Simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya o'pka saratonida immunitet bilan bog'liq biomarkerlarga ta'sir qiladi
Aug 10, 2023
Abstrakt: Mikrogravitatsiya - bu kelajakdagi saratonni davolash usullarini ishlab chiqish uchun qo'shimcha vosita bo'lib xizmat qilishi mumkin bo'lgan yangi strategiya. O'pka saratonida mikrogravitatsiyaning hujayra jarayonlariga va hujayralarning migratsiya qobiliyatiga ta'siri yaxshi yoritilgan. Biroq, uning o'pka saratoni rivojlanishini qo'zg'atuvchi mexanizmlarga ta'siri go'daklik davrida qolmoqda. Ushbu tadqiqotda 13 ta differentsial ifodalangan genlar simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya (SMG) ostida o'pka saratoni prognozi bilan bog'liqligi ko'rsatilgan. Gen to'plamini boyitish tahlilidan foydalanib, bu genlar gumoral immunitet yo'llarida boyitiladi. Buning o'rniga alveolyar bazal-epitelial (A549) hujayralar in vitro 2D klinostat tizimi orqali SMGga ta'sir ko'rsatdi. Morfologiyaning o'zgarishi va proliferatsiya tezligining pasayishiga qo'shimcha ravishda, SMG saraton rivojlanishining asosiy mexanizmi bo'lgan A549 ning epiteliyadan mezenximaga o'tish (EMT) fenotipini qaytardi. Bu epitelial E-kaderin ifodasining kuchayishi va mezenximal N-kaderin ifodasining kamayishi, shuning uchun kamroq metastatik holatni ko'rsatishi bilan isbotlangan. Qizig'i shundaki, biz FCGBP, BPIFB, F5, CST1 va CFB ning ortib borayotgan ifodasini va ularning SMG ostida EMT bilan korrelyatsiyasini kuzatdik, bu esa ularni potentsial o'simtani bostiruvchi biomarkerlarni ko'rsatdi. Ushbu topilmalar birgalikda o'pka saratonini davolash uchun yangi terapevtik strategiyalarni yaratish uchun yangi imkoniyatlarni ochib beradi.
Kalit so'zlar: simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya; EMT; o'pka saratoni; metastaz; o'simta bostiruvchi; biomarker
Cistanche o'tining ta'siri - Antitumor
1.Kirish
Kosmosda tanaga organ, to'qima va hujayra darajasida ta'sir qiluvchi tortishish vektori yo'qligi ma'lum. Mikrogravitatsiya, aniq vaznsizlik holati, inson salomatligiga sezilarli ta'sir ko'rsatishi ma'lum bo'lgan muhim kosmik stressdir, masalan, suyaklarning yo'qolishi, mushaklar atrofiyasi va yurakning dekonditatsiyasi [1,2]. Mikrogravitatsiyaning saraton hujayralariga ta'siri, shuningdek, kosmos va saraton tadqiqotlariga qiziqishning ortib borayotgan markazi bo'ldi. Mikrogravitatsiya immunitet hujayralarining faolligini bostirishi va ko'p tanali tizimlarni buzishi ko'rsatilgan, bu saraton rivojlanish xavfini oshirishi mumkin [2-4]. Ushbu aniq sog'liq muammolari tufayli mikrogravitatsiya muhiti tadqiqotchilarga mikrogravitatsiya ta'sir qiladigan biofizik mexanizmlarni o'rganishga imkon berdi va neyrodegenerativ kasalliklar, immunoterapiya va potentsial yaxshiroq va ko'proq maqsadli saratonga qarshi davolash usullarini topishga yordam berdi [4-6]. Ko'pgina tadqiqotlar mikrogravitatsiyaning ko'p sonli o'simta hujayralarida, shu jumladan o'pka saratonida hujayra rivojlanishi, proliferatsiyasi va apoptoziga ta'sirini yaxshi hujjatlashtirdi va ko'rib chiqdi [7-12]. Biroq, mikrogravitatsiya bilan bog'liq ko'plab boshqa tadqiqotlar saraton hujayralarining ko'payishi, metastazlari va omon qolishi bilan bog'liq bo'lgan gen ekspressiyasidagi o'zgarishlarni keltirib chiqarishi, hujayralarni kamroq tajovuzkor fenotipga o'tkazishi ko'rsatilgan [13,14]. Bu o'simta biologiyasi va diagnostikasi bo'yicha yangi tushunchalarni yoritishi mumkin, shuning uchun mikrogravitatsiya yangi tadqiqot yondashuvlarini ishlab chiqish va terapevtik strategiyalarni takomillashtirish umidida yangi maqsadlarni kashf qilish uchun innovatsion vosita sifatida ta'kidlanadi. O'pka saratoni, kichik hujayrali bo'lmagan o'pka saratoni (NSCLC) eng ko'zga ko'ringan turi bo'lib, o'limning asosiy sababi bo'lib, barcha saratonlarning 12% ni tashkil qiladi va eng ko'p tashxis qo'yilgan saraton hisoblanadi [15]. Kanserogen jarayonni yaxshiroq tushunishga yordam beradigan mikrogravitatsiyani o'z ichiga olgan tadqiqotlarda o'pka saratoni hujayralari mikrogravitatsiya ta'siridan so'ng o'z poyasini yo'qotib, saraton hujayralari o'sishi va faoliyatiga ta'sir qiladi [11]. Ahn va boshqalar tomonidan o'tkazilgan tadqiqot. o'pka saratoni hujayralarini (A549) mikrogravitatsiyaga ta'sir qilish tez migratsiya va proliferatsiyani keltirib chiqarishini ko'rsatdi. Bu mikrogravitatsiya ta'sirida matritsa metalloproteazlarining (MMP-2 va MMP-9) ko'tarilgan darajalari bilan izohlanadi, shuning uchun saraton invaziyasi va migratsiyasida hal qiluvchi rol o'ynaydi [10]. Boshqa bir tadqiqotda Chung va boshqalar. Simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya o'pka saratoni hujayralarining ko'payishiga sezilarli ta'sir ko'rsatmasligini, balki oddiy tortishish ostida nazorat guruhiga nisbatan migratsiyani oshirganligini aniqladi [16]. Aksincha, Chang va boshqalar. mikrogravitatsiya sharoitlariga 24 soat ta'sir qilgandan so'ng A549 o'pka saratoni hujayralari qatorida migratsiya kamayganini ko'rsatdi [17]. Mikrogravitatsiyaning apoptoz, migratsiya va invazivlikni o'z ichiga olgan hujayra xatti-harakatlariga sezilarli ta'siriga qaramay, uning o'pka saratoniga ta'siri hali to'liq aniqlanmagan. Ma'lumki, epiteliya hujayralari apoptozga chidamlilik, invazivlik va migratsiya qobiliyatini kuchaytiradigan mezenxima fenotipini o'rnatish uchun bir nechta biokimyoviy o'zgarishlarga uchraydi. Bunday biologik jarayon epiteliyadan mezenximaga o'tish (EMT) deb nomlanadi, bu saraton rivojlanishining o'ziga xos belgisidir [18]. EMT ning saraton rivojlanishiga aloqasi yaxshi muhokama qilingan. Ma'lumki, o'smalar transkripsiya omillarini ko'tarish, hujayra yuzasi oqsillarini ifodalash va ECMni buzuvchi fermentlarni ishlab chiqarish orqali EMT ni faollashtiradi. EMT faollashtirilgandan so'ng, o'simta hujayralari hujayra-hujayra yopishishini yo'qotadi va migratsiya va invaziv xususiyatlarga ega bo'ladi [19]. Faqat ikkita tadqiqot shuni ko'rsatdiki, simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya keratinotsitlarda vaqtinchalik epiteliyadan mezenximaga o'tishni (EMT) keltirib chiqaradi [9]. Bundan tashqari, bunday hodisalar MCF-7 hujayralari va HUVEC [20]da ta'kidlangan; biroq, o'pka saratonida mikrogravitatsiyaning EMTga ta'siriga hech qanday tadkikotlar yo'q. Mikrogravitatsiyaning saratonning o'simta va metastatik jarayonlarini modulyatsiya qilish qobiliyatiga oid ko'plab muhim kashfiyotlar bo'lishiga qaramay, mikrogravitatsiyaviy shahar tomonidan boshqariladigan aniq mexanizmlar nisbatan noma'lum bo'lib qolmoqda, shuning uchun molekulyar darajada sodir bo'ladigan moslashuvchan o'zgarishlarga oid ochiq savollar tug'iladi. Ushbu tadqiqotda biz simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya (SMG) ta'siri ostida A549 hujayralarida mRNK ifodasini sezilarli darajada oshirgan immun bilan bog'liq genlarning (FCGBP, BPIFB1, F5, CFB va CST1) imzosini aniqladik. Bundan tashqari, biz SMG ning A549 saraton rivojlanishidagi hissasini EMT regulyatsiyasi orqali baholadik. FCGBP, BPIFB1, F5, CFB va CST1 va ularning EMT kalit belgilariga bog'liqligi SMG ostida o'pka saratonining potentsial kamroq metastatik fenotipini ko'rsatdi. Ushbu tadqiqot natijalari bizning tushunchamizni rivojlantiradigan va o'pka saratonini davolash uchun yangi terapevtik strategiyalarni ishlab chiqishda yordam beradigan asosiy mexanizmlarni aniqlash uchun zarur bo'lgan kelajakdagi tadqiqotlar uchun asos bo'lib xizmat qiladi.
Cistanche tubulosa-Antitumorning foydalari
2. Natijalar
2.1. Simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya (SMG) ostida o'pka saratoni hujayralarida aniqlangan eng keng tarqalgan differentsial ifodalangan genlar yerning tortishish kuchi (GG) bilan solishtirganda
Simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya (SMG) ostida o'pka saratoni bilan bog'liq genlarni aniqlash uchun biz dastlab ommaviy mavjud Gene Expression Omnibus (GEO) ma'lumotlar bazasidan foydalanib, inson o'pka saratoni uchun er gravitatsiyasi (GG) bilan solishtirganda SMG ostida differentsial tarzda ifodalangan genlarni tekshirdik. Ikki xil ma'lumotlar to'plami, GSE78210 va GSE36931 tanlandi, ular 2D va 3D hujayra madaniyati sharoitida yetishtirilgan ikki xil inson o'pka saratoni hujayra liniyasi, A549 va Colo699 uchun gen ifodasini o'z ichiga oladi. SMG va GG namunalari o'rtasidagi genetik ekspresyon profilidagi farqlar vulqon uchastkalarida taqdim etilgan (1-rasm). Har bir ma'lumot to'plami uchun aniqlangan differentsial ekspresslangan genlar (DEG'lar; 2-rasm) o'pka saratonida yuqori tartibga solinadiganlarga bo'lingan (A549da 21 gen va GSE78210 ma'lumotlar to'plamining Colo699-da 29 gen va GSE36931 ma'lumotlar to'plamining A549-da 47 gen) va shularga bo'lingan. 1-jadvalda ko'rsatilganidek, o'pka saratoni (A549da 40 gen va GSE78210 ma'lumotlar to'plamida 27 ta Colo699 genlari va GSE36931 ma'lumotlar to'plamida 87 gen). SMG GG holati bilan solishtirganda. Eng keng tarqalgan genlar InteractiVienn veb-vositasi yordamida aniqlangan (2A-rasm). Nomzod genlarga AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP va BPIFA1 kiradi. Aniqlangan DEGlarning umumiy yo'llarga aloqadorligini aniqlash uchun nomzod genlari Metascape-ga yuklandi (http://metascape.org; 2021-yil 11-noyabrda kirish). Qizig'i shundaki, bu genlar gumoral immun javob va tartibga solinadigan ekzotsitozni o'z ichiga olgan yo'llar bilan boyitilgan (2B-rasm).
Shakl 1. GEO Omnibus yordamida differentsial ifodalangan genlarni (DEG) ko'rsatadigan vulqon syujeti. (A) (A) GSE78210 va (B) GSE36931 ma'lumotlar to'plamidan foydalangan holda A549 hujayralarida SMG va GG effektlari ostida DEGlarni ko'rsatadigan vulqon syujeti. (C) GSE78210 ma'lumotlar to'plamidan foydalangan holda Colo699 hujayra liniyasida SMG va GG effektlari ostida DEGlarni ko'rsatadigan vulqon syujeti. Qizil rang yuqori tartibga solinadigan genlarni, ko'k rang esa pastga regulyatsiya qilingan genlarni ko'rsatadi.
Jadval 1. A549 va Colo699 o'pka saratoni hujayralarida GG bilan solishtirganda SMGda differentsial tarzda ifodalangan umumiy genlar. Har bir maʼlumotlar toʻplami DEGlarning eng yuqori 5% ini olish uchun oʻzgartirilgan qatlam oʻzgarishlariga ega edi. GSE36931 uchun katlama o'zgarishi (FC) faqat FC 4 dan katta yoki unga teng yoki -4 dan kichik yoki teng bo'lgan genlarni o'z ichiga olishi uchun sozlandi. GSE78210 uchun FC faqat FC 3 dan katta yoki unga teng yoki -3 dan kichik yoki teng bo'lgan genlarni o'z ichiga olgan holda o'rnatildi.
Shakl 2. O'pka saratoni bo'yicha GSE78210 va GSE36931 ma'lumotlar to'plamlari o'rtasida keng tarqalgan o'n uchta DEG. (A) GG bilan solishtirganda SMG sharoitida GSE36931 (A549 hujayra liniyasi) da 134 DEGs, GSE78210 (A549 hujayra liniyasi) da 61 DEG va GSE78210 (Colo699 hujayra liniyasi) da 56 DEGni ko'rsatadigan Venn diagrammasi. Jami aniqlangan 251 gendan 13 DEG ikkita ma'lumotlar to'plami, GSE78210 va GSE36931, A549 hujayra liniyasi o'rtasida umumiy ekanligi aniqlandi. Venn diagrammasi InteractiVinn yordamida yaratilgan.
2.2. O'pka adenokarsinomasi bilan kasallangan bemorlarning klinik prognozi bilan bog'liq bo'lgan differentsial ekspress genlar
O'pka adenokarsinomasi bilan og'rigan bemorlarning klinik prognozi bilan bog'liq bo'lgan differentsial ifodalangan genlar O'pka adenokarsinomasi bilan og'rigan bemorlarda nomzod genlarning klinik prognostik qiymatini baholash uchun Kaplan-Meier plotter (http://www.kmplot.com/; 2-noyabr, 11-noyabrda kirish { {44}}21) nomzod genlarning yuqori/oʻrta va past ifodalangan oʻpka adenokarsinomasi (LUAD) bilan kasallanganlarning umumiy omon qolishini (OS) solishtirish uchun ishlatilgan (3-rasm). NOX1 ning yuqori mRNK ifoda darajalari (xavf darajasi (HR), 1,45; 95% ishonch oralig‘i (CI), 1,11–1,9; p=0.0058), GDA (HR) , 1,74; 95% CI, 1,33–2,26; p=3.2e-05), TCN1 (HR, 1,62; 95% CI, 1,26-2,08; p=0,00014), va BPIFA1 (HR, 1.44; 95% CI, 1.12-1.84; p=0.0026) yomon prognoz bilan sezilarli darajada bog'liqligi kuzatildi (3A-D-rasm). Boshqa tomondan, FCGBP ning yuqori mRNK ifoda darajalari (HR, 0.63; 95% CI, 0.46-0.85; p=0.0026) LUAD bemorlarida yaxshi prognoz va yuqori umumiy omon qolish bilan bog'liq edi (3E-rasm). mRNK o'rtasida sezilarli korrelyatsiya yo'q edi
Shakl 3. FCGBP, CST1, F5, CFB va BPIFB1 o'pka adenokarsinomasi bilan og'rigan bemorlarning klinik prognozi bilan bog'liq. Nomzod genlarning mRNK ifoda darajalarining Kaplan-Meyer omon qolish egri chiziqlari: (A)NOX1; (B) GDA; (C) TCN1; (D) PLUNC; (E) FCGBP; (F) AZGP1; (G) H2Bf; (H) B7X; (I) AGR3; (J) CEACAM6; (K) F5; (L) BPIFB1; va (M) o'pka adenokarsinomali bemorlarda CST1. HR: xavf nisbati.
cistanche qo'shimchasining foydalari - Antitumor
Cistanche mahsulotlarini ko'rish uchun shu yerni bosing
【Batafsil ma'lumot so'rang】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2.3. FCGBP, BPIFB1, F5, CFB va CST1 ning A549 hujayralarida simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiyadan keyingi ifodasi
In silico identifikatsiyalangan genlar (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP va BPIFA1) ifodasini tekshirish uchun qRT-PCR yordamida in vitro ilovasi amalga oshirildi. Qizig'i shundaki, qRT-PCR yordamida bizning ma'lumotlarimiz GG bilan solishtirganda SMGdan keyin A549 hujayralarida 48 va 72 soatlarda FCGBP mRNK ifodasining sezilarli darajada ko'tarilishini ko'rsatdi (4A-rasm). Bundan tashqari, CFB, F5 va BPIFB1 ning mRNK ifodalari SMG dan keyin 72 soat ichida va GG bilan solishtirganda A549 hujayralarida sezilarli darajada yuqori tartibga solingan (4B, C, E-rasm). GG bilan solishtirganda SMG sharoitida CTS1 uchun mRNK ifodasida sezilarli bo'lmasa-da, ozgina o'sish aniqlandi (4D-rasm). AZGP1, AGR3, GDA, VTCN1, BPIFA1, NOX1, CEACAM5 va TCN1 iboralari SMG va GG uchun ham aniqlanmagan (maʼlumotlar koʻrsatilmagan).
Shakl 4. In vitro sharoitida SMG sharoitida FCGBP, CST1, F5, CFB va BPIFB1 ning yuqori regulyatsiyasi. (A) FCGBP, (B) CFB, (C) F5, (D) CTS1 va (E) BPIFB1 ning mRNK ifoda darajalari, qRT-PCR bilan aniqlangan va 24 uchun GG va SMG sharoitlariga duchor bo'lgan A549 hujayralarida GAPDH darajasiga normallashtirilgan. , 48 va 72 soat. Shtrixli grafiklar 3 ta mustaqil tajriba natijalarini aks ettiradi (n=3). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 va **** p < 0,0001.
Umuman olganda, bu ma'lumotlar o'pka saratonida differentsial ifodalangan FCGBP, F5, CFB va BPIFB1 o'pka saratoni rivojlanishida muhim rol o'ynashi mumkinligini anglatadi.
2.4. Simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya hujayra hayotiyligini pasaytiradi va A549 o'pka saratoni hujayra chizig'ida epiteliyadan mezenximaga o'tishni qaytaradi.
SMG A549 hujayralarining ko'payish potentsialiga ta'sir qiladimi yoki yo'qligini tekshirish uchun tripan ko'k istisno tahlili yordamida hujayra hayotiyligi tahlili o'tkazildi. Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatdiki, SMG hujayra proliferatsiyasining vaqtga bog'liq pasayishiga sezilarli darajada sabab bo'lgan (5B-rasm). Hujayra proliferatsiyasining pasayishi asosan SMGdan keyin 48 va 72 soatdan keyin sezilarli bo'ldi, bu A549 hujayralarining hujayra proliferatsiyasining o'sishini ko'rsatdi. Bunga parallel ravishda, SMG ostida A549 hujayralarida hujayra morfologiyasining o'zgarishi aniqlandi. Ushbu o'zgarishlarni baholash uchun hujayralar SMG holatidan olib tashlandi, 24-quduq plitalariga ekildi va SMG qo'llanilishidan 1 soat keyin yorug'lik mikroskopi ostida kuzatildi. Qizig'i shundaki, SMG ta'siriga uchragan hujayralar SMGdan keyin donador, to'plangan morfologiyani aniqladi. (5A-rasm).
Shakl 5. Simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya hujayra hayotiyligini pasaytiradi va vaqtga bog'liq holda A549 hujayralarida morfologik o'zgarishlarni keltirib chiqaradi. (A) GG ostida 1 soat davomida ularni ekishdan oldin 24, 48 va 72 soat davomida SMGga duchor bo'lgan ota-ona A549 hujayralari (GG) va A549 hujayralarining vakil mikrograflari. Rasmlar 10X kattalashtirishda olingan. (B) A549 hujayralarining hujayra hayotiyligi tripan ko'k bo'yoqni chiqarib tashlash tahlili yordamida baholandi. 3 ta mustaqil tajribaning o'rtacha hujayra hayotiyligi foiz nazorati sifatida ko'rsatiladi. **** p < 0.0001. Shakl 5. Simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya hujayra hayotiyligini pasaytiradi va vaqtga bog'liq holda A549 hujayralarida morfologik o'zgarishlarni keltirib chiqaradi. (A) GG ostida 1 soat davomida ularni ekishdan oldin 24, 48 va 72 soat davomida SMGga duchor bo'lgan ota-ona A549 hujayralari (GG) va A549 hujayralarining vakil mikrograflari. Rasmlar 10X kattalashtirishda olingan. (B) A549 hujayralarining hujayra hayotiyligi tripan ko'k bo'yoqni chiqarib tashlash tahlili yordamida baholandi. 3 ta mustaqil tajribaning o'rtacha hujayra hayotiyligi foiz nazorati sifatida ko'rsatiladi. **** p <0,0001.
Xitoy o'ti cistanche o'simligi - Antitumor
A549 da hujayra proliferatsiyasining kamayishi haqida olingan ma'lumotlarni tushunish uchun biz SMG ning epiteliyadan mezenximaga o'tish (EMT) mexanizmiga qo'shgan hissasini baholadik. EMT saraton rivojlanishi va metastazni qo'zg'atuvchi muhim mexanizm va uning hujayra harakatchanligini va invaziv xususiyatlarini oshiradi [19]. Asosiy EMT markerlari (E-kaderin, N-kadherin, ZO-1 va salyangoz) va metalloproteinazalar MMP-2 va MMP-9 mRNK ifoda darajalari A549 da qRT-PCR orqali oʻlchandi. ham GG, ham SMG (6-rasm). SMG qo'llanilishidan so'ng, SMGdan 48 va 72 soat o'tgach, N-kaderin mRNK ifodasining sezilarli pasayishi bilan parallel ravishda E-kaderin mRNK ifodasida sezilarli o'sish kuzatildi (6A, B-rasm). SMGda ZO-1 va MMP-9da sezilarli boʻlmagan oʻsish va salyangoz transkripsiya faktorining pasayishi aniqlandi (6C–E-rasm). MMP{22}} A549 da SMGdan keyin 48 soatda sezilarli darajada kamaydi (6F-rasm), bu kamroq invaziv shakldan dalolat beradi. Birgalikda bu ma'lumotlar A549 da SMG tomonidan qo'zg'atilgan mezenximal-epitelial o'tish (MET) fenotipini qo'llab-quvvatlaydi.
6-rasm
2.5. Epiteliyadan mezenximaga o'tish yo'li FCGBP, BPIFB1, F5, CFB va CST1 ifodasi bilan bog'liq.
A549da aniqlangan genlarning potentsial roli va ularning SMG sharoitida EMT bilan mumkin bo'lgan korrelyatsiyasi haqida qo'shimcha mexanik tushunchaga ega bo'lish uchun EMT gen markerlariga qarshi GeneMANIA yordamida genlarning o'zaro ta'siri tahlili o'tkazildi. 7-rasmda mos ravishda EMT genlari E-kaderin (CDH1), N-kaderin (CDH2), TJP1, CTNNB1, SNAI1 (Salyangoz), ZO-1 va -katenin o'rtasida chizilgan genlarning o'zaro ta'siri ko'rsatilgan. Saraton invaziyasi va migratsiyasida ularning muhim rolini bilgan holda, MMP-2 va MMP-9 metalloproteinazalari ham tahlilga kiritildi. Tugunlar tugun qalinligidan kelib chiqqan holda turli xil kuchli genlar o'rtasidagi birgalikda ifodalanish naqshlarini aniqlaydi. Nomzod genlar bir-biri bilan birgalikda ifodalanish darajasini ko'rsatadi; BPIFB1 CFB va CST1 bilan birgalikda ifodalanadi; FCGBP F5, CST1 va CFB bilan birgalikda ifodalanadi; CST1 CFB bilan, F5 esa CFB, CST1 va BPIFB1 bilan birgalikda ifodalanadi. EMT genlari va nomzod genlar o'rtasida birgalikda ifodalash tugunlari ham aniqlangan; CDH1 FCGBP va F5 bilan birgalikda ifodalanadi; CDH2 F5, CST1, BPIFB1 va FCGBP bilan birgalikda ifodalanadi; CTNNB1 CST1 va FCGBP bilan birgalikda ifodalanadi; SNAI1 CST1, F5 va BPIFB1 bilan birgalikda ifodalanadi; TPJ1 CST1, FCGBP va F5 bilan birgalikda ifodalanadi; CTNNB1 CST1 va FCGBP bilan birgalikda ifodalanadi; MMP2 BPIFB1 va CST1 bilan birgalikda ifodalanadi; va MMP9 F5, CST1, FCGBP va CFB bilan birgalikda ifodalanadi. Ushbu topilmalar SMG sharoitida, ehtimol, EMT yo'llari bilan bog'liq bo'lgan yangi aniqlangan genlar va EMT markerlari o'rtasidagi muhim korrelyatsiyani ko'rsatadi.
Shakl 7. FCGBP, CST1, F5, CFB va BPIFB1 EMT yo'li bilan bog'liq. Tanlangan nomzod genlarning gen-gen o'zaro ta'siri tarmog'i; EMT genlari bilan FCGBP, CST1, F5, CFB va BPIFB1; CDH1, CDH2, TJP1, CTNNB1 va SNAI1, shuningdek, GeneMANIA (http://genemania.org/; 2021-yil 11-noyabrda kirish) tomonidan yaratilgan hujayra migratsiyasiga bog'liq genlar MMP2 va MMP9 nomzod genlar o'rtasidagi o'zaro ta'sirni aniqlash uchun. EMT va hujayra migratsiya belgilari. Tarmoq chetining turli ranglari qo'llaniladigan bioinformatika usullarini ko'rsatadi: veb-saytni bashorat qilish (to'q sariq), jismoniy o'zaro ta'sirlar (qizil), birgalikda ifodalash (binafsha rang), umumiy protein domenlari (jigarrang), yo'l (och ko'k), birgalikda lokalizatsiya (quyuq). ko'k) va genetik o'zaro ta'sirlar (yashil)
3. Munozara
Cistanche choyi
Muhokama Dunyo bo'ylab xavfli kasalliklardan biri bo'lgan o'pka saratoni so'nggi paytlarda "Kosmik tadqiqotlar"da katta e'tiborga sazovor bo'ldi. Biroq, bu sohadagi yutuqlarga qaramay, o'pka saratoni rivojlanishi va uning davolanishga javobi saraton kasalligining oldini olish yoki davolashda yordam beradigan aniq baholash strategiyalari yo'qligi sababli munozarali bo'lib qolmoqda [21]. Bizning ma'lumotimizga ko'ra, bu simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya (SMG) tomonidan qo'zg'atilgan mexanik muhitda o'pka saratoni rivojlanishining belgisi sifatida genlar to'plamini aniqlaydigan birinchi hisobot. Biz FCGBP, BPIFB, F5, CST1 va CFB immunitet bilan bog'liq genlarning ortib borayotgan ifodasini va ularning SMG ostida epiteliyadan mezenximaga o'tish (EMT) bilan bog'liqligini ta'kidlaymiz, bu ularni o'pka saratoni rivojlanishining potentsial biomarkerlari qiladi. Bu erda, shuningdek, mezenximadan epiteliyaga o'tish (MET) fenotipini qo'llab-quvvatlashda saraton rivojlanishining o'ziga xos belgisi bo'lgan EMT regulyatsiyasiga SMG ta'sirini ham ta'kidlaymiz. Umuman olganda, ushbu tadqiqot aniqlangan genlarni EMT bilan bog'lash uchun asos yaratadi; ammo o'pka saratoni uchun yangi maqsadli terapiyani ishlab chiqishda yordam beradigan aniq mexanizmlarni ochish uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab etiladi. Ushbu tadqiqotda biz simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya (SMG) ostida o'pka saratonida sezilarli darajada ifodalanadigan o'n uchta genni (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP va BPIFA1) ko'rsatdik. kremniydagi erning tortishish kuchi bilan solishtirganda. Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatdiki, bu differentsial tarzda ifodalangan genlar asosan gumoral immunitet va tartibga solinadigan ekzotsitoz bilan bog'liq yo'llar bilan boyitilgan. Bizning topilmalarimiz bilan parallel ravishda qiziqish, FCGBP ning asosiy funktsiyasi hali ham aniq emas [23]. Bu qisman turli o'smalarda ko'rsatadigan qarama-qarshi rollarga bog'liq bo'lishi mumkin [25]. Masalan, FCGBP bosh va bo'yin saratoni, yo'g'on ichak saratoni va osteosarkoma bilan og'rigan bemorlarning umumiy prognozi va o'ziga xos omon qolish bilan sezilarli darajada bog'liqligi ko'rsatilgan [25-27], tuxumdonlar va prostata saratonida esa yuqori ifodalangan. FCGBP kambag'al umumiy omon qolish bilan bog'liq edi [28]. Shunisi e'tiborga loyiqki, FCGBP rolining roli immunitetni himoya qilish mexanizmlari, yallig'lanishga qarshi javoblar, shuningdek hujayralarni himoya qilish bilan bog'liq [29,30], shuning uchun uni muhim prognostik markerga aylantiradi [31]. In vitro ilovalaridan foydalanib, biz 2D klinostat orqali o'pka saratoni va SMG sharoitida aniqlangan genlarning ifodasini baholadik. Ishlab chiqilgan klinostat turlari va boshqa mikrogravitatsiya platformalarining keng tanlovi mavjud. Bularga 1/2/3 D klinostat tizimlari, slaydli flakonlar bilan jihozlangan tasodifiy joylashishni aniqlash mashinalari (asosan qalqonsimon bez saratoni hujayralari uchun) va NASA tomonidan ishlab chiqilgan aylanuvchi devor tomirlari kiradi. Ularning har biri ma'lum bir tadqiqot maqsadiga xizmat qilish uchun mo'ljallangan, bu erda ba'zilari yopishgan yoki suspenziya hujayralarini etishtirish uchun mo'ljallangan, boshqalari esa kinetik javoblarni onlayn o'lchash uchun ishlatiladi. Shunisi e'tiborga loyiqki, klinostat turli xil eksperimental ilovalar tomonidan qo'llaniladigan eng sodda va moslashuvchan platformalardan biridir. Aslida, 2D klinostat sozlangan doimiy tezlikda va Yerning tortishish vektori yo'nalishiga perpendikulyar yo'nalishda doimiy ravishda aylanadigan aylanish o'qi bilan tavsiflanadi, shuning uchun real mikrogravitatsiyani taqlid qiluvchi markazdan qochma kuchlarni yaratadi [14,32,33] ]. Qizig'i shundaki, o'n uchta gendan FCGBP, BPIFB, F5, CST1 va CFB ifodalari A549 hujayralarida 2D klinostat tomonidan qo'zg'atilgan SMGga javoban sezilarli darajada oshdi. FCGBP va BPIFB ifodalari eng ko'p ta'sirlangan bo'lib, barcha baholangan vaqt nuqtalarida sezilarli o'sishni ko'rsatdi: SMGdan keyin 24, 48 va 72 soat. FCGBPga o'xshab, BPIFB1 tug'ma immunitet reaktsiyalariga hissa qo'shishi ma'lum [34]. Asosan havo yo'llari epiteliyasi tomonidan ishlab chiqariladigan B oila a'zosi 1 oqsilini (BPIFB1) o'z ichiga olgan BPI katlami bakteritsid va yallig'lanishga qarshi ta'sirlar bilan birga xostni himoya qilish mexanizmlarida ishtirok etishini isbotladi [35]. Nafas olish kasalliklarida BPIFB1 o'simtaga qarshi va anti-metastatik ta'sir ko'rsatadi; ammo aniq mexanizmlar noaniq bo'lib qolmoqda, bu esa qo'shimcha tekshirishni talab qiladi [34,36]. Vey va boshqalar tomonidan bir tadqiqot. BPIFB1 nazofarengeal karsinomaning migratsiyasini va invaziyasini inhibe qilishini aniqladi [37]. Shuni hisobga olib, BPIFB1da yuzaga keladigan mutatsiyalar o'pka saratoni xavfini oshirishi va uning regulyatsiyasi o'pka saratoni bilan og'rigan bemorlarda yomon prognozga olib kelishi aniqlandi [38,39]. FCGBP va BPIFB roliga qo'shimcha ravishda, komplement omil B (CFB) va kimerik o'simta bostiruvchi 1 (CST1) saraton kasalligida himoya rolini o'ynashi ko'rsatilgan. Masalan, CFB ning yuqori ifodasi o'pka saratoni bilan og'rigan bemorlarda umumiy va kasalliksiz omon qolish bilan bog'liqligi xabar qilingan [40]. Bundan tashqari, komplement tizimi patogenlarga qarshi birinchi himoya chizig'i bo'lib, tug'ma va orttirilgan immunitet tizimining asosiy komponenti bo'lib xizmat qiladi [41]. CST1 ga kelsak, turli tadqiqotlar uning qiziqarli xususiyatlarini ta'kidladi, masalan, hujayra o'sishini bostirish, apoptozni qo'zg'atish va p53 ning onkogen shakllari tomonidan inaktivatsiyaga chidamliligi, bu uni yovvoyi turdagi p{ ning jozibali, ammo muqobil terapevtik maqsadiga aylantirdi. {74}}rezistent odam o'smalari [42]. FCGBP, BPIFB1, F5, CFB va CST1 ning ko'payishiga qo'shimcha ravishda, bizning ma'lumotlarimiz SMG ostida A549 hujayralarining hujayra bilan bog'liq ikkita fenotipini qiziqarli tarzda ko'rsatdi - morfologiyaning agregatlar va to'p shaklidagi hujayralarga o'zgarishi va proliferatsiyaning sezilarli darajada pasayishi. SMG dan keyingi baho. Bu SMG ta'siriga uchragan hujayralar kichik bo'laklar yoki ko'p qatlamli hujayra agregatlarini ko'rsatadigan ba'zi boshqa tadqiqotlar bilan parallel ravishda [43,44]. Ushbu morfologik farqlar hujayra jarayonlaridagi birgalikdagi dramatik funktsional o'zgarishlar bilan aks ettiriladi, ularning bir qismi EMT. EMT metastatik jarayonning o'ziga xos belgisi bo'lib, immun kuzatuvidan qochish va tomirlarning invaziyasi bilan bog'liq bo'lib, shuning uchun hujayralarning ikkilamchi organlarga tarqalishiga imkon beradi [19,22]. Asosan, malign epiteliya hujayralari o'simta rivojlanishining birlamchi bosqichlarida EMT mexanizmidan o'tadi, bu hujayralar mezenxima xususiyatlarini ifodalashga moyil bo'lib, ularning asosiy joydan qochishini osonlashtiradigan kuchaygan harakatchanlikni namoyon qiladi, metastatik hujayralar esa ikkilamchi yon tomonda paydo bo'ladi. tegishli birlamchi o'smalari bilan solishtirganda kamroq dedifferentsiatsiyalangan xususiyatlar. Bu erda MET (mezenximaldan epiteliyaga) jarayoni metastatik o'sma shakllanishining bunday progressiyaning bir qismidir. Biroq, bu saraton rivojlanishining turli bosqichlarida EMTlarning ishtirokini e'tiborsiz qoldirmaydi, chunki ikkilamchi joylarda saraton hujayralari o'sishda va ko'payishda davom etadi yoki uyqu holatini boshdan kechiradi [45,46]. Bunday bir nechta genlarni muvofiqlashtirish va saraton hujayralarining metastatik rivojlanishini tartibga soluvchi o'ziga xos migratsiya belgilarining paydo bo'lishi SMG ta'sirida turli xil natijalarga olib kelishi mumkin [47]. Masalan, mikrogravitatsiya sharoitida turli xil ko'krak saratoni hujayralari mikrogravitatsiya ta'sirida turli morfologiyalar, hujayra yopishqoqligi va migratsiya xususiyatlarini namoyish etdi [5]. Shunisi e'tiborga loyiqki, EMT ning asosiy xarakteristikasi - bu hujayraning yopishqoqligi molekulasi - E-kaderinning yo'qolishi, bu hujayralar yaxlitligining tinchligiga ta'sir qiladi. Boshqa tomondan, nerv kaderin, N-kaderinning ko'payishi hujayra yopishishini o'zgartirishga olib keladi. Bu asosan Salyangoz, Twist va Zeb oqsillari kabi pleiotropik ifodalangan transkripsiya omillarini va metastatik yo'llarda amalga oshirilgan boshqa signalizatsiya yo'llarini faollashtiradigan transformatsiya qiluvchi o'sish omili (TGF-) tomonidan qo'zg'atiladi [18,48,49]. Bu erda biz epiteliya belgisi E-kaderin (CDH1) kuchayishi va mezenximal N-kaderin (CDH2) mRNK darajasining pasayishi, EMT ning asosiy belgilari [49] haqida xabar beramiz. Bu shuni anglatadiki, A549 ning proliferatsiya tezligining pasayishi haqidagi ma'lumotlarimiz bilan birgalikda hujayralar kamroq metastatik holatni namoyish etadi. Qizig'i shundaki, asosiy EMT belgilarining o'zgargan ifodasi odatda epiteliya qatlamini atrofdagi mezenximadan ajratib turadigan bazal membrananing asosiy komponenti bo'lgan MMP{105}} matritsa metalloproteinazasining sezilarli darajada pasayishi bilan birga bo'lgan. bazal membrananing yo'qolishi [50]. Bu Chang va boshqalar tomonidan olib borilgan tadqiqotga parallel ravishda, ular MMP2 ifodasini o'zgartirish orqali inson o'pka adenokarsinoma hujayralarining metastatik potentsialini kamaytirish bo'yicha o'zlarining topilmalari haqida xabar berishdi [17]. Umuman olganda, MMP ning roli malign o'smalarning rivojlanishida, shu jumladan metastazda yaxshi ta'sir ko'rsatadi, bu erda MMP (MMP-2 va MMP-9) ifodasi va fermentativ faolligi kamaygan metastatik fenotipning o'ziga xos xususiyati hisoblanadi. 50–52]. EMT ning metastazda muhim roliga ega bo'lgan holda, bizning ma'lumotlarimiz FCGBP, BPIFB, F5, CST1 va CFB ning EMT gen markerlari, shuningdek, hujayra migratsiyasi bilan bog'liq MMP2 va MMP9 genlari bilan muhim korrelyatsiyasini ta'kidlaydi. Qizig'i shundaki, Xiong va boshqalar. FCGBP o't pufagidagi EMTning asosiy regulyatori ekanligini ko'rsatdi [53]. Bu aniqlangan genlar kelajakdagi tadqiqotlar uchun potentsial biomarkerlar bo'lib xizmat qilishi mumkinligini anglatadi, ular o'pka saratoni rivojlanishini bashorat qilish va yanada tushunish mumkin. Birgalikda, bizning topilmalarimiz aniqlangan genlarni EMTning asosiy regulyatorlari sifatida tasniflaydi, bu o'pka saratoni hujayralarining mezenximadan epitelialga o'tish (MET) orqali kamroq metastatik fenotipning potentsial kuchayishiga yordam beradi.
4. Materiallar va usullar
4.1. Simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiyaga duchor bo'lgan o'pka saratoni hujayralarida umumiy differentsial ifodalangan genlarni (DEG) aniqlash uchun ma'lumotlar to'plami
Umumiy tahlil qilish uchun Gene Expression Omnibus (GEO) ma'lumotlar bazasidan tegishli ma'lumotlar to'plamlari olingan. Ushbu ma'lumotlar bazasi yuqori o'tkazuvchanlik genlarini ifodalash ma'lumotlari va mikroarraylarning umumiy foydalanish mumkin bo'lgan funktsional genomik tahlili sifatida ishlatiladi. Tanlangan maʼlumotlar toʻplami quyidagi mezonlarga javob berdi: faqat inson oʻpka saratoni hujayralari liniyalaridan foydalangan holda maʼlumotlar toʻplamlari, yerdagi tortishish (GG) sharoitlariga mos keladigan nazoratni oʻz ichiga olgan tadqiqotlar, oʻpka saratoni hujayra liniyalari tasnifi aniqlangan maʼlumotlar toʻplami va inson oʻpka saratoni hujayrasi genini ifodalovchi maʼlumotlar toʻplami mikroarray yordamida. Ushbu mezonga ikkita ma'lumotlar to'plami mos keladi, GSE78210 va GSE36931. Tadqiqotlarga jami 25 ta namunalar kiritildi va 2-jadvalda (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) ko'rsatilganidek, simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiyada (SMG) 14 ta o'pka saratoni hujayra liniyasi namunalari 11 GG nazorati bilan taqqoslandi. /geo/; 2021-yil 11-noyabrda foydalanilgan).
2-jadval. Simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya (SMG) va yerning tortishish kuchi (GG) o'pka saratoni hujayralari o'rtasidagi DEGni dastlabki identifikatsiyalash uchun ishlatiladigan Gen ifodasi Omnibusidan (GEO) olingan ma'lumotlar to'plamining tafsilotlari.
4.2. Har bir ma'lumotlar bazasida DEG yaratish uchun GEO2R gen to'plamini boyitish tahlili
GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r; 11-noyabr, 2021-noyabrda ochilgan), GEO seriyalarini solishtirish uchun foydalaniladigan interaktiv onlayn vosita, har bir maʼlumot toʻplamida guruhlash uchun ishlatilgan. va GG sharoitlari bilan solishtirganda SMG sharoitida yuqori va pastga regulyatsiya qilingan genlarni aniqlang. P-qiymatlari 0,05 dan kam bo'lgan genlar va 2 dan katta qatlam o'zgarishi SMG sharoitida differentsial ifodalangan DEG genlari sifatida tanlangan. Shunday qilib, har bir ma'lumotlar to'plamining DEGlari bir-biri bilan kesishgan va umumiy genlar aniqlangan.
4.3. Aniqlangan genlarning klinikopatologik ishtirokini miqdoriy aniqlash
Keyinchalik, olingan qisqa ro'yxatga kiritilgan genlar Kaplan-Meier Plotter (http://www.kmplot.com/; 2021-yil 11-noyabrda kirish) yordamida tasdiqlangan, tanlangan genlarning bemorning klinik natijalariga ta'sirini baholovchi onlayn ommaviy ma'lumotlar bazasi. Umumiy omon qolish (OS) tashxis qo'yilgan vaqtdan (oylarda) o'limgacha bo'lgan vaqt sifatida belgilangan. Gen ifodasi ma'lumotlari va omon qolish haqidagi ma'lumotlar Gen Ekspresi Omnibus (GEO), Saraton Genomi Atlasi (TCGA) va Evropa Genom-fenom Atlasidan (EGA) olingan. Bemorlar ikki guruhga bo'lingan: (1) yuqori ifoda (TPM qiymatlari yuqori kvartildan yuqori) va (2) past/o'rta ifoda (TPM qiymatlari yuqori kvartildan pastda). Kaplan-Meier uchastkalari o'pka adenokarsinomasi (LUAD) bilan kasallangan bemorlarning yuqori/o'rta va nomzod genlarning past ekspressiyasini solishtirish uchun ishlatilgan.
4.4. Aniqlangan genlar uchun boyitilgan ontologiya klasteri
Aniqlangan genlar umumiy yo'llarni bo'lishish yoki yo'qligini o'rganish uchun aniqlangan genlar uchun Gen Ontologiyasi (GO) yo'lini boyitish tahlili genlar ro'yxatini keng qamrovli izohlash uchun Metascape veb vositasi (https://metascape.org/; 2021 yil 11-noyabrda kirish) yordamida amalga oshirildi. va GEO2R bilan birga tahlil resursi
4.5. Hujayra chizig'i va hujayra madaniyati
O'pka adenokarsinomasi uchun namuna sifatida keng qo'llaniladigan inson adenokarsinomasi alveolyar bazal epitelial (A549) hujayra liniyasi Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI)-1640 muhitida 10% homila sigir zardobi bilan to'ldirilgan holda o'stirildi. (FBS; Sigma, Sent-Luis, MO, AQSh) va 100 birlik/ml penitsillin/streptomitsin (P/S; Sigma, Sent-Luis, MO, AQSh). Hujayra liniyasi 37 ◦C namlangan inkubatorda 5% CO2 atmosferasida o'stirildi. Hujayralar qo'shilish joyiga yetganda, ular 0,5% tripsin yordamida yig'ib olindi, 100 × g da 5 daqiqa davomida santrifüj qilindi va kerak bo'lganda foydalanildi.
4.6. Mikrogravitatsiya
O'pka saratoni hujayralari (A549) nolga yaqin tortishish muhitini (mikrogravitatsiya) taqlid qiluvchi 2D klinostat tizimida ekilgan. Bu Rotary Culture Max (RCMW™; Synthecon® Inc—Xyuston, TX, AQSH) bioreaktor boʻlib, mikrogʻovak perfuzion yadro va in-line oksigenator tizimini oʻz ichiga olgan hujayra madaniyati idishi bilan jihozlangan boʻlib, oziq moddalar va muhitning tashqi gazlanishini taʼminlaydi. shuning uchun to'g'ri gaz almashinuvi va past kesishgan hujayra madaniyati muhitini ta'minlaydi. Kamera hujayralarni o'z ichiga olgan madaniy muhit bilan to'ldirilgan. Bu kamera gorizontal ravishda tortishish kuchiga perpendikulyar bo'lgan bir o'q atrofida 10 rpm tezlikda aylantirildi. 2D klinostat 5% CO2 atmosferasida 37 ◦C namlangan inkubator ichiga joylashtirildi. A549 hujayralari 24, 48 va 72 soatlarda simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiyadan (SMG) yig'ib olindi. Taqqoslash mumkin bo'lgan o'pka saratoni muhitini yaratish uchun A549 xujayralari GG da madaniyat plitalarida, aylantirilmagan yoki statik holatda o'stirildi va namlangan inkubator (37 ◦C) ichidagi qurilma yaqinida saqlangan. Ushbu hujayralar nazorat guruhi deb ataladi va ular 24, 48 va 72 soatlarda ham yig'ib olingan.
4.7. Hujayra hayotiyligini tahlil qilish
GG sharoitlari uchun A549 hujayralar 24-quduq hujayra madaniyati plitalariga 3.0 × 10 500 mL uchun 4 ta zichlikda ekilgan. Hujayralar ekishdan keyin 24, 48 va 72 soatlarda tripsinizatsiya yo'li bilan yig'ib olindi, so'ngra 200 × g da 5 daqiqa davomida santrifüj qilindi. Olingan hujayra pelletlari madaniyat muhitida qayta tiklandi. SMG sharoitlari uchun A549 xujayralari 2D klinostat aylanish tizimiga 1 ml uchun 6,0 × 104 hujayra zichligida ekilgan. Hujayralar SMG ta'siridan keyin 24, 48 va 72 soatlarda yig'ib olindi, so'ngra 200 × g da 5 daqiqa davomida santrifüj qilindi. Olingan hujayra pelletlari madaniyat muhitida qayta tiklandi. Tripan ko'k (Sigma, AQSh) bo'yoqni chiqarib tashlash tahlili o'tkazildi. Hujayralar soni CellDrop™ avtomatlashtirilgan hujayra hisoblagichi yordamida aniqlandi.
4.8. Haqiqiy vaqtda polimeraza zanjiri reaktsiyasi (qRT-PCR)
Silikonda aniqlangan genlarning (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP va BPIFA1) gen ifoda darajalari (mRNK darajalari) va EMT gen markerlari (3-jadval) qRT-PCR yordamida A549 hujayralarida ham aniqlangan. Qisqacha aytganda, hujayralardan jami RNKni olish RNEasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germaniya) yordamida GGda 24, 48 va 72 soatlarda va SMG ta'siridan keyin ishlab chiqaruvchining protokollariga rioya qilgan holda amalga oshirildi. Bir mkg jami RNK iScript™ cDNK sintezi to'plami (Thermo, Waltham, MA, AQSh) yordamida 20 mkL reaksiya hajmida bitta zanjirli komplementar DNKga (cDNK) teskari transkripsiya qilindi. qRT-PCR PowerUp™ Sybr™ Green master mix (Thermo, AQSH) yordamida Quant Studio 5 pcr mashinasida (Thermo, AQSH) amalga oshirildi. PCRni kuchaytirish bosqichlari quyidagicha edi: 3 daqiqa davomida 95 ◦C da boshlang'ich denatürasyon bosqichi, 30 s davomida maqsadli genning tavlanish harorati va keyin 30 s davomida 72 ◦C. Har bir gen uchun floresans chegarasi sikli qiymati olingan. ∆∆Glitseraldegid 3-fosfatdehidrogenaza (GAPDH) ga normalizatsiya qilingandan so'ng gen ekspresyonidagi nisbiy qatlam o'zgarishini hisoblash uchun Cq usuli ishlatilgan.
Jadval 3. Inson primerlari ro'yxati. NOX1, NADPH oksidaz 1; GDA, guanin deaminaza; TCN1, Transkobalamin 1; FCGBP, Fc Gamma bog'lovchi oqsil; BPIFA1, BPI Fold O'z ichiga olgan oila A a'zosi 1; AZGP1, Alfa-2-Glikoprotein 1; CFB, to'ldiruvchi omil B; VTCN1, T-hujayra faollashtirish inhibitori 1ni o'z ichiga olgan V-Set domen; AGR3, Anterior Gradient 3; CTS1, kimerik o'simtani bostiruvchi 1; F5, koagulyatsion omil V; CEACAM6, CEA hujayra yopishish molekulasi 6; BPIFB1, BPI buklamani o'z ichiga olgan B oilasi a'zosi 1; ZO-1, Zonula okklyuziv oqsil 1; MMP-9, matritsa metalloproteinaza 9; MMP-2, matritsa metalloproteinaza 2; va GAPDH, glitseraldegid 3-fosfatdehidrogenaza
4.9. Gen-gen o'zaro ta'sirini tahlil qilish
In vitro qRT-PCR ma'lumotlari gen-gen o'zaro ta'sirini tahlil qilishda gen-gen o'zaro ta'sirini tahlil qilishda GenMANIA silico veb-vositasi (http://genemania.org/; 2021-yil 11-noyabrda kirish) yordamida amalga oshirildi, keng ko'lamli gen funktsiyalarini bashorat qilish uchun tarmoq algoritmi. funktsional assotsiatsiya ma'lumotlari. Bu tanlangan nomzod genlar o'rtasidagi o'zaro ta'sirlarni yanada baholash uchun o'tkazildi; EMT genlari bilan FCGBP, CST1, F5, CFB va BPIFB1; CDH1, CDH2, TJP1, CTNNB1 va SNAI1, shuningdek, hujayra migratsiyasi bilan bog'liq genlar, MMP2 va MMP9.
4.10. Statistik tahlil
Statistik tahlilni amalga oshirish uchun GraphPad Prism dasturidan foydalanilgan. Natijalar individual ma'lumotlar yoki o'rtacha ± standart og'ish (SD) sifatida ifodalanadi. Turli guruhlarni solishtirish uchun talabalarning t-testidan foydalanildi. Guruhlar orasidagi farqlar bir tomonlama ANOVA dispersiya (ANOVA) bilan baholandi. p-qiymatlari aniqlandi va p < 0 qiymatlari.05, p < 0.01, p < 0.001 (mos ravishda *, ** va ***) ahamiyatli deb hisoblanadi. Barcha tajribalar uch nusxada amalga oshirildi (n=3).
Ma'lumotnomalar
1. Oq, RJ; Averner, MJN Kosmosdagi odamlar. Tabiat 2001, 409, 1115–6828. [CrossRef]
2. Bredberi, P.; Vu, X.; Choy, JU; Rowan, AE; Chjan, X.; Poul, K.; Lauko, J.; Chou, J. Mikrogravitatsiyaning hujayra darajasida ta'sirini modellashtirish: inson kasalliklariga ta'siri. Old. Hujayra Dev. Biol. 2020, 8, 96. [CrossRef] [PubMed]
3. Yuan, M.; Liu, X.; Chjou, S.; Chjou, X.; Huang, Y.-E.; Xou, F.; Jiang, W. Tartibga solish modulining integral tahlili mikrogravitatsiyaning ko'p tanali tizimlarning disfunktsiyalari va shish paydo bo'lishi bilan bog'liqligini ochib beradi. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7585. [CrossRef] [PubMed]
4. Crucian, BE; Chouker, A.; Simpson, RJ; Mehta, S.; Marshall, G.; Smit, SM; Zvart, SR; Heer, M.; Ponomarev, S.; Uitmir, A.; va boshqalar. Kosmik parvoz paytida immunitet tizimining buzilishi: chuqur kosmik tadqiqotlar missiyalari uchun potentsial qarshi choralar. Old. Immunol. 2018, 9, 1437. [CrossRef] [PubMed]
5. Nassef, MZ; Melnik, D.; Kopp, S.; Sahana, J.; Infanger, M.; Lyutzenberg, R.; Relja, B.; Vehland, M.; Grimm, D.; Krüger, M. Mikrogravitatsiyadagi ko'krak saratoni hujayralari: saraton tadqiqotlari uchun yangi jihatlar. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7345. [CrossRef]
6. Takamatsu, Y.; Koike, V.; Takenuchi, T.; Sugama, S.; Vey, J.; Varagay, M.; Sekiyama, K.; Hashimoto, M. Yerda va kosmosda neyrodegenerativ kasalliklardan himoya qilish. NPJ Microgravity 2016, 2, 16013. [CrossRef]
7. Nassef, MZ; Kopp, S.; Vehland, M.; Melnik, D.; Sahana, J.; Krüger, M.; Corydon, TJ; Oltmann, H.; Shmitz, B.; Schütte, A. Haqiqiy mikrogravitatsiya insonning ko'krak saratoni hujayralarida sitoskeleton va fokal adezyonlarga ta'sir qiladi. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3156. [CrossRef]
8. Dits, C.; Infanger, M.; Romsvinkel, A.; Strub, F.; Kraus, A. Apoptoz induktsiyasi va simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya ostida inson o'pka saratoni hujayralarida hujayra yopishishini o'zgartirish. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3601. [CrossRef]
9. Ricci, G.; Kucina, A.; Proietti, S.; Dinikola, S.; Ferranti, F.; Cammarota, M.; Filippin, A.; Bizzarri, M.; Catizone, A. Microgravity E-kaderinning erta pastga regulyatsiyasi va hujayra yopishishini qayta qurish orqali inson keratinotsitlarida vaqtinchalik EMT ni keltirib chiqaradi. J. Ilova. Sci. 2020, 11, 110. [CrossRef]
10. Ahn, CB; Li, J.-H.; Xan, DG; Kang, H.-V.; Li, S.-H.; Li, J.-I.; O'g'il, KH; Li, JW Suzuvchi muhit bilan simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya kichik hujayrali bo'lmagan o'pka saratoni migratsiyasiga yordam beradi. Sci. Rep. 2019, 9, 14553. [CrossRef] [PubMed]
11. Pisanu, ME; Noto, A.; De Vitis, C.; Masiello, MG; Coluccia, P.; Proietti, S.; Giovagnoli, MR; Ricci, A.; Giarnieri, E.; Cucina, A. O'pka saratoni ildiz xujayrasi mikrogravitatsiya ta'siridan keyin o'zining asosiy holatini yo'qotadi. BioMed Res. Int. 2014, 2014, 470253. [CrossRef] [PubMed]
12. Infanger, M.; Kossmehl, P.; Shakibai, M.; Bauer, J.; Kossmehl-Zorn, S.; Kogoli, A.; Kursio, F.; Oksche, A.; Vehland, M.; Kreutz, RJC; va boshqalar. Simulyatsiya qilingan vaznsizlik papiller tiroid karsinoma hujayralarida sitoskeleton va hujayradan tashqari matritsa oqsillarini o'zgartiradi. Hujayra to'qimalari Res. 2006, 324, 267–277. [CrossRef] [PubMed]
13. Chen, J.; Mikrogravitatsiya, L. Mikrogravitatsiyadagi o'simta hujayralari. Kosmosda: odamlarning mikrogravitatsiyada qanday moslashishi va yashashi haqidagi sayohat; IntechOpen: London, Buyuk Britaniya, 2018; 139-jild, 259–268-betlar.
14. Grimm, D.; Shuls, X.; Krüger, M.; Kortes-Sanches, JL; Egli, M.; Kraus, A.; Sahana, J.; Corydon, TJ; Hemmersbach, R.; Wise, PM Mikrogravitatsiya bilan saratonga qarshi kurash: Ko'p hujayrali sferoid metastaz modeli sifatida. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 3073. [CrossRef]
15. Shabat, MB; Kot, ML Saraton rivojlanishi va ustuvorliklari: o'pka saratoni. Saraton epidemiyasi. Biomark. Oldingi. 2019, 28, 1563–1579. [CrossRef] [PubMed]
16. Chung, JH; Ahn, CB; O'g'il, KH; Yi, E.; O'g'li, HS; Kim, H.-S.; Li, SH. Kichik bo'lmagan hujayrali o'pka saratoni hujayralarining ko'payishi va migratsiyasiga simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya ta'siri. Aerosp. Med. Hum. Bajarish. 2017, 88, 82–89. [CrossRef]
17. Chang, D.; Xu, X.; Guo, Y.; Jiang, X.; Liu, Y.; Li, K.; Pan, C.; Yuan, M.; Vang, J.; Li, T.; va boshqalar. Simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya inson o'pkasi adenokarsinoma hujayra chizig'ining metastatik salohiyatini o'zgartiradi. Vitr. Hujayra. Dev. Biol. Anim. 2013, 49, 170–177. [CrossRef]
18. Xonaxon, D.; Weinberg, R. Saratonning belgilari: keyingi avlod. Hujayra 2011, 144, 646–674. [CrossRef]
19. Ribatti, D.; Tamma, R.; Annese, T. Saraton kasalligida epiteliya-mezenximal o'tish: tarixiy sharh. Tarjima. Onkol. 2020, 13, 100773. [CrossRef]
20. Shi, S.; Li, Q.; Cao, Q.; Diao, Y.; Chjan, Y.; Yue, L.; Wei, L. EMT transkripsiya omillari simulyatsiya qilingan mikrogravitatsiya ta'sirida yoki E-kaderinni tartibga solish orqali ortiqcha yuklanish ostida o'zgartirilgan hujayra yopishishida ishtirok etadi. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 1349. [CrossRef]
21. Topal, U.; Zamur, C. Mikrogravitatsiya, ildiz hujayralari va saraton: saraton kasalligini davolash uchun yangi umid. Stem Cells Int. 2021, 2021, 5566872. [CrossRef]
22. Ksiazkievich, M.; Markevich, A.; Zaczek, AJ Epiteliya-mezenximal o'tish: aylanma o'simta hujayralari va saraton ildiz hujayralarini bog'laydigan metastaz shakllanishining o'ziga xos belgisi. Patobiologiya 2012, 79, 195–208. [CrossRef] [PubMed]
23. Yan, T.; Tian, D.; Chen, J.; Tan, Y.; Cheng, Y.; Ha, L.; Deng, G.; Liu, B.; Yuan, F.; Chjan, S. FCGBP prognostik biomarkerdir va Gliomada immun infiltratsiyasi bilan bog'liq. Old. Onkol. 2021, 11, 769033. [CrossRef] [PubMed]