Tug'ma yurak kasalliklarida neyroproteksiyaning hozirgi holati 2-qism

Keyin mikroskopik tasvirlar ImageJ dasturidan (Milliy Sog'liqni saqlash institutlari, Bethesda, MD, AQSh) yordamida tasvirni hisoblashga duchor qilindi. Hsp60 signali "x" ga ko'paytirildi.

Hsp60 inson organizmida muhim biologik rol o'ynaydigan muhim protein molekulasidir. So'nggi yillarda olib borilgan tadqiqotlar Hsp60 mavjudligi inson xotirasi bilan chambarchas bog'liqligini ko'rsatdi.

Hsp60 molekulyar chaperon oqsili bo'lib, asosan oqsillarni katlama, ochish, barqarorlashtirish va parchalanishda ishtirok etadi. Bu jarayonlar normal metabolizm va inson tanasining hujayra faoliyati uchun juda muhimdir. Shu bilan birga, Hsp60 antioksidant, yallig'lanishga qarshi va immunomodulyatsion ta'sirga ega va inson salomatligi va immunitet tizimining muvozanatini saqlashda katta rol o'ynaydi.

Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Hsp60 xotirani shakllantirish va saqlashda hal qiluvchi rol o'ynaydi. O'rganish va xotira jarayonida miya hujayralari ko'p miqdordagi Hsp60 molekulalarini ishlab chiqaradi. Ushbu molekulalar o'rganish va xotiraning silliq rivojlanishini ta'minlash uchun hujayralarni tashqi muhitning aralashuvi va shikastlanishidan himoya qilishi mumkin. Bundan tashqari, Hsp60, shuningdek, miya hujayralarining signal uzatilishini va neyronlarning rivojlanishini o'zgartirib, inson fikrlash va xatti-harakatlariga ta'sir qilishi mumkin va idrok va stressga chidamliligiga ijobiy ta'sir ko'rsatadi.

Hsp60 ning roli inson tanasiga ijobiy ta'sir ko'rsatgan bo'lsa-da, odamlar Hsp60 ning ortiqcha va etishmasligi ham inson salomatligiga salbiy ta'sir ko'rsatishi mumkinligini tushunishlari kerak. Shuning uchun biz Hsp60 ning inson salomatligidagi o'rni va rolini yaxshiroq tushunish uchun inson tanasining turli fiziologik va patologik sharoitlarida Hsp60 mexanizmini faol ravishda o'rganishimiz va o'rganishimiz kerak. Ko'rinib turibdiki, biz xotirani yaxshilashimiz kerak va Cistanche deserticola xotirani sezilarli darajada yaxshilashi mumkin, chunki Cistanche deserticola antioksidant, yallig'lanishga qarshi va qarishga qarshi ta'sirga ega, bu miyadagi oksidlanish va yallig'lanish reaktsiyalarini kamaytirishga yordam beradi va shu bilan miyani himoya qiladi. asab tizimining salomatligi. Bundan tashqari, Cistanche deserticola asab hujayralarining o'sishi va tiklanishiga yordam beradi va shu bilan neyron tarmoqlarning ulanishi va funktsiyasini oshiradi. Ushbu ta'sirlar xotirani, o'rganish qobiliyatini va fikrlash tezligini yaxshilashga yordam beradi, shuningdek, kognitiv disfunktsiya va neyrodegenerativ kasalliklarning rivojlanishiga to'sqinlik qilishi mumkin.

Qisqa muddatli xotirani yaxshilash uchun "Bilish" tugmasini bosing

"X" qiymati quyidagicha aniqlandi: nazorat guruhidagi mitoxondriyal DNK signalidan "x" buklangan Hsp60 signalini ayirsak, mitoxondriyal DNK qiymati nolga teng yoki kamroq bo'ldi. Histon H2B signali "y" ga ko'paytirildi.

"y" qiymati quyidagicha aniqlandi: nazorat guruhidagi yadro-DNK signalidan "y" buklangan giston-H2B signalini ayirish yadro-DNK qiymatini nolga teng bo'lgandan past qildi. Agar ko'paytirish natijasida fon signali yuqori bo'lsa, ko'paytirilgan tasvirning kontrastini barcha namunalardagi bir xil sharoitlarga moslashtirish mumkin.

Keyingi tahlil uchun dsDNKning bo'yalishi tasviri, ko'paytirilgan Hsp60 va giston H2B ning sozlangan tasviridan foydalanildi. “Adjust-threshold” funksiyasidan foydalanib, bu tasvirlar binarlashtirildi. Biz 2 dan 20 mkm2 gacha bo'lgan o'lchamdagi dsDNK nuqtalarini tanladik (doiraviylik 0,1–1,0) va ular "zarrachalarni tahlil qilish-tahlil qilish" funksiyasi yordamida hisoblandi.

2.3. Elektron mikroskopiya

Transfeksiyadan bir kun oldin HeLa hujayralari 600 hujayra/mkL zichlikda qoplandi. Lipofektamin RNAiMAX transfektsiya reagentida (ThermoFisher Scientific) Stealth RNKi siRNA (Thermo Fisher Scientific) yordamida qiziqqan genlar ifodasi HeLa hujayralarida o'chirildi. ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalari (yakuniy RNK kontsentratsiyasi 10 nM bilan).

siRNK ishdan chiqqanidan to'rt kun o'tgach, hujayralar fiksatsiyaga duchor qilindi. Hujayra madaniyati namunalari 2% PFA va 2% glutaraldegid bilan 0.1 M fosfatbufer, pH 7,4, 37 ◦C da o'rnatildi, so'ngra 4 ga joylashtirildi. ◦C muzlatgichda 30 daqiqa. Namunalar 2% glutaraldegidda 0.1 M fosfat buferida 4 ◦C haroratda kechasi davomida mahkamlangan. Namunalar uch marta 0.1 M fosfat buferi bilan 30 daqiqa davomida yuvildi va 0,1 M fosfat tamponida 2% osmiytetroksid bilan 4 ◦C da 1 soat davomida mahkamlandi.

Namunalar suvsizlangan ingradlangan etanol eritmalari, qatronga o'tkazildi (Quetol -812, Nisshin EM Co., Tokio, Yaponiya) va 60 ◦C da 48 soat davomida polimerizatsiya qilindi. Polimerlangan qatronlar ultramikrotom (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Germaniya) yordamida olmosli pichoq bilan o'ta yupqa 70-nm bo'laklarga bo'linib, keyin mis panjaralarga o'rnatildi.

Bo'limlar RTda 15 daqiqa davomida 2% uranil asetat bilan bo'yalgan va distillangan suv bilan yuvilgan, so'ngra qo'rg'oshin bo'yash eritmasi (Sigma-Aldrich, Tokio, Yaponiya) bilan RTda 3 minut davomida ikkilamchi bo'yalgan.

Tarmoqlar transmissiya elektron mikroskop ostida kuzatildi (JEM-1400Plus, JEOL Ltd.., Tokio, Yaponiya) 80 kV (zebrafish miyasi) yoki 100 kV (hujayra) tezlashuv kuchlanishida va tasvirlar zaryad bilan bog'langan qurilma (CCD) kamerasi (EM{4}}RUBY2,JEOL Ltd.) yordamida yozib olingan. .

2.4. Immunoelektron mikroskopiya

Oltin disklardagi namunalar suyuq propanda -175 ◦C da muzlatilgan. Namunalar muzlatilgandan so'ng, ular 24 soat davomida -80 ◦C da etanoldagi 1% tanin kislotasi va 2% distillangan suv bilan muzlatilgan holda almashtirildi.

Keyin namunalar 4 soat davomida -20 ◦C da, so'ngra 1 soat davomida 4 ◦C da inkubatsiya qilindi. Keyinchalik, namunalar suvsiz etanolda 3 marta 30 daqiqa davomida suvsizlandi. har safar, 1 soat davomida 4 ◦C da etanoland qatroni (LR oq: London Resin Co. Ltd., Berkshire, Buyuk Britaniya) 50:50 aralashmasi bilan infiltratsiya. Namunalar yangi 100% qatronga o'tkazildi va 4 ◦C da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va bu jarayon uch marta takrorlandi.

Namunalar yangi 100% qatronga o'tkazildi va 50 ◦CO / N da polimerizatsiya qilindi. Polimerlangan qatronlar ultramikrotom (Ultracut UCT; Leica) yordamida olmos pichoq bilan 90 nm da o'ta yupqa bo'laklarga bo'lingan va bo'laklar nikel panjaralariga joylashtirilgan. To'rlar 4 ◦CO/N da 1% BSA/PBS da anti-dsDNA antikor (35I9 DNK) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB{10}}) bilan inkubatsiya qilindi, so'ngra uch marta chayqash orqali Har biri 1 daqiqa uchun 1% BSA/PBS.

Keyinchalik ular {0}}nm oltin zarralari (Echki anti-sichqon IgG poliklonalantikor) bilan konjugatsiyalangan ushbu ikkilamchi antikor bilan RT da 2 soat davomida inkubatsiya qilindi. PBS bilan yuvilgandan so'ng, panjaralar 2% glutaraldegidin 0,1 M kakodilat tamponiga joylashtirildi.

Shundan so'ng, to'rlar quritilgan va keyin 2% uranil asetat bilan 15 daqiqa va qo'rg'oshin bo'yoq eritmasi (Sigma-Aldrich) bilan RT da 3 daqiqa davomida bo'yalgan. To'rlar transmissiya elektron mikroskop (JEM-1400) orqali kuzatilgan. plus JEOLLtd.) 100 kV tezlanish kuchlanishida. Raqamli tasvirlar CCD kamera (EM{6}}RUBY2, JEOL Ltd.) yordamida olingan.

3. Natijalar

3.1. TFAM yoki GBA ning pasayishi ektopik mitoxondriyal DNKning ko'payishiga olib keladi

Birinchidan, biz HeLa hujayralarida mitoxondriyadan olingan sitoplazmik DNKni aniqlash misolini ko'rsatdik, bunda TFAM oqsili siRNK tomonidan parchalanadi (1A-rasm).TFAM mitoxondriyal transkripsiyaning asosiy omili bo'lib, mitoxondriyal DNK replikatsiyasi va ta'mirlanishida ham ishlaydi [20] .

Ushbu gendagi ketma-ketlik polimorfizmlari Parkinson kasalligi bilan bog'liqligi haqida xabar berilgan [21,22]. 3 kunlik TFAM oqsili ishdan chiqqanidan so'ng, HeLa hujayralari sitoplazmasida ko'plab ikki zanjirli DNK nuqtalari aniqlandi.

Gistonlar sitoplazmadagi yadro kelib chiqishi DNKsi uchun ijobiy, sitoplazmadagi mitoxondriyal DNK va mitoxondriyal DNK uchun salbiy belgilar [23]. Bu nuqtalar gistonlar bilan birgalikda joylashmagan, bu ularning yadrodan kelib chiqqan DNK emasligini ko'rsatadi. Bundan tashqari, ushbu sitoplazmatik, ektopik DNK nuqtalarining ba'zilari mitoxondriyal matritsa uchun marker bo'lgan Hsp60 bilan birgalikda lokalizatsiya qilinmagan, bu ularning mitoxondriyadan tashqarida joylashganligini ko'rsatadi (1B, C-rasm).

Elektron mikroskop shuningdek, ektopik DNK mitoxondriyadan sizib chiqqanligini ko'rsatdi (2A, B-rasm). Xulosa qilib aytadigan bo'lsak, TFAM yiqitishi natijasida sitoplazmadagi ektopik DNK nuqtalarining ko'payishi mitoxondriyal DNKning mitoxondriyadan sizib chiqishi bilan bog'liq edi. Ikkinchidan, biz HeLa hujayralarida mitoxondriyadan kelib chiqqan sitoplazmatik DNKni aniqlashning yana bir misolini ko'rsatdik, bunda GBA oqsili ksi NA bo'lgan. (1A-rasm).

GBA Gaucher kasalligining sababchi genidir, ammo GBA ning geterozigota mutatsiyasi ham Parkinson kasalligi uchun xavf omilidir [24]. 3 kunlik GBA oqsili parchalanishidan so'ng HeLa hujayralari sitoplazmasida ko'plab ikki zanjirli DNK nuqtalari aniqlandi. Ba'zi DNK nuqtalari gistonlar bilan birgalikda lokalizatsiya qilingan, bu ularning yadrodan olingan DNK ekanligini ko'rsatadi.

Boshqa DNK nuqtalari gistonlar bilan birgalikda lokalizatsiya qilinmagan, bu ularning yadrodan olingan DNK emas, balki mitoxondriyadan olingan DNK ekanligini ko'rsatadi (1D-rasm). Xulosa qilib aytganda, sitoplazmadagi ektopik DNK nuqtalarining GBA yiqilishiga olib kelishi qisman mitoxondriyal DNKning mitoxondriyadan oqib chiqishi bilan bog'liq edi.

For more information:1950477648nn@gmail.com