiya 2010, 6, 971–973. [CrossRef] [PubMed]

36. Bellomo, F.; Signorile, A.; Tamma, G.; Raneri, M.; Emma, ​​F.; De Rasmo, D. Nefropatik sistinozda atipik mitoxondriyal siklik-AMP darajasining ta'siri. Hujayra. Mol. Hayot fanlari. 2018, 75, 3411–3422. [CrossRef] [PubMed]

37. De Rasmo, D.; Signorile, A.; De Leo, E.; Polishchuk, EV; Ferretti, A.; Raso, R.; Russo, S.; Polishchuk, R.; Emma, ​​F.; Bellomo, F. Nefropatik sistinozning proksimal tubulali epitelial hujayralarining mitoxondrial dinamikasi. Int. J.Mol. Sci. 2019, 21,192. [CrossRef]

38. Kalatzis, V.; Serratris, N.; Xippert, C.; Payet, O.; Arndt, C.; Cazevieille, C.; Moris, T.; Hamel, C.; Malecaze, F.; Antignac, C.; va boshqalar. Tsistinoz hayvon modelidagi ko'z anomaliyalari kasallikning patogenezini taqlid qiladi. Pediatr. Res. 2007, 62, 156–162. [CrossRef]

39. Romero-Ferrero, F.; Bergomi, MG; Hinz, RC; Heras, FJH; de Polavieja, GG idtracker.ai: Belgilanmagan hayvonlarning kichik yoki katta jamoalaridagi barcha shaxslarni kuzatish. Nat. Usullar 2019, 16, 179–182. [CrossRef]