Konservalangan sisteinga boy sekretor oqsili MaCFEM85 o'simlik himoyasini faollashtirish uchun MsWAK16 bilan o'zaro ta'sir qiladi.
Oct 26, 2023
Annotatsiya: Metarhizium anisopliaeentomopatogen qo'ziqorin bo'lib, u o'simliklarning o'sishi va mezbon o'simliklarda endofit sifatida harakat qilganda qarshilikni kuchaytiradi. Biroq, oqsillarning o'zaro ta'siri yoki ularning faollashtiruvchi mexanizmlari haqida kam narsa ma'lum. Zamburug'li hujayradan tashqari membranada (CFEM) keng tarqalgan oqsillar o'simlik qarshiligini bostiruvchi yoki faollashtiradigan o'simlik immun regulyatorlari sifatida aniqlangan. Bu erda biz asosan plazma membranasida joylashgan CFEM domenini o'z ichiga olgan MaCFEM85 proteinini aniqladik. Xamirturush ikki gibrid (Y2H), glutation-S-transferaza (GST) pastga tushirish va bimolekulyar floresansni to'ldirish tahlillari MaCFEM85 ning hujayradan tashqari domen bilan o'zaro ta'sir qilishini ko'rsatdi.Medicago sativa(beda) membrana oqsili, MsWAK16. Gen ifodasi tahlillari shuni ko'rsatdiki, MaCFEM85 va MsWAK16 sezilarli darajada yuqori tartibga solingan.M. anisopliaevaM. sativa, mos ravishda, birgalikda emlashdan keyin 12 dan 60 soatgacha. Qo'shimcha xamirturushli ikki gibrid tahlillari va aminokislotalar joyiga xos mutatsiya CFEM domeni va 52-sistein MaCFEM85 ning MsWAK16 bilan o'zaro ta'siri uchun maxsus talab qilinishini ko'rsatdi. Mudofaa funktsiyasi tahlillari JA yuqori tartibga solinganligini ko'rsatdi, ammo Botrytis cinerea lezyonining hajmi va Myzus persicae ko'payishi Nicotiana benthamiana namunaviy xost o'simlikida MaCFEM85 va MsWAK16 ning vaqtinchalik ifodasi bilan bostirildi. Birgalikda bu natijalar M. anisopliae ning xos o'simliklar bilan o'zaro ta'siri ostida yotgan molekulyar mexanizmlar haqida yangi tushunchalar beradi.
cistanche qo'shimchasi foydalari - immunitetni oshiradi
Kalit so'zlar: devor bilan bog'langan kinaz; CFEMlar; Metahizium anisopliae; o'simlik immuniteti; Medicago sativa
1.Kirish
O'simliklar va mikroblarning o'zaro ta'siri keng tarqalgan bo'lib, o'tmishdagi va davom etayotgan birgalikda evolyutsiya natijasidir. Ushbu o'zaro ta'sirlar har bir ishtirokchi uchun foydali, neytral yoki salbiy natijalarga olib kelishi mumkin [1-3]. Foydali rizosfera mikrobiota o'simliklarning o'sishini kuchaytirishi va tuproq kasalliklaridan himoya qilish yoki ozuqa moddalarini iste'mol qilishni kuchaytirish orqali umumiy salomatlikni yaxshilashi mumkin [4,5]. Foydali mikroblarning keng assortimenti o'simliklarning ozuqa moddalarini qabul qilish, o'sish, patogen va hasharotlar himoyasi kabi imkoniyatlarini oshirishi mumkin [6,7]. Metarhizium Sorok¯in o'simliklarni mustamlaka qilish qobiliyatiga ega bo'lgan entomopatogen zamburug'larning muhim jinsidir [8], ammo bu jins vakillari o'simlik patogenlariga chidamliligini oshirishi mumkinligini ko'rsatadigan dalillar ham mavjud. Misol uchun, laboratoriya tadqiqotida Fusarium solani (Mart.) Sacc ning 60% inhibisyonu aniqlandi. Metarhizium robertsii (ilgari M. anisopliae nomi bilan tanilgan) mavjudligida M. robertsii [9] bo'lmagan nazorat bilan solishtirganda. Ba'zi Metarhizium shtammlari o'simliklarning himoya genlarining ifodasini o'zgartirish orqali o'simliklarning hasharotlar zararkunandalari va kasalliklariga chidamliligini oshirish potentsialiga ega. M. Roberts bilan endofitik kolonizatsiya makkajo'xori barglarida ham jasmonik kislota (JA) va salitsil kislotasi (SA) himoya yo'llarining ifodasini faollashtiradi; Bundan tashqari, bunday kolonizatsiya o'simliklarning o'sishini rag'batlantirish va Agrotis epsilon (Hufnagel) lichinka rivojlanishini bostirish bilan bog'liq [10]. Metarhizium guizhouense Lansium paraziticum meva poʻstlogʻida -1,3-glyukanaza va xitinazani faollashtirib, Botrytis sp. oʻsishini inhibe qilgan. va Fusarium sp. Aglaia dookkoo Griff mevasi bo'yicha [11]. Bundan tashqari, M. anisopliae yeryong'oq ko'chatlariga qo'llanganda, turli xil transkripsiya omillari, jumladan WRKY, MYC, TGA va etilenga javob beruvchi transkripsiya omillari faollashdi, shu bilan birga nitrat tashuvchilar va suvsizlanishga javob beruvchi elementlarni bog'laydigan oqsillar ham differentsial tarzda ifodalangan [12] . Bu shuni ko'rsatadiki, M. anisopliae o'simlikni kolonizatsiya qilganda o'simlik himoyasi genlarini tartibga soladi. Biroq, Metarhizium infektsiyasidan keyin o'simliklarning himoya reaktsiyalarining asosiy mexanizmlari haqida nisbatan kam narsa ma'lum. Effektorlar mikroorganizmlarning o'simlik qarshiligini tartibga soluvchi keng tarqalgan vositadir [13]. O'simlik qarshiligining faollashishi odatda oksidlovchi portlash va gormonlar, metabolitlar va boshqa signallarning induktsiyasi bilan tavsiflanadi [13]. SA va JA o'simlik gormonlari o'simlik qarshiligini qo'zg'atishda muhim rol o'ynaydi, ikkita alohida himoya signalizatsiya yo'lida vositachilik qiladi [14]. SA signalizatsiya yo'li birinchi navbatda o'simliklarning allergik reaktsiyasida va patogenlarga tizimli ravishda orttirilgan qarshilikda ishlaydi, lekin u hasharotlarning oziqlanishi natijasida kelib chiqqan bilvosita o'simliklarni himoya qilish reaktsiyalarida ham ishtirok etishi mumkin [15]. SA ning to'planishi, flavonoidlar va lignin kabi quyi oqimdagi ixtisoslashgan metabolitlarning sintezi va to'planishiga vositachilik qiluvchi lipid o'tkazuvchi oqsillarni (LTPs) va fenilalanin ammiak-liazni (PAL) [16] kodlovchi genlarning ko'payishi bilan bog'liq [17]. JA signalizatsiya yo'li mexanik shikastlanishlar, qo'ziqorin patogenlari va hasharotlar zararkunandalariga bevosita va bilvosita javob berishda ishlaydi. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, JA signalizatsiyasi keng biologik funktsiyalarga ega bo'lgan terpenoidlar, fenilpropanoidlar va alkaloidlar kabi maxsus metabolitlarning sinteziga tartibga soluvchi ta'sir ko'rsatadi [18]. MetilJA (MeJA), jumladan Taxus turlaridagi paklitaksel [19,20], Centella Asiatica (L.) Urban [21] terpenoidlari va jenshendagi saponinlar [22] bilan davolashdan keyin baʼzi maxsus metabolitlar oʻsimlik hujayralarida toʻplanishi koʻrsatilgan. . SA va xitozanni (CHT) elisitator sifatida qo'llash pomidorda lignin to'planishi va himoya fermenti reaktsiyalarini keltirib chiqardi, bu Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi infektsiyasini kamaytirdi [23]. Bundan tashqari, bug'doydagi JA va SA darajalari PeaT elisitorini qo'llash orqali sezilarli darajada to'planib, jo'xori aphid Sitobion avenae (Fabricius) ga qarshi himoya reaktsiyasini kuchaytirdi [24]. Bu shuni ko'rsatadiki, o'simlik immuniteti ushbu effektorlar tomonidan o'simlik gormonlari va metabolitlari orqali tartibga solinishi mumkin.
cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi
Qo'ziqorin hujayradan tashqari membranasida (CFEM) keng tarqalgan oqsillar zamburug'larning keng doirasida mavjud. Ular odatda uzunligi 60 aminokislota (aa) bo'lgan domenlarni kodlaydi va sakkizta xarakterli intervalgacha sisteinlarni o'z ichiga oladi [25]. CFEM domenlari epidermal o'sish faktoriga (EGF) o'xshash domenlarga o'xshaydi, ular hujayradan tashqari retseptorlar, signal o'tkazgichlari yoki xost-patogen o'zaro ta'sirida yopishish molekulalari sifatida ishlaydi [26]. CFEM domenlarini o'z ichiga olgan oqsillar effektor sifatida harakat qilib, o'simlik qarshiligini boshqarishi mumkin. Bug'doy bargi zang qo'ziqorini Puccinia triticina Erikasda CFEM effektor nomzodi PTTG_08198 hujayra o'limini tezlashtirdi va reaktiv kislorod turlarining (ROS) to'planishini rag'batlantirdi [27]. Antraknoz qo'ziqorini Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils beshta effektorni (CgCFEM6, 7, 8, 9 va 15) o'z ichiga oladi, ular Nicotiana benthamiana Domin [28] da BAX sabab bo'lgan dasturlashtirilgan hujayra o'limini bostirishi ko'rsatilgan. Laccaria bicolor (Maire) PDOrton fitosimbiotik mikorizal qo'ziqorin simbiotik to'qimalarda Lac310796, Lac296573 va Lac296572 kabi bir nechta CFEM oqsillarini ajratgani xabar qilingan [29]. Ushbu oqsillarning murakkab funktsiyalari mikorizal simbiozda qo'shimcha o'rganilmagan bo'lsa-da, oldingi natijalar CFEM oqsillari zamburug'lar va o'simliklar o'rtasidagi signalizatsiyada ishlashi mumkinligini ko'rsatadi. M. anisopliae xos oʻsimlikda entomopatogen yoki endofit zamburugʻ vazifasini bajarishi mumkin [30]. Biroq, CFEM oqsillarining roli hali xabar qilinmagan. Biz ilgari M. anisopliae, MaCFEM85 (GenBank ID: MZ682609) [31] da CFEM domenini o'z ichiga olgan oqsilni aniqladik. Bu erda biz MaCFEM85 va Medicago sativa devor bilan bog'langan kinaz MsWAK16 o'rtasidagi munosabatlar haqida xabar beramiz. Biz MaCFEM85 ketma-ketligini tahlil qildik va MsWAK16 bilan o'zaro ta'sir qilish uchun qaysi qoldiqlar muhimligini aniqlash uchun tajribalar o'tkazdik. Nihoyat, N. benthamiana o'simligimizdan namunaviy o'simlik sifatida foydalanib, biz Botrytis cinerea va Myzus persicae aphidiga qarshi o'simliklarning himoya reaktsiyalarini MaCFEM85 va MsWAK16 ning vaqtinchalik ifodasi bilan va ularsiz baholadik.
Cistanche tubulosa foydalari- immunitet tizimini mustahkamlash
Cistanche Enhance Immunity mahsulotlarini ko'rish uchun shu yerni bosing
【Batafsil ma'lumot so'rang】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2. Natijalar
2.1. MaCFEM85 patogen bo'lmagan qo'ziqorin CFEMlari bilan chambarchas bog'liq edi va plazma membranasiga lokalizatsiya qilindi.
Patogen va patogen bo'lmagan model zamburug'laridan MaCFEM85 va boshqa CFEM oqsillari o'rtasidagi munosabatlarni tahlil qilish uchun filogenetik daraxt qurilgan. Bularga Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl), Neurospora crassa Shear & BODodge va Beauveria bassiana (Bals.) kiradi (4-bo'limga qarang). MaCFEM85 B. bassianadagi CFEM oqsillari bilan eng yaqin bog'liq edi va shuning uchun patogen zamburug'larga qaraganda patogen bo'lmaganlarga evolyutsion jihatdan yaqinroq edi (1a-rasm).
1a-rasm
2.2. MaCFEM85 M. sativa bilan o'zaro ta'sir davomida yuqori tartibga solingan
Devor bilan bog'langan retseptorga o'xshash kinazlar (WAK'lar) retseptorlarga o'xshash protein kinazlar (RLKs) superoilasidagi kichik guruhni ifodalaydi va hujayradan tashqari domen, transmembran spiral va hujayra ichidagi kinaz domenini o'z ichiga oladi. Ular o'simliklarning o'sishini, rivojlanishini, stressga javob berishini va patogenga qarshi signalizatsiya yo'llarini tartibga solishda muhim rol o'ynaydi [32]. RNK M. anisopliae hyphae va M. sativa ildizlaridan birgalikda inkubatsiyadan so'ng MaCFEM85 va MsWAK16 ning ifoda naqshlarini tekshirish uchun olingan. MaCFEM85 va MsWAK16 ikkalasi ham 12 dan 6 0 soatgacha bo'lgan koinkubatsiya paytida sezilarli darajada yuqori darajada ifodalangan (1c,d-rasm). 0 dan 36 soatgacha, MaCFEM85 ifodasi asta-sekin o'sib, 36 soatda cho'qqiga chiqdi. M. anisopliae va M. sativa birikmasida yakka oʻstirilgan M. anisopliae bilan solishtirganda × 593 marta koʻproq ifodalangan. MaCFEM85 ifodasi 48-60 soat ichida biroz pasaygan bo'lsa-da, u hali ham M. anisopliae o'stirilgandan ko'ra sezilarli darajada yuqori darajada ifodalangan. MsWAK16 ham sezilarli darajada ko'tarildi, ifoda 36 soatda cho'qqisiga chiqdi. M. anisopliae bilan kasallangan M. sativada MsWAK16 M. anisopliae bo'lmagan M. sativaga qaraganda × 89,06 marta ko'proq ifodalangan. 36 dan 60 soatgacha MsWAK16 darajasi biroz pasaydi, ammo uning ifodasi hali ham emlanmagan o'simliklarga qaraganda ancha yuqori edi.
2.3. MaCFEM85 MsWAK16 In Vitro va In Vivo bilan o'zaro ta'sir qiladi
M. anisopliae davolashga javoban MaCFEM85 ning potentsial funktsional mexanizmini o'rganish uchun, MaCFEM85 bilan o'zaro ta'sir qiluvchi xost oqsillarini oldindan aniqlash uchun xamirturushli ikki gibrid (Y2H) ekrani o'tkazildi. MsWAK16 (MsWAK16-ED) va MaCFEM85 ning hujayradan tashqari domeni o'rtasidagi o'zaro ta'sir BD vektori sifatida pGBKT7 da MaCFEM85 va pGADT7 da MsWAK16 dan AD vektori sifatida foydalangan holda birma-bir xamirturushli ikki gibrid tahlil bilan tekshirildi. Barcha transformatsiyalangan xamirturush SD-T/L yetishmaydigan muhitda yaxshi o‘sdi, musbat nazorat guruhi va eksperimental guruh esa SD-T/L/H/A + X{17}}gal yetishmaydigan muhitda muvaffaqiyatli o‘sdi. Bu MaCFEM85 MsWAK16-ED bilan oʻzaro aloqada boʻlishi mumkinligini koʻrsatdi (2a-rasm).
Shakl 2. MaCFEM85 va MsWAK16 o'rtasidagi o'zaro ta'sirni tekshirish.
In vitro tekshiruvi uchun glutation-S-transferaza (GST) yorlig'i bo'lgan MsWAK16-ED (60 kDa mahsulotni kodlovchi) pGEX6-P2 va polihistidin (His) yorlig'i bo'lgan MaCFEM85 ga kiritildi. 17 kDa lik mahsulotni kodlash) pET-21b ga kiritildi. His va GST antikorlari bilan immunoblotatsiya qilish shuni ko'rsatdiki, rekombinant oqsil MaCFEM85-Uning GST-MsWAK16-ED o'ljasi bilan o'zaro ta'sir qiladi, lekin faqat GST bilan emas va GST-MsWAK16- ED Uning bilan o'zaro ta'sir qiladi. -MaCFEM85 (2b-rasm). MaCFEM85 va MsWAK16 oʻrtasidagi oʻzaro taʼsirni qoʻshimcha tasdiqlash uchun biz MaCFEM85-YFPN va MsWAK16-YFPC konstruksiyalari bilan bimolekulyar floresan komplementatsiyasi (BiFC) tahlilini oʻtkazdik. Tamaki barglarida MaCFEM85-YFPN va MsWAK16-YFPC ning birgalikda ifodalanishi sariq floresans signalini hosil qildi, bu MaCFEM85 ning MsWAK16 bilan oʻzaro taʼsir qilganligini koʻrsatadi (2c-rasm).
2.4. MaCFEM85 va MsWAK16 shovqinlari uchun asosiy saytlar
MsWAK16-ED bilan oʻzaro aloqada boʻlish uchun zarur boʻlgan MaCFEM85 hududini aniqlash uchun SMART onlayn dasturi yordamida oqsil domenlari bashorat qilingan (3a-rasm). MaCFEM85 19-86 aa hududida CFEM domenini o'z ichiga olgan. Uchinchi darajali tuzilma ham bashorat qilingan (3b-rasm). Ushbu domendagi sakkizta sistein to'rtta disulfid bog'lanishiga olib keldi (CYS26 va CYS69, CYS30 va CYS64, CYS43 va CYS50 va CYS52 va CYS85), oqsilning barqarorligini saqladi (3b-rasm). MaCFEM85-da taxminiy o'zaro ta'sir qilish joylarini tasdiqlash uchun oqsilning etti mutatsiyaga uchragan versiyasi yaratildi va pGBKT7 ga yem oqsillari sifatida kiritildi. Har bir rekombinant vektor Y2H Gold shtammida AD-MsWAK16-ED bilan birgalikda transfektsiya qilingan. CYS52 mutatsiyaga uchragan shtamm selektiv muhitda o'smagan (3c-rasm, qizil rangda ko'rsatilgan), bu CYS52 MaCFEM85 ning MsWAK16-ED bilan o'zaro ta'siri uchun zarurligini ko'rsatadi.
2.5. MaCFEM85 ning MsWAK16 bilan o'zaro ta'siri o'simlik immunitetini faollashtiradi
2.5.1. MaCFEM85 va MsWAK16 ning B. cinerea ga qarshi kasalliklarga chidamliligidagi rolini baholash
MaCFEM85 va MsWAK16 ning patogen mudofaa reaktsiyalarida mumkin bo'lgan ishtirokini o'rganish uchun biz MaCFEM85, MsWAK16 yoki MaCFEM85 va MsWAK16 ning haddan tashqari ifodalanishi B. cinerea ga nisbatan yuqori qarshilikni keltirib chiqarishi mumkinligini tekshirdik. Biz bu vektorlarni N. benthamiana barglarida vaqtincha ifodaladik. Western blot tahlili shuni ko'rsatdiki, MaCFEM85 va MsWAK16 ular yolg'iz yoki birgalikda ifodalanganda taqqoslanadigan darajada ifodalangan, bu esa MaCFEM85 va MsWAK16 tamakida muvaffaqiyatli ifodalanganligini ko'rsatadi (4a-rasm). Kasallik tahlillari MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 yoki GFP nazorati bilan infiltrlangan N. benthamiana yordamida ham amalga oshirildi. MaCFEM85, MsWAK16 yoki MaCFEM85+MsWAK16 infiltratsiyalangan barglarda lezyonlar nazorat o'simliklari bilan solishtirganda sezilarli darajada kichikroq (emlashdan keyin 2 kun ichida ~30% ga) bo'lgan (4b-rasm). Ushbu ma'lumotlar N. benthamiana'da MaCFEM85 ning o'tkinchi ifodasi B. cinerea ga qarshilikni oshirganligini va MaCFEM85 va MsWAK16 B. cinerea ga qarshi mudofaa reaktsiyasini ijobiy tartibga solganligini ko'rsatadi.
Shakl 3. MaCFEM5 va MsWAK16 o'rtasidagi o'zaro ta'sir joyini aniqlash.
Shakl 4. MaCFEM85 va MsWAK16 ning vaqtinchalik ifodasi orqali o'simlik qarshiligini induktsiya qilish.
2.5.2. MaCFEM85 va MsWAK16 ning N. benthamianadagi aphid himoyasidagi rolini baholash
MaCFEM85 va MsWAK16 ning rolini yanada tadqiq qilish uchun vaqtinchalik MaCFEM85 va MsWAK16 ifodalovchi N. benthamiana oʻsimliklari M. persicae bilan zararlangan va populyatsiyalar baholangan. Ushbu tajriba uchun har bir N. benthamiana bargining katta maydoni MaCFEM85 va MsWAK16 o'z ichiga olgan rekombinant ikkilik vektor pYBA1132 bilan agroinfiltratsiya qilingan. Nazorat sifatida GFP ishlatilgan. Infiltratsiyadan 12 soat o'tgach, har bir bargda 20 katta yoshli M. persicae qafasga solinib, infiltratsiya qilingan hududni shira paydo bo'lishiga olib keldi. Keyingi uch kun ichida kattalardagi aphid o'limi va nimfalar soni qayd etildi; keyin nimfalar olib tashlandi. MaCFEM85, MsWAK16 yoki MaCFEM85+MsWAK16 (ch2=3.65827, DF=3, p < 0.30081) ifodalovchi oʻsimliklar bilan oziqlanadigan M. persicae populyatsiyalari orasida oʻlim xavfida sezilarli farq yoʻq edi. ) (4c-rasm). Biroq, 24, 48 va 72 soatlarda har bir katta yoshli aphid tomonidan ishlab chiqarilgan nasllarning o'rtacha soni N. benthamiana da GFP nazoratini ifodalovchi MaCFEM85, MsWAK16 yoki MaCFEM85+MsWAK16 ni ifodalovchilarga nisbatan ancha yuqori bo'lgan (rasm). 4d).
2.5.3. Gormonlar to'planishi va gormonlar bilan bog'liq gen ekspressiyasida MaCFEM85 va MsWAK16 rolini baholash
eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 va MaCFEM85+MsWAK16 ni ifodalovchi N. benthamiana oʻsimliklarining mudofaa javoblari oʻrtasidagi farqni tahlil qilish uchun biz JA, SA va umumiy flavonoid darajalarini hamda tegishli genlarning ifodasini oʻlchadik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, JA va SA darajalari eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 va MaCFEM85+MsWAK16 ni ifodalovchi o'simliklar o'rtasida farqlanadi (5a-rasm). eGFP ifodalanganlar bilan solishtirganda, JA darajalari MaCFEM85 ifodalovchi o'simliklarda sezilarli darajada past edi; SA darajalari biroz oshdi, ammo farqlar sezilarli emas edi. Aksincha, MsWAK16 ni ifodalovchi o'simliklar eGFP nazorati bilan solishtirganda JA darajalarida sezilarli farqlarni ko'rsatmadi, SA darajalari esa nazoratga qaraganda ancha past edi (5a-rasm). JA va SA darajalari eGFP bilan solishtirganda MaCFEM85+MsWAK16 ifodalovchi oʻsimliklarda mos ravishda sezilarli darajada oshdi va pasaydi.
Shakl 5. Gormonlar darajasi va gormon javob genining ifodasi
MaCFEM{0}}MsWAK16 ni ifodalovchi oʻsimliklarda flavonoidlarning umumiy miqdori boshqa davolash guruhlari bilan solishtirganda sezilarli darajada yuqori boʻlgan (5a-rasm). MsWAK16 va MaCFEM85+MsWAK16 ifodalovchi o'simliklarda biosintetik gen ekspresyon darajalari o'xshash edi. Misol uchun, JA javobi bilan bog'liq genlar, ya'ni COI1, MYC2 va PDF1.2, GFPni ifodalovchi o'simliklar bilan solishtirganda sezilarli darajada yuqori tartibga solingan (5b-rasm). Xuddi shunday, SA bilan bog'liq genlar NPR1, WRKY70 va PR1 MsWAK16 va MaCFEM85+MsWAK16 ni ifodalovchi o'simliklarda sezilarli darajada farqlangan; NPR1 yuqori tartibga solindi, WRKY70 va PR1 esa nazorat bilan solishtirganda pastga tushirildi (5b-rasm). Shuningdek, biz flavonoid sintezi bilan bog'liq bo'lgan Shikimik kislota va fenilpropanoid sintezi yo'llarida asosiy genlarning ifodasini ko'rib chiqdik. Umuman olganda, faqat MaCFEM85 ifodasi tamakida bu genlarning sezilarli darajada yuqori ifodalanishiga olib kelmadi. Biroq, bu genlar MsWAK16 yoki MsWAK{24}}MaCFEM85 ni ifodalovchi tamakida GFP nazorati bilan solishtirganda yuqori tartibga solingan (5c-rasm).
cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi
3. Munozara
3.1. Konservalangan CFEM oqsil motivi qo'ziqorin turlarida bir nechta funktsiyalarni bajaradi
CFEM domeni qo'ziqorinlarga xos bo'lib, odatda qo'ziqorin hujayradan tashqari membrana oqsillarida uchraydi. Domen Ascomycota va Basidiomycota ning eng so'nggi umumiy ajdodida paydo bo'lgan [33]. Yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, qo'ziqorin patogenlarida CFEM oqsillari o'simlik immunitetini regulyatorlari sifatida harakat qilishi mumkin, bu esa infektsiya turiga qarab xost o'simlik immunitetini bostirish yoki faollashtirishga olib keladi [28,34,35]. M. anisopliae-da CFEM domenini o'z ichiga olgan oqsillar haqida bir nechta xabarlar mavjud, faqat boshqa zamburug'lar bilan evolyutsion taqqoslash kontekstida [36]. Ushbu tadqiqotda biz M. anisopliae CFEM oqsillarini patogen va patogen bo'lmagan qo'ziqorinlarda boshqa ma'lum CFEM oqsillari bilan taqqosladik. Biz MaCFEM85 ning eng yaqin homologi Beauveria bassiana-da topilgan Cfem5 ekanligini tasdiqladik, bu turdagi 12 CFEM oqsilidan biri (Qo'shimcha rasm S1). BbCfem5 temirni olish uchun zarurdir [37]. Bundan tashqari, bashorat qilingan uchinchi darajali tuzilishga asoslanib, MaCFEM85-dagi CFEM domeni Candida albicans (CPRobin) Berkhout-da topilgan Surface Antigen Protein 2 (CSA2) ga juda o'xshaydi, unda 65 ta qoldiq (ketma-ketlikning 96%) 99,8 bilan modellangan. % ishonch [31]. Candida albicans - hayvonlarning patogenlari; CSA2 gemoglobindan gemni ajratib olish va gemni hujayra devoridan plazmaga o'tkazish orqali o'sish va patogenlikda muhim rol o'ynaydi [38-40]. Biz MaCFEM85 hasharotlar xostlarining M. anisopliae virulentligida ishtirok etishi mumkinligini taxmin qilamiz. MaCFEM85 ning hayvonlarning patogen infektsiyasi va o'simlik immunitetini faollashtirishdagi ushbu kombinatsiyalangan funktsiyalari oqsilni kelajakdagi qiziqarli tadqiqot markaziga aylantiradi.
3.2. Disulfid aloqalari oqsil funktsiyasi uchun muhim tuzilmalardir
Protein strukturasining konformatsion yaxlitligi uning ishlash qobiliyatiga bevosita bog'liq. Sistein juftlari tomonidan hosil bo'lgan disulfid bog'lari oqsilning katlamlanishi va konformatsion barqarorligini ta'minlaydi va maxsus retseptorlar yoki ligandlarni tanib olish va bog'lash uchun asosiy joylarni tashkil qiladi [41]. Misol uchun, o'simlik qo'zg'atuvchisi Cladosporium fulvum effektor oqsili AVR4 tarkibidagi uchta saqlangan disulfid aloqalaridan birini buzish proteaza sezgirligini va xitinni bog'lash qobiliyatini kamaytiradi [42]. C. fulvumning uchta boshqa oqsillarida (ECP1, ECP2 va ECP5) sisteinlar uchun alaninlarning bir marta almashtirilishi pomidorning yuqori sezuvchanlik reaktsiyasini susaytiradi, bu sisteinlarning barqarorlikni va yuqori sezuvchanlik reaktsiyasini qo'zg'atuvchi faolligini saqlab qolish uchun muhim ekanligini ko'rsatadi [43]. Bundan tashqari, Magnaporthe oryzae ning etuk oqsili MC69da, ikkita saqlanib qolgan sistein qoldig'ining mutagenezi (Cys36 va Cys46) sekretsiyaga ta'sir qilmasdan MC69 funktsiyasini buzishi mumkin, bu MC69 patogenligida disulfid bog'lanishining muhimligini ko'rsatadi [44]. CFEM domeni o'lchami va sistein qoldiqlari naqshida uch yoki to'rt juft disulfid bog'larini o'z ichiga olgan EGFga o'xshash domenlarga o'xshash ko'rinadi. EGF oqsillari hujayra yuzasi retseptorlari, signal o'tkazgichlari yoki xost-patogen o'zaro ta'sirida adezyon molekulalari sifatida ishlashi mumkin [45]. Ushbu tadqiqotda biz nafaqat MaCFEM85 ning CFEM domenida to'rt juft disulfid bog'lanish hosil qiluvchi sakkizta saqlanib qolgan sistein mavjudligini aniqladik (3b-rasm), balki biz CFEM MaCFEM85 va MsWAK16 o'rtasidagi o'zaro ta'sir uchun muhim domen ekanligini tasdiqladik. Bundan tashqari, sistein qoldiqlarining alaninga yo'naltirilgan mutatsiyasi orqali biz 52-pozitsiyadagi sistein qoldig'i o'zaro ta'sir qilish uchun zarur bo'lgan asosiy joy ekanligini aniqladik (3c-rasm). Ushbu natijalar CFEM85-WAK16 o'zaro ta'sirining fiziologik funktsiyalarini keyingi o'rganish uchun asos bo'lib xizmat qiladi.
3.3. MaCFEM85 ning MsWAK16 faollashtirilgan o'simliklar himoyasi bilan o'zaro ta'siri
Mikrob va o'simlik o'zaro ta'sirida o'simliklarning himoya reaktsiyalari odatda mikrob effektor oqsillari tomonidan faollashadi. Induktsiyalangan mudofaa qarshilikni oshirish uchun biologik zararkunandalarga qarshi kurashda muhim vositaga aylanmoqda. CFEM oqsillari o'simlik immunitetini faollashtirish yoki inhibe qilishni tartibga solishda ishtirok etadigan effektorlar sifatida aniqlangan [28,46]. Biroq, bu immunitet omillarini tartibga solishni ularning o'simlik kasalliklari va hasharotlarga chidamliligidagi o'ziga xos roli bilan bog'laydigan nashr etilgan tadqiqotlar kam. Ushbu tadqiqotda biz M. sativada MaCFEM85 va hujayra devori bilan bog'langan MsWAK16 kinaz o'rtasidagi o'zaro ta'sirni aniqlash uchun entomopatogen va endofitik qo'ziqorin M. anisopliae dan foydalandik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, bu o'zaro ta'sir B. cinerea bilan emlashdan keyin zararlanish nisbatini pasaytirdi (4b-rasm) va M. persicae populyatsiyasining o'sish sur'atini kamaytirdi (4d-rasm), bu MaCFEM85 va MsWAK16 o'rtasidagi o'zaro ta'sirni ko'rsatib, M. sativaning shiraga chidamliligini oshirdi. JA, SA va etilen (ET) darajasidagi o'zgarishlar o'simlik qarshiligining induksiyasini baholash uchun marker sifatida ishlatilishi mumkin [47,48]. Bu erda biz MaCFEM85 ning MsWAK16 bilan o'zaro ta'sirini gormonal tartibga solish orqali o'simlik qarshiligiga ta'sir qilishini va M. persicae reproduktiv tezligini inhibe qilishini ko'rsatdik (4d-rasm). Shunga o'xshash tadqiqotlar ilgari xabar qilingan. Masalan, Brevibacillus laterosporus effektor oqsili PeBL1 pomidorda JA va SA to‘planishiga va bu o‘simliklar bilan oziqlangan M. persicae ning ikkinchi va uchinchi avlod populyatsiyalarining o‘sish sur’atini kamaytirishi ko‘rsatilgan. Bundan tashqari, effektorlar bilan sepilgan pomidor oʻsimliklari M. persicae ga qaytaruvchi taʼsir koʻrsatadi [49]. PeBC1 elisitor oqsilini oddiy loviya (Phaseolus vulgaris L.) ga qo'llash yashil shaftoli shirasiga sezilarli va sezilarli darajada o'limga olib keladigan ta'sirga olib keladi. PeBC1 bilan davolash qilingan o'simliklar JA va SA [50] bilan bog'liq genlarning sezilarli darajada ko'tarilishini ko'rsatadi. Beauveria bassiana elimitatori PeBb1 tamakidagi M. persicae unumdorligini pasaytiradi va JA va ET bilan bog'liq genlarning ifodalanishini keltirib chiqaradi [51]. Ushbu tadqiqotda tamakidagi MaCFEM85 va MsWAK16 ning vaqtinchalik ifodasi JA reaktsiyasi bilan bog'liq bo'lgan COI1, MYC2 va PDF1.2 genlarini sezilarli darajada oshirdi (5b-rasm) va JA va umumiy flavonoid tarkibini oshirdi (5a-rasm), bu natijalar bilan solishtirish mumkin edi. adabiyotda yuqorida aytib o'tilganidek. Biroq, biz infiltratsiyadan 12 soat o'tgach tamaki tarkibida yuqori SA darajasini aniqlamadik va MsWAK16 yoki MaCFEM85+MsWAK16 vaqtincha ifodalovchi o'simliklar SA darajasining sezilarli darajada kamayganini va SA javobida ishtirok etadigan genlarning regulyatsiyasining pasayishini ko'rsatdi (5a,b-rasm). . Bu shuni ko'rsatdiki, turli xil o'simlik gormonlarini rag'batlantirish nafaqat sinergik faoliyatga, balki o'zaro bog'lanish va fikr-mulohazalarga ham olib kelishi mumkin, bu o'simliklarning turli ogohlantirishlarga mos ravishda javob berishiga imkon beradi. Ilgari o'simliklarda JA darajasining ortishi, ammo past SA darajalari haqida xabar berilgan. Masalan, SA to'planishi uchun nuqsonli bo'lgan A. thalianada JA darajasi yovvoyi turdagi A. thalianaga qaraganda 25- barobar yuqori bo'lgan va JA ga javob beruvchi genlar faollashgan [52]. Shuningdek, ba'zi bakteriyalar SA ning to'planishini inhibe qilish uchun o'simliklardagi JA darajasini oshirishi va SA tomonidan etkazilgan zarardan qochishi mumkinligi haqida xabar berilgan. Masalan, Pseudomonas syringae COI1 retseptorini JA yo'lini salbiy tartibga soluvchi toksin, koronatin orqali nishonga oladi [53]. Bu ANAC019, ANAC055 va ANAC072 [54] transkripsiya omillarining MYC2-induktsiyasini kuchaytiradi, ICS1 (SA sintezi uchun asosiy gen) transkripsiyasini inhibe qiladi va shu bilan SA ishlab chiqarish va signal uzatilishini pasaytiradi. Ushbu tadqiqotda MaCFEM85 va MsWAK16 o'rtasidagi o'zaro ta'sir JA to'planishi va JA-ga javob beruvchi genlarning yuqori regulyatsiyasiga olib keldi, ammo SA to'planishi va SA bilan bog'liq genlarning transkripsiyasini inhibe qildi. Bu shuni ko'rsatdiki, MaCFEM85 va MsWAK16 o'rtasidagi o'zaro ta'sir JA ni keltirib chiqardi va shu bilan o'simliklarning shira qarshiligini yaxshilaydi.
MaCFEM85 va MsWAK16 ni vaqtincha ifodalovchi N. benthamianada JA darajalari ortdi va B. cinerea lezyonlarining o'lchamlari kamaydi (4b-rasm), avvalgi tadqiqotlarga mos keladi. JA o'simliklarning hasharotlar va nekrotrof patogenlarga chidamliligida ishtirok etadi [52,55]. Nekrotrofik patogen sifatida B. cinerea JA va ET to'planishi [56] tomonidan inhibe qilingan. A. thaliana ET yetishmaydigan mutant ein2-1 va JA-javob mutant koi1-1da quyi oqim mudofaa geni, PDF1.2 darajasi sezilarli darajada pasaygan va B. cinerea ga sezgirlik kuchaygan [ 57]. Biz bu erda JA to'planishi va JA bilan bog'liq genlarning transkripsiyasi N. benthamianada vaqtinchalik MaCFEM85 va MsWAK16 ni ifodalovchi sezilarli darajada oshganligini, SA ning to'planishi va SA bilan bog'liq genlarning transkripsiyasi inhibe qilinganligini aniqladik. MaCFEM85 va MsWAK16 ifodasi ham B. cinerea ga inhibitiv ta'sir ko'rsatdi. Bu JA ning MaCFEM85 va MsWAK16 tomonidan faollashtirilganligini va o'simliklarning B. cinerea ga chidamliligida etakchi rol o'ynaganligini ko'rsatdi.
4. Materiallar va usullar
4.1. Zamburug'li shtammlar, o'simlik materiallari va etishtirish usullari
Metarhizium anisopliae izolyatori Ma 9 shtammlari kartoshka-shakar-agar (PSA) muhitida (suvda qaynatilgan 200 g tozalangan kartoshka ekstrakti, 20 g saxaroza va 15 g agar/L) yetishtirildi. Yangi sporangium kukuni 10 kundan keyin yig'ilgan. Nicotiana benthamiana o'simliklari 14/10 soat yorug'lik / qorong'u tsikli (27/25 ◦C) bilan sun'iy iqlim kamerasida o'stirildi. Agrobacterium vositachiligidagi transformatsiya orqali vaqtinchalik gen ifodasi uchun Agrobacterium tumefaciens GV3101 shtammi Luria Broth (LB) muhitida (10 g tripton, 5 g xamirturush ekstrakti va 10 g NaCl/L) yetishtirildi. Oltin xamirturush shtammi (OE Biotech Co., Ltd., Shanxay, Xitoy) xamirturush ekstrakti pepton dekstrozi (YPDA) muhitida (10 g xamirturush ekstrakti, 20 g pepton, 20 g glyukoza va 0,03 g adenin gemisulfat/L) yetishtirildi. Har bir vektor va shtamm uchun tegishli antibiotiklar, ya'ni rifampin, kanamitsin yoki ampitsillin (mos ravishda 25, 50 yoki 50 mkg/ml) ishlatilgan. Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan shtammlar va plazmidlar S1 qo'shimcha jadvalida keltirilgan. Medicago sativa urug'lari 1 daqiqa davomida 75% etanol bilan, so'ngra 50% NaClO (5,5%) bilan 15 daqiqa davomida sterilizatsiya qilindi. Urug'lar yaxshilab aralashtiriladi va keyin har biri 5 daqiqa davomida uch marta steril suvda yuviladi. Urug'lar qorong'i joyda 24 soat davomida 4 ° C da inkubatsiya qilindi, so'ngra xona haroratida 1% suvli agar plastinkalarida bir kechada unib chiqdi. Niholdan uch kun o'tgach, rivojlanayotgan ko'chatlar filtr qog'oziga 9- sm steril petri idishlariga o'tkazildi, har bir idishda 20 ta ko'chat bor. Muolajalar va nazorat mos ravishda har biriga 15 ta idishga ajratildi. Keyin ko'chatlar 10 ml M. anisopliae spora suspenziyasi 107 / ml ni o'z ichiga olgan holda sug'orildi va nazorat 10 ml steril suv bilan sug'orildi. 0, 12, 24, 48 va 60 soatlarda har bir vaqt oralig'i uchun uchta petri idishidan ko'chatlarning tasodifiy tanlovi olindi. Namunalar suyuq azotda muzlatilgan va -80 ◦C da saqlangan.
4.2. qRT-PCR va plazmid konstruktsiyasi
Jami RNK M. anisopliae (hyphae) va M. sativa (ildiz) dan TRIzol reagenti (Invitrogen, CA, AQSH) bilan ishlab chiqaruvchining koʻrsatmalariga rioya qilgan holda olindi. Olingan RNKning sifati va ko'pligi NanoPhotometer® (Implen, Myunxen, Germaniya) bilan o'lchandi. Birinchi zanjirli cDNK sintezi (2ug RNK gacha) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga rioya qilgan holda 5 × All-In-One RT Master Mix (Applied Biological Materials Inc., Vancouver, BC, Kanada) yordamida amalga oshirildi. qRT-PCR US EVER BRIGHT ® INC kompaniyasining 2×SYBR Green qPCR Master Mix va ABI QuantStudio 5 tizimi yordamida ishlab chiqaruvchi ko‘rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi. Har bir gen uchun ishlatiladigan primerlar S2 qo'shimcha jadvalida keltirilgan. Maury [58], Msactin [59] va Nbactin [60] ifoda ma'lumotlarini normallashtirish uchun ichki mos yozuvlar genlari sifatida ishlatilgan. Reaksiya quyidagi sharoitlarda amalga oshirildi: 95 ◦C da 5 minut, keyin 95 ◦C da 15 s va 60 ◦C da 40 s davomida 40 tsikl. Har bir namuna uchun uchta texnik nusxa mavjud edi. Nisbiy ifoda 2−∆∆Ct usuli yordamida hisoblangan [61]. Statistik ahamiyatlilik bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) va SPSS v20.0 (SPSS) da Dunkanning ko'p diapazonli testi yordamida aniqlandi.
4.3. N. benthamianada oqsillarning vaqtinchalik ifodasi
MaCFEM85 kodlash ketma-ketligi (CDS) shablon sifatida cDNA yordamida ultra ishonchli DNK polimeraza bilan kuchaytirildi. Hujayra osti lokalizatsiya tahlillari uchun MaCFEM85 uchun CDS ni o'z ichiga olgan PCR mahsulotlari mos ravishda pYBA{3}}eGFP (EcoRI va SalI bilan hazm qilingan) va pcambia1300-gilosiga (EcoRI va SacI) klonlangan. Barcha konstruktsiyalar ketma-ketlik bilan tasdiqlangan (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Pekin, Xitoy). Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan primerlar S2 qo'shimcha jadvalida keltirilgan. N. benthamianada MaCFEM85-eGFP va MaCFEM85-mCherryning vaqtinchalik ifodasi uchun A. tumefaciens shtammi GV3101 har bir plazmid bilan oʻzgartirildi va PCR bilan tekshirildi. Agrobakteriya bir kechada 28 ◦C da chayqalgan holda ekilgan. Hujayralar xona haroratida 5 min 5000 rpm santrifüj orqali yig'ildi, steril ikki marta distillangan suv bilan uch marta yuvildi va 10 mM MgCl2 tamponida (10 mM MES va 10 mM atsetosiringon, pH 5.7 o'z ichiga olgan) qayta suspenziya qilindi. Hujayra suspenziyasi OD600 0,5 ga o‘rnatildi, so‘ngra 1-ml shprits bilan 4- haftalik N. benthamiana barglarining pastki qismiga 5- infiltratsiya qilindi. Har bir barg 50 µL A. tumefaciens bilan infiltrlangan; har bir o'simlikka uchta barg ishlov berildi va har bir davolash guruhida uchta o'simlik bor edi. Davolangan barglar 30 soatdan keyin to'plangan va sub-hujayra lokalizatsiyasini aniqlash uchun Zeiss LSM980 konfokal mikroskopi (Karl Zeiss, Germaniya) bilan ko'rsatilgan.
Cistanche erkaklar uchun foydalari-immun tizimini mustahkamlaydi
4.4. Filogenetik tahlil
Filogenetik daraxt MEGA X-da qo'shni-qo'shilish usuli yordamida qurilgan. Daraxtni yaratish uchun ishlatiladigan aminokislotalar ketma-ketligi tegishli zamburug'larning NCBI ma'lumotlar bazasiga (masalan, Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumbroocladiume, Laspergillus fumrocladiume) qarshi BLASTP qidiruvi orqali olingan. , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana va Paecilomyces lilacinus) so'rov sifatida MaCFEM85 dan foydalanadi.
4.5. Ikki gibrid xamirturush tahlillari
Matchmaker Gold xamirturush ikki gibrid tizimi (Clontech Laboratories, Inc.; hozir Takara Bio USA, Inc.) MaCFEM85 va MsWAK16 o'rtasidagi o'zaro ta'sirni tekshirish uchun ishlatilgan. Signal peptidsiz MaCFEM85 o'lja sifatida pGBKT7 ga kiritildi va MsWAK16 ning hujayradan tashqari domeni (MsWAK{6}}ED) pGADT7 ga o'lja sifatida kiritildi. Xamirturushga mos hujayra tayyorlash va transformatsiyalar Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™ (ZYMO Research, CA, AQSH) yordamida ishlab chiqaruvchining koʻrsatmalariga muvofiq amalga oshirildi. O'lja va o'lja plazmidlari oltin xamirturush shtammiga birgalikda aylantirildi. Protein-oqsil o'zaro ta'siri SD ikki marta tashlab ketuvchi vosita (DDO, SD/-Trp-Leu) va SD to'rt marta tashlab ketuvchi vosita (QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade) plitalaridagi o'sish asosida tahlil qilindi.
4.6. BiFC tahlili
BiFC konstruksiyalarini yaratish uchun pUC-SPYNE va pUC-SPYCE vektorlari BamHI bilan hazm qilish yo'li bilan chiziqlilashtirildi. MaCFEM85 va MsWAK16 ning to‘liq uzunlikdagi CDS-larining har biri klonlandi va MaCFEM85-YFPN va MsWAK16-YFPC konstruksiyalarini olish uchun rekombinant ferment yordamida linearlashtirilgan plazmidlarga kiritildi. MaCFEM85 va MsWAK16 o'z ichiga olgan plazmidlar bo'sh vektorlar bilan manfiy boshqaruv sifatida o'zgartirildi (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE va pUC-SPYNE + pUC-SPYCE) . Barcha vektorlar N. benthamiana ga yuqorida aytib o'tilganidek, Agrobacterium vositachiligidagi transformatsiya orqali kiritilgan. Zeiss LSM980 konfokal mikroskopi (Karl Zeiss, Germaniya) yordamida barg epidermal hujayralarida floresans signallari kuzatildi. Vektor qurilishi uchun ishlatiladigan primerlar S2 qo'shimcha jadvalida keltirilgan.
4.7. GST pastga tushirish tahlili
GST ochiladigan tahlillari uchun MsWAK16-ED pGEX-6P-2 vektoriga, MaCFEM85 esa pET-21bga kiritildi. Tozalangan termoyadroviy oqsillar (GST- MsWAK16- ED) va pGEX-6P-2 yuksiz protein (GST) yem oqsili va tozalangan pET-21 sifatida ishlatilgan. O'lja sifatida b-MaCFEM85 termoyadroviy oqsili (His-MaCFEM85) ishlatilgan. Mag-Beads GST Fusion oqsillarni tozalash tizimi (Sangon Biotech, Shanxay, Xitoy) bilan ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga rioya qilgan holda GST tushirish tahlillari amalga oshirildi. Qisqacha aytganda, Mag-Beads alkogol himoyachisini chiqarish uchun 1 × fosfat-buferli tuz (PBS, pH 7.4) bilan besh marta yuvildi va keyin 10 ml GST yoki GST-MsWAK16-ED qo'shildi. Boncuklar xona haroratida 30 daqiqa davomida inversiya bilan aralashtiriladi. Supernatantni olib tashlangandan so'ng, Mag-Beads 1 × PBS bilan besh marta yuvildi. His-MaCFEM85 allaqachon GST bilan bog'langan Mag-Beadsga qo'shildi va aralash aylanish bilan 4 ◦C da bir kechada inkubatsiya qilindi. Keyin boncuklar bog'lanmagan oqsillarni olib tashlash uchun 1 × PBS bilan besh marta yuvildi. Keyinchalik, boncuklar ustida immobilizatsiya qilingan oqsillar SDS-PAGE orqali ajratildi, nitroselüloz membranasiga (100 V, 1 soat) o'tkazildi va Western blot orqali tahlil qilindi. Membranalar har biri PBS + Tween (PBST) bilan 10 daqiqa davomida uch marta yuvildi. Membranalar xona haroratida 5% yog‘sizlangan sut bilan 2 soat davomida bloklandi, so‘ngra ProteinFind anti-His sichqonchasi monoklonal antikori (TransGen Biotech, Pekin, Xitoy) (1:3000 suyultirilgan) yoki ProteinFind anti-GST sichqoncha monoklonal antikori bilan 2 soat davomida inkubatsiya qilindi. h 4 ◦C da. Keyin membranalar ProteinFind echki quyonga qarshi IgG(H+L) (HRP) antikoriga (TransGen Biotech, Pekin, Xitoy) (1:5000 suyultirilgan) xona haroratida 1 soat davomida botirildi. Membranalar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga binoan EasySee® Western Blot Kit (TransGen Biotech, Pekin, Xitoy) yordamida vizualizatsiya qilingan.
4.8. MaCFEM85 da asosiy saytni aniqlash
MaCFEM85 ning MsWAK16 bilan o'zaro ta'siri uchun zarur bo'lgan hajmni aniqlash uchun MaCFEM85 ning bir nechta kesilgan shakllarini yaratish uchun PCR kuchaytirilishi amalga oshirildi. Vektorga CFEM domeni (MaCFEM85-CFEM; aa qoldiqlari 19–86) va CFEM domenisiz C terminali (MaCFEM85-C, aa qoldiqlari 87–170) kiritildi. pGBKT7 o'lja oqsili sifatida (qo'shimcha jadval S1). 26, 30, 43, 52 va 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆4) pozitsiyalarida sisteinni alaninga mutatsiyalash uchun polipeptid sintezi yordamida yana beshta variant yaratilgan. CFEM8552 va ∆CFEM858 mos ravishda). Bu variantlar MsWAK16-ED bilan Y2H tajribalarini bajarish uchun ishlatilgan. O'zgartirilgan xamirturush hujayralari sintetik tushib qolgan SD/- Trp-Leu plitalari va X- -Galaktozidaza (X- -Gal) ni o'z ichiga olgan SD/-Trp-Leu-His-Ade plitalarida o'sish uchun tekshirildi.
4.9. O'simliklarga qarshilik tahlillari
Myzus persicae Henan Quanying Biological Co., Ltd kompaniyasidan olingan. Bioassaylar boshlanishidan bir hafta oldin, 150 ta katta yoshli shira uchta N. benthamiana o'simliklariga (har bir o'simlik uchun 50 shira) joylashtirildi. 72 soatdan so'ng, barcha kattalar yumshoq rassom cho'tkasi bilan olib tashlandi va nimfalarga N. benthamianaga shira ishlashini tahlil qilish uchun ko'chirilgunga qadar qo'shimcha to'rt kun ovqatlanishga ruxsat berildi.
4.10. Aphid ishlash tahlillari
Nikotiana bentamiana Domin. (Solanales: Solanaceae) M. persicae samaradorligini, B. cinerea ga qarshi o'simlik kasalliklariga chidamliligini va gormon bilan bog'liq genlarning ifodasini baholash uchun ishlatilgan. pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16 yoki pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16 tashuvchi agrobakteriyalar 28 ◦C da 36 soat davomida tegishli antibiotiklar bilan toʻldirilgan LBda yetishtirildi. Hujayralar uch marta yuvildi, so'ngra infiltratsiya tamponida (1{19}} mM MgCl2, 10 mM MES va 100 mkM atsetosiringon, pH 5,6) OD600 0,6 ga qayta suspenziya qilindi. Birgalikda infektsiya uchun MaCFEM85 va MsWAK16 ni tashuvchi bakteriyalar OD600 1,2 ga o'rnatildi va keyin teng hajmlarda aralashtirildi. Toʻliq kengaygan barglar 1-ml ignasiz shpritslar yordamida bakteriyalar bilan infiltrlangan. Har bir o'simlikda uchta barg infiltratsiya qilindi va har bir davolash uchta o'simlikka jami 12 ta o'simlik uchun qo'llanildi.
Shira samaradorligini tahlil qilish uchun Agrobacterium qo'llanilgandan 12 soat o'tgach, har bir bargning infiltratsiyalangan maydoniga 20 ta katta yoshli shira qo'llanildi. Shira 5 mm diametrli qisqichlar yordamida cheklangan. Har bir davolash besh marta takrorlanadi. Katta yoshli shira o'limi va yangi qo'yilgan nimfalar soni uch kun davomida har kuni qayd etilgan. B. cinerea PDAYda besh kun davomida yetishtirildi. Agrobacterium infiltratsiyasidan 12 soat o'tgach, yangi o'stirilgan B. cinerea 5- mm li qo'ziqorin kekiga teshildi va miselyum o'sishi yuzasi barg yuzasida infiltratsiya maydoniga biriktirildi. Kasallikning rivojlanishini engillashtirish uchun o'simliklar kasallikning rivojlanishini osonlashtirish uchun ularni 22 ° C haroratda tovoqlar ichida plastik plyonka bilan yopgan holda namlangan. 48 soatdan keyin emlangan barglarda lezyon o'lchamlarini o'lchash orqali kasallikning rivojlanishi baholandi. Tegishli genlarning nisbiy ifodasini aniqlash uchun infiltratsiyadan 12 soat o'tgach, har bir o'simlikdan uchta infiltratsiyalangan barg to'plangan, keyin suyuq azotda muzlatilgan va -80 darajada saqlanadi. Jami RNK ekstraktsiyasi, cDNK sintezi va qRT-PCR 3.2-bo'limda tasvirlanganidek amalga oshirildi. Salitsil kislotasi (SA), yasmonik kislota (JA) va flavonoid darajalari har bir davolash uchun filtrlangan 15 N. benthamiana barglarida o'lchandi. Barglar yig'ilib, suyuq azotda muzlatilgan, so'ngra -80 daraja haroratda saqlanadi. O'simlik gormonlari miqdori o'simlik salitsiklik kislotasi va o'simlik jasmonik kislotasi ELISA to'plamlari (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.) va flavonoidlar miqdori Micro Plant Flavonoids Assay Kit (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) yordamida aniqlandi. ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalari.
4.11. Statistik tahlil
Ma'lumotlar SPSS v20 da tahlil qilindi.0. MaCFEM85 va MsWAK16 ifoda darajalaridagi sezilarli farqlar Student t-testi yordamida aniqlandi. SA, JA va flavonoid darajalaridagi sezilarli farqlar bir tomonlama ANOVA va Duncanning ko'p diapazonli testi yordamida p <0,05 chegarasi bilan aniqlandi.
5. Xulosalar
Ushbu tadqiqotda biz M. anisopliae da yangi ajratilgan MaCFEM85 oqsilini aniqladik va tavsifladik. MsWAK16 bilan o'zaro ta'sir qilishi va N. benthamiana mudofaa reaktsiyasini faollashtirishi mumkin bo'lgan konservatsiyalangan effektor ekanligi aniqlandi. Biz CFEM domeni va MaCFEM85-dagi 52-pozitsiyadagi sistein qoldig'i o'zaro ta'sir qilish uchun juda muhim ekanligini ko'rsatdik. Ushbu o'zaro ta'sir o'simlikdagi JA bilan bog'liq immun javoblarni va kasalliklarga chidamli va hasharotlarga chidamli mexanizmlarni faollashtirishi mumkin.
Ma'lumotnomalar
1. Paulucci, NS; Anta, GG; Gallarato, LA; Vikario, JK; Sezari, AB; Reguera, YB; Kilmurrey, C.; Bueno, MA; Garsiya, MB; Dardanelli, MS Plant-mikrob hamkorligi: o'sish va o'simliklar salomatligiga ta'siri. O'simlik mikroblari simbiozida: asoslar va yutuqlar; Springer: Berlin/Heidelberg, Germaniya, 2013; 105–117-betlar. [CrossRef]
2. Schenk, PM; Carvalhais, LC; Kazan, K. O'simlik-mikrob o'zaro ta'sirini ochish: Ko'p turli transkriptomika yordam bera oladimi? Trends Biotexnol. 2012, 30, 177–184. [CrossRef]
3. Sasse, J.; Martinoia, E.; Northen, T. Do'stlaringizni ovqatlantiring: o'simlik ekssudati ildiz mikrobiomini shakllantiradimi? Trends O'simlik Sci. 2018, 23, 25–41. [CrossRef]
4. Lugtenberg, B.; Komilova, F. O‘simliklarning o‘sishiga yordam beruvchi rizobakteriyalar. Annu. Rev. Mikrobiol. 2009, 63, 541–556. [CrossRef]
5. Shoresh, M.; Harman, GE; Mastouri, F. Qo'ziqorin biocontrol agentlariga tizimli qarshilik va o'simlik reaktsiyalarini keltirib chiqardi. Annu. Rev. Fitopatol. 2010, 48, 21–43. [CrossRef]
6. van de Mortel, JE; de Vos, RC; Dekkers, E.; Pineda, A.; Guillod, L.; Bouwmeester, KJ; van Loon, J.; Dik, M.; Raaijmakers, JM. Arabidopsisda Pseudomonas fluorescens SS101 rizobakteriyasi tomonidan qo'zg'atilgan metabolik va transkriptomik o'zgarishlar. O'simlik fizioli. 2012, 160, 2173–2188. [CrossRef]
7. Larin, A.; Burton, F.; Schafer, P. Ildiz mikrobiomlarini shakllantirishda o'simlik ildiz-mikrobi aloqasi. O'simlik Mol. Biol. 2016, 90, 575–587. [CrossRef]
8. Sasan, RK; Bidochka, MJ Metarhizium Roberts (Clavicipitaceae) hasharot-patogen qo'ziqorin ham o'simlik ildizining rivojlanishini rag'batlantiradigan endofitdir. Am. J. Bot. 2012, 99, 101–107. [CrossRef]
9. Sasan, RK; Bidochka, MJ Endofitik hasharotlar patogen qo'ziqorin Metarhizium robertsii loviya o'simlik patogen Fusarium solanif qarshi antagonizmi. sp. fazaoli. mumkin. J. Plant Patol. 2013, 35, 288–293. [CrossRef]
10. Ahmad, I.; Ximénez-Gasco, MdM; Lyute, DS; Shakeel, SN; Barbercheck, ME Endophytic Metarhizium robertsii makkajo'xori o'sishini rag'batlantiradi, hasharotlar o'sishini bostiradi va o'simlik himoyasi geni ifodasini o'zgartiradi. Biol. Nazorat 2020, 144, 104167. [CrossRef]
11. Chairin, T.; Petcharat, V. Metarhizium guizhouense tomonidan meva chirishi qo'ziqorinlariga qarshi Gonkong mevasida (Aglaia dookkoo Griff.) mudofaa reaktsiyalarining induktsiyasi. Biol. Nazorat 2017, 111, 40–44. [CrossRef]
12. Xao, K.; Vang, F.; Nong, X.; MakNeill, MR; Liu, S.; Vang, G.; Cao, G.; Zhang, Z. Peanut Arachis hypogaea ildizlarining transkriptom tahlili bilan foydali va patogen zamburug'lar mavjudligiga javobi. Sci. Rep. 2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]
13. Patel, zm; Maxapatra, R.; Jamla, SSM-bobda o'simliklarni himoya qilish mexanizmida qo'ziqorinli qirg'inlardagi roli. O'simlik o'simliklarning qishloq xo'jaligidagi foydali mikrolilarning molekulyar jihatlarida; Sharma, V., Salva, R., Ani, L., ERI; Akademik matbuot: Kembrij, MA, USA, 2020; HP. 143-158. [CrossRef]
14. Dong, X.; Sa, JA Etilen va o'simliklarning kasalliklarga chidamliligi. Curr. Fikr. Biol o'simlik. 1998, 1, 316–323. [CrossRef] [PubMed]
15. Tomma, BP; Eggermont, K.; Penninckx, IA; Mauch-Mani, B.; Vogelsang, R.; Cammue, BP; Broekaert, WF Arabidopsisdagi alohida jasmonatga bog'liq va salitsilatga bog'liq bo'lgan mudofaa-javob yo'llari turli mikrobial patogenlarga qarshilik ko'rsatish uchun zarurdir. Proc. Natl. akad. Sci. AQSh 1998, 95, 15107–15111. [CrossRef] [PubMed]
16. Shim, SR; Irigoyen, S.; Liu, J.; Bedre, R.; Kristensen, SA; Schmelz, EA; Sedbruk, JK; Scholthof, K.-BG; Mandadi, KK Brachypodium Phenylalanin ammiak lyase (PAL) Panicum mozaik virusi va uning sun'iy yo'ldoshlariga qarshi virusga qarshi himoyani kuchaytiradi. mBio 2021, 12, e03518-20. [CrossRef]
17. Liu, R.; Xu, S.; Li, J.; Xu, Y.; Lin, Z. Astragalus membranaceus varidan olingan PAL genining ifoda profili. Mongolikus va uning flavonoid biosinteziga o'tishidagi hal qiluvchi roli. O'simlik hujayrasi vakili 2006, 25, 705-710. [CrossRef]
18. De Geyter, N.; Gʻolomiy, A.; Goormachtig, S.; Goossens, A. Yasmonatdan olingan o'simlikning ikkilamchi metabolizmidagi transkripsiya mexanizmlari. Trends O'simlik Sci. 2012, 17, 349–359. [CrossRef]
19. Mirjalili, N.; Linden, JC Gaz fazasi tarkibi Taxus cuspidata suspenziya madaniyatiga ta'sir qiladi. Biotexnologiya. Bioeng. 1995, 48, 123–132. [CrossRef]
20. Li, ST; Chjan, P.; Chjan, M.; Fu, CH; Chjao, CF; Dong, YS; Guo, AY; Yu, LJ Metil jasmonatga javoban taxus chinensis hujayralarining transkripsiyaviy profili. BMC Genom. 2012, 13, 295. [CrossRef]
21. Tugizimana, F.; Ncube, EN; Steenkamp, Pensilvanya; Dubery, IA Metabolomics tomonidan Centella asiatica hujayralarida metil jasmonat tomonidan terpenoid sintezini manipulyatsiya qilish bo'yicha tushunchalar. O'simlik biotexnologiyasi. Rep. 2015, 9, 125–136. [CrossRef]
22. Lu, M.; Vong, X.; Teng, W. Panax ginseng hujayra madaniyatida saponin ishlab chiqarishga ta'siri. O'simlik hujayralari vakili 2001, 20, 674-677. [CrossRef]
23. Mandal, S.; Kar, I.; Mukerji, AK; Acharya, P. Solanum lycopersicumda Ralstonia solanacearumga qarshi Elicitor tomonidan qo'zg'atilgan mudofaa javoblari. Sci. Jahon J. 2013, 25, 561056. [CrossRef]
24. Li, L.; Vang, S.; Yang, X.; Frensis F.; Qiu, D. Protein elimitori PeaT1 bug'doyda aphidga (Sitobion avenae) qarshi chidamliligini oshirdi. Zararkunandalarni boshqarish. Sci. 2020, 76, 236–243. [CrossRef] [PubMed]
25. Bujalovski, V. Heksamerik DnaB helikazining fiziologik rolini kengaytirish. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 116–118. [CrossRef]
26. Vaknin, Y.; Shadkchan, Y.; Levdanskiy, E.; Morozov, M.; Romano, J.; Osherov, N. Uchta Aspergillus fumigatus CFEM-domenli GPI-ankorli oqsillar (CfmA-C) hujayra devorining barqarorligiga ta'sir qiladi, ammo qo'ziqorin virulentligida rol o'ynamaydi. Qo'ziqorin. Genet. Biol. 2014, 63, 55–64. [CrossRef]
27. Chjao, S.; Shang, X.; Bi, V.; Yu, X.; Liu, D.; Kang, Z.; Vang, X.; Vang, X. Genom-Wide Bug'doy bargining zang qo'ziqorini Puccinia triticinadan konservalangan naqshli effektor nomzodlarini aniqlash. Old. Mikrobiol. 2020, 11, 1188. [CrossRef]
28. Gong, A.; Jing, Z.; Chjan K.; Tan, Q.; Vang, G.; Liu, W. Makkajo'xori antraknoz qo'ziqorini Colletotrichum graminicola tarkibidagi CFEM oqsillarining bioinformatik tahlili va funktsional tavsifi. J. Integr. Agri. 2020, 19, 541–550. [CrossRef]
29. Martin, F.; Aerts, A.; Ahren, D.; Brun, A.; Danchin, EG; Duxaussoy, F.; Gibon, J.; Kohler, A.; Lindquist, E.; Pereda, V.; va boshqalar. Laccaria bicolor genomi mikorizal simbioz haqida tushuncha beradi. Tabiat 2008, 452, 88–92. [CrossRef]
30. Stefan, V.; Lara, RJ Entomopatogen zamburug'lar endofitlar sifatida: o'simlik-endofit-o'txo'r o'zaro ta'siri va biologik nazoratda foydalanish istiqbollari. Curr. Sci. 2015, 109, 46–54.
31. Cai, N.; Liu, R.; Yan, D.; Chjan, N.; Ju, K.; Chjan D.; Nong, X.; Tu, X.; Chjan, Z.; Vang, G. Metarhizium anisopliae ning CFEM oqsillarini bioinformatika tahlili va funktsional tavsifi. J. Zamburug'lar. 2022, 8, 661. [CrossRef]
32. Stivens, C.; Hammond-Kosak, KE; va Kanyuka, K. WAKsing o'simlik immuniteti, zaiflashayotgan kasalliklar. J. Exp. Bot 2022, 73, 22–37. [CrossRef]
33. Chjan, ZN; Wu, QY; Chjan, GZ; Chju, YY; Merfi, RV; Liu, Z.; Zou, CG Tizimli tahlillar qo'ziqorinlarda CFEM domenining o'ziga xosligi va kelib chiqishini ochib beradi. Sci. Rep. 2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]
34. Fang, A.; Gao, X.; Chjan, N.; Chjen, X.; Qiu, S.; Li, Y.; Chjou, S.; Cui, F.; Sun, W. SCRE2 yangi effektor geni Ustilaginoidea virensning sholida to'liq virulentligiga hissa qo'shadi. Old. Mikrobiol. 2019, 10, 845. [CrossRef] [PubMed]
35. Chju, V.; Vey, V.; Vu, Y.; Chjou, Y.; Peng, F.; Chjan, S.; Chen, P.; Xu, X. BcCFEM1, taxminiy GPI bilan bog'langan CFEM domenini o'z ichiga olgan protein, Botrytis cinerea'da patogenlik, konidial ishlab chiqarish va stressga chidamlilikda ishtirok etadi. Old. Mikrobiol. 2017, 8, 1807. [CrossRef]
36. Xu, X.; Li, G.; Li, L.; Su, Z.; Chen, C. Pezizomycotina ga tegishli zamburug'lardagi taxminiy Pth11-bog'langan G oqsili bilan bog'langan retseptorlarining genom bo'yicha qiyosiy tahlili. BMC mikrobiol. 2017, 17, 166. [CrossRef] [PubMed]
37. Peng, YJ; Xou, J.; Chjan, X.; Lei, JH; Lin, HY; Ding, JL; Feng, MG; Ying, SH Proteinlarni o'z ichiga olgan CFEM domenining temirni olish uchun tizimli hissasi filamentli patogen qo'ziqorin Beauveria bassiana ning turlararo o'zaro ta'siri uchun juda muhimdir. Atrof-muhit. Mikrobiol. 2022, 24, 3693–3704. [CrossRef] [PubMed]
38. Roy, U.; Kornitzer, D. Qo'ziqorinlarda geme-temirni olish. Curr. Fikr. Mikrobiol. 2019, 52, 77–83. [CrossRef] [PubMed]
39. Okamoto-Shibayama, K.; Kikuchi, Y.; Kokubu, E.; Sato, Y.; Ishihara, K. Csa2, Rbt5 oqsillari oilasining a'zosi, Candida albicans gifal o'sishi paytida inson gemoglobinidan temirni ishlatishda ishtirok etadi. FEMS xamirturush Res. 2014, 14, 674–677. [CrossRef]
40. Peres, A.; Pedros, B.; Murgui, A.; Kazanova, M.; Lopez-Ribot, JL; Martinez, JP Sakkiz sistein o'z ichiga olgan CFEM domenini ko'rsatadigan qo'ziqorin oqsillarini kodlovchi genlar uchun Candida albicans mutantlari tomonidan biofilm shakllanishi. FEMS xamirturush Res. 2006, 6, 1074–1084. [CrossRef]
41. Hogg, PJ Protein funktsiyasi uchun kalit sifatida disulfid aloqalari. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 210–214. [CrossRef]
42. Van Den Burg, HA; Vesterink, N.; Francoijs, KJ; Rot, R.; Voestenenk, E.; Boeren, S.; de Wit, PJ; Joosten, MH; Vervoort, J. Cladosporium fulvum pomidor patogenining AVR4 ning tabiiy disulfid bog'lanishi bilan buzilgan mutantlari proteolizga sezgir, Cf{3}}vositachilik qarshiligini chetlab o'tadi, lekin xitin bilan bog'lanish qobiliyatini saqlab qoladi. J. Biol. Kimyo. 2003, 278, 27340–27346. [CrossRef] 43. Xu, K.; Kao, J.; Chjan, J.; Sya, F.; Ke, Y.; Chjan, X.; Xie, V.; Liu, X.; Cui, Y.; Kao, Y.; va boshqalar. Hujayra devorini mustahkamlash orqali kasalliklarga chidamlilik geni tomonidan bir nechta agrotexnik xususiyatlarni yaxshilash. Nat. O'simliklar 2017, 3, 17009. [CrossRef] [PubMed]
44. Saytoh, X.; Fujisava, S.; Mitsuoka, C.; Ito, A.; Xirabuchi, A.; Ikeda, K.; Irieda, X.; Yoshino, K.; Yoshida, K.; Matsumura, X.; va boshqalar. Magnaporthe oryzae-da keng miqyosli gen buzilishi monokot va dikotli qo'ziqorin patogenlari tomonidan infektsiya uchun zarur bo'lgan MC69 ni aniqlaydi. PLoS patogi. 2012, 8, e1002711. [CrossRef] [PubMed]
45. Kulkarni, RD; Kelkar, HS; Dekan, R. Sakkiz sistein o'z ichiga olgan CFEM domeni qo'ziqorin membranasi oqsillari guruhiga xosdir. Trends Biochem. Sci. 2013, 28, 118–121. [CrossRef] [PubMed]
46. Peng, J.; Vu, L.; Chjan V.; Chjan Q.; Xing, Q.; Vang, X.; Li, X.; Yan, J. Lasiodiplodia theobromae-da qo'ziqorin hujayradan tashqari membrana oqsillarida keng tarqalgan tizimli identifikatsiya va funktsional tavsif. Old. O'simlik fanlari. 2021, 12, 804696. [CrossRef]
47. Bari, R.; Jons, JD O'simliklarning himoya reaktsiyalarida o'simlik gormonlarining roli. O'simlik Mol. Biol. 2009, 69, 473–488. [CrossRef]
48. Verma, V.; Ravindran, P.; Kumar, PP O'simlik gormoni yordamida stress reaktsiyalarini tartibga solish. BMC zavodi Biol. 2016, 16, 86. [CrossRef]
49. Javed, K.; Qiu, D. Brevibacillus laterosporusning PeBL1 oqsil elimitatori Pomidordagi Myzus persicae ga qarshi qarshilikni kuchaytiradi. Patogenlar 2020, 9, 57. [CrossRef]
50. Bosit, A.; Xanan, A.; Nazir, T.; Majid, MZ; Qiu, D. Botrytis cinerea dan olingan PeBC1 elisitatorining molekulyar va funksional xarakteristikasi oddiy loviyalarda (Phaseolus vulgaris L.) yashil shaftoli aphidiga (Myzus persicae) qarshi qarshilik ko'rsatishda ishtirok etadi. Hasharotlar 2019, 10, 35. [CrossRef]
51. Nazir, T.; Xanan, A.; Basit, A.; Majid, MZ; Anvar, T.; Navoz, I.; Qiu, D. Beauveria bassiana ARSEF 2860 dan olingan PeBb1 ning hali tavsiflanmagan oqsil elimitatorining taxminiy roli Brassica rapa ssp.dagi Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) ga qarshi shtamm. pekinensis. Patogenlar 2020, 9, 111. [CrossRef]
52. Spoel, SH; Koornneef, A.; Claessens, SM; Korzelius, JP; Van Pelt, JA; Myuller, MJ; Buchala, AJ; Metraux, JP; Braun, R.; Qozon, K.; va boshqalar. NPR1 sitozoldagi yangi funktsiya orqali salitsilat va jasmonatga bog'liq himoya yo'llari o'rtasidagi o'zaro suhbatni modulyatsiya qiladi. O'simlik hujayrasi 2003, 15, 760-770. [CrossRef]
53. Xin, XF; U, SY Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000: O'simliklardagi kasallik sezuvchanligi va gormon signalizatsiyasini tekshirish uchun namuna patogen. Annu. Rev. Fitopatol. 2013, 51, 473–498. [CrossRef] [PubMed]
54. Chjan, X.; Vang, C.; Chjan, Y.; Quyosh, Y.; Mou, Z. Arabidopsis vositachi kompleksi subunit16 salitsilat vositachiligida tizimli orttirilgan qarshilik va jasmonat/etilendan kelib chiqqan mudofaa yo'llarini ijobiy tartibga soladi. O'simlik hujayrasi 2012, 24, 4294–4309. [CrossRef] [PubMed]
55. Doares, SH; Narvaez-Vaskes, J.; Konkoni, A.; Rayan, CA Salitsil kislotasi sistemin va yasmonik kislota tomonidan qo'zg'atilgan pomidor barglarida proteinaz inhibitörlerinin sintezini inhibe qiladi. O'simlik fizioli. 1995, 108, 1741–1746 yillar. [CrossRef] [PubMed]
56. Piterse, CM; Leon-Reyes, A.; Van der Ent, S.; Van Wees, SC O'simlik immunitetida kichik molekulali gormonlar bilan tarmoq. Nat. Kimyo. Biol. 2009, 5, 308–316. [CrossRef]
57. Penninckx, IA; Tomma, BP; Buchala, A.; Métraux, JP; Broekaert, WF Arabidopsisda o'simlik defensin genini induktsiya qilish uchun jasmonat va etilen javob yo'llarining bir vaqtda faollashishi talab qilinadi. O'simlik hujayrasi 1998, 10, 2103–2113. [CrossRef]
58. Fang, V.; Bidochka, MJ. Metarhizium anisopliae da nihol, konidiogenez va patogenezda ishtirok etuvchi genlarning real vaqtda miqdoriy RT-PCR yordamida ifodalanishi. Mikol. Res. 2006, 110, 1165–1171. [CrossRef]
59. Gerriero, G.; Legay, S.; Hausman, JF Alfalfa Tsellyuloza sintaza genining abiotik stress ostida ifodalanishi: RT-qPCR normalizatsiyasi uchun avtostopchining qo'llanmasi. PLoS ONE 2014, 9, e103808. [CrossRef]
60. Yang, Y.; Chjan, Y.; Li, B.; Yang, X.; Dong, Y.; Qiu, D. A Verticillium dahliae pectate lyase o'simliklarning immun reaktsiyalarini keltirib chiqaradi va virulentlikka hissa qo'shadi. Old. O'simlik fanlari. 2018, 9, 1271. [CrossRef]
61. Livak, KJ; Schmittgen, TD Haqiqiy vaqtda miqdoriy PCR va 2 (-Delta Delta C (T)) usuli yordamida nisbiy gen ifodasi ma'lumotlarini tahlil qilish. Metodlar 2001, 25, 402–408. [CrossRef]