Yagona hujayrali transkriptomika erta va tanlab olingan podotsit shikastlanishidan keyin buzilgan buyrak filtri hujayra-hujayra o'zaro ta'sirini aniqlaydi.
Jul 01, 2024
Surunkali buyrak kasalliklari (CKD)dunyo bo'ylab 700 million odamga ta'sir qiladimaxsusfic davolash usullarietishmaydi.1 Ko'pchilikbuyrak kasalliklari kelib chiqadi in theglomerulus, thefibuyrakning ltratsiya birligi. Glomerulus (i) podotsitlardan, oraliq diafragmalarni hosil qiluvchi va glomerulyar kapillyarlarni o'rab turuvchi murakkab oyoq jarayonlariga ega bo'lgan maxsus postmitotik hujayralardan iborat; (ii) umumiy glomerulyar bazal membranada (GBM) podotsitlar qarshisida joylashgan endotelial hujayralar; (iii) glomerulusni strukturaviy ta'minlovchi matritsa hosil qiluvchi mezangial hujayralar; va (iv) Bowman kapsulasini qoplaydigan parietal epiteliya hujayralari (PEC).2 Ayniqsa, podotsitlarning shikastlanishi ko'plab keng tarqalgan, progressiv buyrak kasalliklariga olib keladi, jumladan diabetik buyrak kasalligi (DKD), fokal segmental glomeruloskleroz (FSGS) va nefrotik sindrom (ham idiopatik, ham genetik). Shikastlanishning kanonik shakli aktin sitoskeletini qayta tashkil etish natijasida yuzaga kelgan oyoq jarayonining o'chirilishi deb nomlanuvchi interdigitatsiya qiluvchi podotsitlar oyoq jarayonlarining yo'qolishiga olib keladi. Ushbu o'chirish diafragma diafragmasining buzilishiga olib keladi, bu jismoniy to'siq sifatida ishlaydi.filter, keyin podotsitlar ajralishi yoki o'lim.3,4 Boshqa tomondan, buzilmagan podotsitlardan tashqari, shakllanishi va saqlanishiglomerulyarfiltratsiya to'sig'italab qiladiintraglomerulyar aloqa, bir qator avtokrin va parakrin signalizatsiya mexanizmlari tomonidan qattiq nazorat qilinadi. Misol uchun, tomir endotelial o'sish omili A (VEGFA) podotsitlar tomonidan ajratilgan endotelial hujayralar uchun, trombotsitlardan kelib chiqadigan o'sish omili B (PDGFB) esa endotelial hujayralar tomonidan chiqariladigan mezangial hujayralar uchun prosurvival signalidir.5 Ushbu hujayra-hujayra o'zaro ta'sirining buzilishi ko'pincha glomerulyar kasalliklarda, shu jumladan FSGS va DKDda kuzatiladi.6 Shu sababli, glomerulusdagi eng erta buzuvchi o'zgarishlarni aniqlash yangi maqsadlar va terapevtik muvaffaqiyatni optimallashtirish imkoniyatini taklif qilishi mumkin.buyrak kasalliklarini davolash.
UCHUN YANGI O'TLARBUYRAK KASALLIKLARINI DAVOLASH
NIH Milliy diabet va ovqat hazm qilish va buyrak kasalliklari instituti tomonidan qo'llab-quvvatlangan DK103658, DK099465 va DK095045 (AG) grantlari. Glomerulyar aloqa, bir qator avtokrin va parakrin signalizatsiya mexanizmlari tomonidan qattiq nazorat qilinadi. Masalan, qon tomir endotelial o'sish omili A (VEGFA) podotsitlar tomonidan ajratilgan endotelial hujayralar uchun, trombotsitlardan kelib chiqadigan o'sish omili B (PDGFB) esa endotelial hujayralar tomonidan chiqariladigan mezangial hujayralar uchun omon qolish signalidir.5 Bu hujayralarning buzilishi. hujayra o'zaro ta'siri ko'pincha glomerulyar kasalliklarda, shu jumladan FSGS va DKDda kuzatiladi.6 Shu sababli, glomerulusdagi eng erta buzuvchi o'zgarishlarni aniqlash yangi maqsadlar va buyrak kasalliklarini davolashda terapevtik muvaffaqiyatni optimallashtirish imkoniyatini taklif qilishi mumkin.
Yagona hujayrali RNK ketma-ketligi (scRNAseq) o‘ziga xos buzilishlardan so‘ng murakkab to‘qimalar va hujayra holatining alohida hujayra turlarini o‘rganish qobiliyatini inqilob qildi.7,8 Buyrakdagi so‘nggi scRNAseq tadqiqotlari sog‘lom sichqonlarda va inson namunalari, shuningdek, ayrim kasallik holatlarida, jumladan, DKD va qizil yuguruk nefritida.9e12 Biroq, glomerulyar hujayralar holatini batafsil o'rganish tahlil qilish uchun mavjud bo'lgan hujayralar sonining kamligi bilan cheklangan. Bundan tashqari, podotsitlar shikastlanishi bilan bog'liq barcha glomerulyar hujayralarda yuzaga keladigan eng erta hujayra tipidagi o'ziga xos o'zgarishlar kuzatilmagan va hali aniqlanmagan.
Muhim endogen oqsil - CTCF ning podotsitlarga xos induktsiyali delektsiyasi orqali podotsit ablasyonu progressiv proteinurik buyrak kasalligi va CKDga olib keladi.13 Tarixiy jihatdan, CKD sichqoncha modellari ekzogen toksinlar yoki jarrohlik aralashuvlar natijasida buyrak shikastlanishini qo'zg'atish orqali yaratilgan. ketma-ket mexanik o'zgarishlarni takrorlash. Muhim endogen molekula bo'lgan CTCF ning yo'q qilinishi podotsitlarning tez yo'qolishiga, og'ir progressiv albuminuriyaga, suyak mineral metabolizmining o'zgarishiga, buyrak etishmovchiligiga va erta o'limga olib keladi.13 Induksiyalangan podotsitlarga xos CTCF delesiyasi (iCTCFpod / ) modeli o'rganish uchun noyob imkoniyatni beradi. podotsitlarning induktsiyalangan shikastlanishi natijasida intraglomerulyar hujayralar o'zaro ta'siridagi o'zgarishlar. Podotsitlarning CTCF ifodasi iCTCFpod/sichqonlarda doksisiklin vositasida Cre induksiyasining 1 haftasida, eng erta vaqtda aniqlanmaydi.13 Gistologik tahlil bilan o‘lchanadigan podotsitlarning sezilarli va progressiv yo‘qolishi Cre induksiyasidan 2 hafta o‘tgach boshlanadi. Joriy tadqiqotda 1-hafta vaqtida podotsitlar shikastlanishi natijasida kelib chiqqan intraglomerulyar hujayra-hujayra o'zaro ta'siridagi eng erta o'zgarishlarni aniqlash uchun batafsil tahlil o'tkazildi, bu esa oxir-oqibat CKDga olib keladi.
Materiallar va usullar
Hayvonlarni parvarish qilish
Ushbu tadqiqot Garvard tibbiyot maktabi Brigham va ayollar kasalxonasida hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan. Hayvonlarning barcha tadqiqotlari Garvard tibbiyot maktabi Brigham va ayollar kasalxonasida Hayvonlarni parvarish qilish va foydalanish qo'mitasi tomonidan o'rnatilgan va tasdiqlangan ko'rsatmalarga muvofiq amalga oshirildi. iCrepod-Ctcfwt/fl sichqonlari avval ta'riflanganidek yaratildi13 va iCrepod-Ctcffl/fl (iCTCFfl/fL) va iCrepod-Ctcfwt/wt [yovvoyi tipdagi (WT)] sichqonlarini yaratish uchun tug'ildi. Ushbu tadqiqotda erkak va urg'ochi sichqonlardan foydalanilgan. Doksisiklin (4 g/L) (Sigma D9891) saxaroza (50 g/L) (VWR BDH0308) bo‘lgan ichimlik suvida iCTCFfl/fL (iCTCFpod/sichqoncha hosil qiladi) va WT littermate nazorat qiluvchi sichqonlarga (6 dan 8 gacha) doimiy ravishda kiritildi. Doksisiklinni qo'llash boshlanishida haftalar) Cre ifodasini maxsus podotsitlarda haydash uchun.
Butun buyrakdan glomerulyar boyitish
iCTCFpod / va WT sichqonlari 1 haftalik doksisiklin bilan davolashdan so'ng qurbon qilindi va buyraklar tezda parchalanib, muzdek sovuq Hanksning muvozanatli tuz eritmasi bilan yuvildi (katalog raqami 14170112, Thermo Scientific, Waltham, MA). Buyrak kapsulalarini olib tashlangandan so'ng, glomerullar 180- mm, 75- mm va 53- mm elaklar bilan elakdan o'tkazish usuli14 yordamida 4 C da boyitilgan. 53- mm elakdan toʻplangan glomerulyar boyitilgan fraksiyalar muzdek sovuq 1 Hanksning muvozanatli tuz eritmasi bilan yuvilib, muz ustiga qoʻyildi.
Bir hujayrali suspenziyalarni tayyorlash
Kutubxonani tayyorlash va bir hujayrali ketma-ketlik
Yagona hujayralar ishlab chiqaruvchining protokoliga binoan Chromium Single Cell 30Library, Gel Bead va Chip to'plamlari (10 Genomics, Pleas anton, CA) yordamida 10 Chromium 30Single Cell Platformasi orqali qayta ishlandi. Qisqacha aytganda, 10,{5}} hujayralar chipning har bir kanaliga Chromium asbobida emulsiyadagi gel boncuklariga bo'linish uchun qo'shildi, so'ngra hujayra lizisi va tomchilarda RNKning shtrixli teskari transkripsiyasi amalga oshirildi. Emulsiyani sindirish, kuchaytirish, parchalanish va adapter va namuna indeksini qo'shish bilan davom etdi. Kutubxonalar birlashtirildi va Illumina HiSeq-da ketma-ketlashtirildi.
Gibridlanish zanjiri reaktsiyasi
Barcha gibridizatsiya zanjiri reaktsiyasi (HCR) v3 reagentlari (zondlar, soch qisqichlari va tamponlar) Molecular Technologies (Pasadena, CA) dan sotib olingan. To'qimalarning yupqa bo'laklari (1{19}} m) 1:5 bilan qoplangan 24-quduq tagidagi shisha plitalarga (katalog raqami 82050-898, VWR, Radnor, PA) o'rnatildi{{38} } (3-aminopropil)trietoksisilanni suyultirish (katalog raqami 440140, Sigma-Aldrich). To'qimalarga quyidagi eritmalar qo'shildi: 15 daqiqa davomida 10% formalin (katalog raqami 100503- 120, VWR), 1 PBS ni ikki marta yuvish (katalog raqami AM9625, Thermo Fisher Scientific), muzli 70% EtOH 20 da C 2 soat davomida (kechagacha), 0,2% Tween-20 (SSCT) bilan 5 tuzli natriy sitratni uch marta yuvish (katalog raqami 15557044, Thermo Fisher Scientific), gibridlanish buferi (Molekulyar Texnologiyalar) 10 daqiqa davomida, zondlar ichida gibridizatsiya buferi bir kechada, 15 daqiqa davomida to'rt marta yuvish buferi (Molekulyar Texnologiyalar), 5 SSCT ni uchta yuvish, 10 daqiqa davomida kuchaytiruvchi bufer (Molekulyar Texnologiyalar) va 5 SSCT bilan 15 daqiqalik uchta yuvish (1:10,{{31) }} DAPI, katalog raqami TCA2412-5MG, VWR) ikkinchi yuvishda. Soch iplari bir kechada kuchaytirish buferida issiqlik bilan denatüratsiya qilindi. Namunalar 5 SSCTda saqlangan va tasvirlangan. Tasvirlash NIS-elementlar AR dasturida ishlaydigan aylanuvchi disk konfokalida (Nikon Eclipse Ti da Yokogawa W1) amalga oshirildi. Rasmni tahlil qilish va qayta ishlash ImageJ Fiji dasturining 2.1.0/1.53c versiyasida amalga oshirildi (NIH, Bethesda, MD; http://imagej.nih.gov/ij).
Ma'lumotlarni qayta ishlash va sifat nazorati
A Cellranger toolkit (version 2.1.1) was used to perform demultiplexing using the cellranger mkfastq command and the cellranger count command for alignment to the mouse transcriptome, cell barcode partitioning, collapsing unique molecular identifier (UMI) to transcripts, and gene-level quantification. Cells were filtered to include cells expressing a minimum of 500 genes and a maximum of 4000 genes. Furthermore, the percentage of reads mapping to mitochondrial genes was capped at 12%. DoubletFinder was used to identify potential doublets.15 Clusters with >Yuqori ishonchli dubletlar sifatida tasniflangan hujayralarning 75% keyingi tahlildan olib tashlandi. Yuqori ishonchli dubllar sifatida tasniflangan qolgan hujayralar ham keyingi tahlildan olib tashlandi. Tahlil bu farqni hisobga olish uchun hujayralar sonini kamaytirishni o'z ichiga oladi. Misol uchun, agar ma'lum bir hujayra turida WT hujayralari kamroq bo'lsa, differentsial ifoda tahlili uchun WT hujayralari soniga teng bo'lgan iCTCF hujayralarining tasodifiy namunasi ishlatilgan.
Nazoratsiz klasterlash va o'lchamlarni qisqartirish
Seurat R paketining 3-versiyasidagi standart sozlamalar.0 genlar ifodasi sonini normallashtirish (NormalizeData), o‘zgaruvchan genlarni aniqlash (FindVariableGenes), integratsiya langarlarini topish (FindIntegrationAnchors) va namunalarni birlashtirish (IntegrateData) uchun ishlatilgan. . UMI soni va mitoxondrial genlarga nisbati (ScaleData) tufayli kiruvchi o'zgarishlar yuz berdi. O'lchovni kamaytirish juda o'zgaruvchan genlarda asosiy komponentlar tahlillari (RunPCA) yordamida amalga oshirildi. PCElbowPlot() funksiyasi keyingi tahlil uchun asosiy komponentlarni ajratish uchun ishlatilgan. Barcha yacheykalarni klasterlash uchun dastlabki 40 asosiy komponent barcha dispersiyalarni yetarli darajada qamrab oldi. Molekulyar jihatdan farqlanuvchi klasterlar standart parametrlar (FindClusters) va 0.4 (FindNeighbors) ruxsati yordamida aniqlandi. Ma'lumotlar glomerulyar hujayralarni o'rnatgandan so'ng, yuqorida aytib o'tilganidek, qayta ishlandi va o'lchov qilindi. 0,3 (FindNeighbors) ruxsati bilan quyi oqimdagi klasterlash uchun jami 30 ta asosiy komponentdan foydalanilgan.
Hujayra turlarining tasnifi
Klaster bilan boyitilgan yoki markerli genlar klaster hujayralaridagi genlarni boshqa barcha hujayralarga nisbatan differentsial ifodalash uchun Wilcoxon rank sum testi (FindAllMarkers) yordamida hisoblab chiqilgan va {{1 ning sozlangan P qiymati (noto'g'ri kashfiyot tezligi) chegarasidan o'tadigan genlarni tanlagan. }}.05 klaster vakili sifatida. Klaster identifikatori ma'lumotlarga asoslangan genlarni etuk buyrak hujayralari turlari uchun adabiyotda yaratilgan genlar ro'yxati bilan solishtirish orqali tayinlandi.
Differensial gen ekspressiyasi tahlili
Seuratda (FindMarkers) juftlik differensial ifodasi tahlili jurnalning katlamini o'zgartirish chegarasi {0}}.01 ga o'rnatilgan va ma'lum bir klasterdagi iCTCFpod / va WT hujayralari o'rtasidagi differentsial ifodani tahlil qilish uchun standart parametrlar bilan ishlatilgan. FindMarkers ichida ident.1 klasterga xos iCTCFpod/hujayralariga, ident.2 esa mos keladigan klasterga xos WT hujayralariga o'rnatildi. Sozlangan P <0,05 bo'lgan genlar muhim deb hisoblanadi.
Haddan tashqari vakillik tahlili
Haddan tashqari vakillik tahlili har qanday ma'lum biologik funksiyalar yoki jarayonlar differentsial ifodalangan genlar ro'yxati (lar)ida haddan tashqari ko'rsatilgan yoki boyitilganligini aniqlash uchun ishlatilgan. Ont Z BP, pvaluecutoff Z 0.25 va qvaluecutoff Z 0.25 istisnolaridan tashqari standart parametrlar ishlatilgan. Keyin R paketini enrichplot (GitHub, https://github.com/YuLab-SMU/enrichplot, oxirgi marta 2021-yil 30-avgustda kirilgan) boyitish natijalarini yuqori boyitish shartlarini tuzish orqali vizualizatsiya qilish uchun, xususan, emapplot funksiyasidan foydalanilgan.
Ligand retseptorlari tahlili
iTALK19 retseptorlarini iCTCFpod / podotsitlarda differensial ravishda ifodalangan ligandlarga xaritalash uchun ishlatilgan. Xususan, rawParse Seurat maʼlumotlaridan foydalangan holda har bir genning oʻrtacha ifodasini hisoblash uchun ishlatilgan. Ligand va retseptor juftlarini aniqlash uchun Z ma'lumotlar turidan foydalangan holda FindLR ishlatilgan. Qiziqarli ligand va retseptor juftlari LRPlotning standart parametrlari yordamida chizilgan. Chiziqlarning qalinligi ligandning nisbiy o'rtacha ifodasini, o'qning o'lchami esa retseptorning nisbiy o'rtacha ifodasini ko'rsatadi.
NicheNet tahlili
R to'plami NicheNet20 ligandretseptorlarning o'zaro ta'sirini bashorat qilish uchun ishlatilgan, bu esa qiziqish uyg'otadigan hujayra turidagi genlar ifodasi o'zgarishiga olib kelishi mumkin. Ushbu tahlil uchun barcha podotsitlar klasterlari va barcha endotelial klasterlar birlashtirildi. Barcha standart parametrlar 0.11 ning pastki chegara chegarasini oʻrnatishdan tashqari,_ligand{4}}maqsadni_vizuallashtirishga tayyorgarlik koʻrish uchun ishlatilgan. HCR tasvirni qayta ishlash va miqdorni aniqlash tasvirlari ImageJ2 dasturi yordamida qayta ishlandi (NIH, Bethesda, MD; http://imagej.nih.gov/ij). ImageJ fayllari uchun 2.1.0/1.53c versiyasidan foydalanilgan (http://imagej.net/ Contributors (oxirgi marta 2020-yil 2-avgustda kirilgan). Raw ND2 fayllari Rolling Ball usuli yordamida fondan chiqarildi (rolling Z 50 sliding stack) Keyin Z-stack tasvirlarining o'rtacha intensivligi proyeksiya qilindi va tasvir kanallari alohida saqlangan CellProfiler 3.1.5 versiyasi (Broad Institute of MIT and Garvard, Kembrij, MA) 21 floresans intensivligi asosida. DAPI kanali va qolgan kanallarda integratsiyalangan floresans intensivligini o'lchash uchun to'rtta WT va to'rtta iCTCFpod / sichqonchalar statistik tahlil uchun baholandi.
Wecistanche-ning qo'llab-quvvatlovchi xizmati - Xitoydagi eng yirik cistanche eksportchisi:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Batafsil texnik xususiyatlar uchun xarid qiling:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
BUYRAK FONKSIYASI UCHUN 25% EKINAKOSID VA 9% AKTEOSID BILAN TABIY ORGANIK SİSTANCHE EKSTRAKTINI OLISH UCHUN SHU YERGA BOSING
