Proteaz Calpain2a Teleost baliqlarida TRAF6 ni maqsad qilib, tug'ma immunitetni cheklaydi
Dec 19, 2023
TNF retseptorlari bilan bog'langan omil 6 (TRAF6) ham antibakterial, ham antiviral signalizatsiya yo'llarida asosiy signal uzatish rolini o'ynaydi. Biroq, pastki umurtqali hayvonlarda TRAF6 ning tartibga solish mexanizmlari kamroq ma'lum qilingan. Ushbu tadqiqotda biz calpain2a ni noyob gidrolitik ferment faolligi bilan kaltsiyga bog'liq proteazlar oilasining a'zosi sifatida aniqlaymiz va teleost baliqlarida antibakterial va antiviral immunitetning asosiy regulyatori sifatida ishlaydi. Lipopolisakkarid (LPS) stimulyatsiyasidan so'ng, kalpain2a ning ishdan chiqishi yallig'lanish sitokinlarini tartibga solishga yordam beradi. Mexanik jihatdan calpain2a TRAF6 bilan o'zaro ta'sir qiladi va gidrolizlash orqali TRAF6 protein darajasini pasaytiradi. Enzimatik faollikni yo'qotgandan so'ng, mutant kalpain2a raqobatbardosh ravishda dimer shakllanishini va TRAF6 ning avtomatik ubiquitinatsiyasini inhibe qiladi. Kalpain2a ni nokdaun qilish, shuningdek, hujayrali virusga qarshi javobni kuchaytiradi. Gidrolaza faolligi bo'lmagan mutant kalpain2a TRAF6 dan IFN tartibga soluvchi omil (IRF) 3/7 ning ubiquitinatsiyasini bostiradi. Birgalikda olingan ushbu topilmalar calpain2a ni teleost baliqlarida TRAF6 ni nishonga olgan holda tug'ma immunitet reaktsiyalarining salbiy regulyatori sifatida tasniflaydi.
cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi
Bosqinchi patogenlarga qarshi birinchi himoya chizig'i sifatida tug'ma immunitet tanani bakterial ishg'ol va virusli infektsiyalardan himoya qilishda muhim rol o'ynaydi. Membranada naqshni aniqlash retseptorlari (PRR) patogen bilan bog'liq molekulyar naqshlarni (PAMP) darhol taniydi 1-3. Tug'ma immunitetda eng ko'p o'rganilgan uchta PRR - bu Toll-o'xshash retseptorlar (TLR), RIG-I-ga o'xshash retseptorlar (RLRs) va NOD-ga o'xshash retseptorlar (NLRs), ular turli PAMPlarni taniydilar va proinflamatuar sitokinlarni faollashtirish uchun signal kaskadlarini ishga tushiradilar va antiviral omil 4-6. TNF retseptorlari bilan bog'liq omil (TRAF) 6 bakterial invaziya va virusli infektsiyalarga qarshi kurashning ajralmas qismidir. Lipopolisakkarid (LPS) tomonidan faollashtirilgan muhim signal yo'li sifatida yadro transkripsiya omili-kB (NF-kB) yo'li batafsil xaritada ko'rsatilgan. NF-kB signalizatsiya yo'lidagi oqsil funktsiyalarining aksariyati keng qamrovli o'rganilgan1,7. Miyeloid differentsiatsiya omili 88 (MyD88) birinchi bo'lib LPSga javoban TLRlar tomonidan faollashtiriladi va IRAK4 MyD88 ni TRAF68-11 bilan bog'laydigan IRAK1 va IRAK2 ni faollashtirish orqali vositachi sifatida ishlaydi. Ubc13 va Uev1A TRAF6 ning K{27}}bog'langan ubiquitinatsiyasini katalizlaydi, bu esa K63 ubiquitin zanjirini TAB2 va TAB3 ga o'tkazadi, bu esa TAK112-16 faollashishiga olib keladi. TAK1, TAB1 va TAB2 dan tashkil topgan TRAF{34}}boshqariladigan IKK faollashtiruvchisi 2 (TRIKA2) IKB kinaz (IKK) / fosforillanish inhibitori17-19ni faollashtiradi. NF-kB transkripsiya omili yadroga kiradi va yallig'lanish sitokinlarini ishlab chiqarishga yordam beradi20. TLR7/9 virusni taniganida, MyD88- IRAKs-TRAF6 kompleksi signallarni IFN tartibga soluvchi omil (IRF) 7 ga uzatadi, IRF7 ubiquitinatsiyasiga yordam beradi va uning yadroga fosforlanishini faollashtiradi21,22. RLR signalizatsiya yo'lida RIG I va melanoma differentsiatsiyasi bilan bog'liq bo'lgan gen 5 (MDA5) mitoxondrial antiviral signalizatsiya oqsilini (MAVS) 23,24 faollashtiradi. MAVS agregatsiyasi RLR signal uzatish boshlanishining muhim xususiyati hisoblanadi23,25,26. TRAF2/3/6 MAVS27,28 tomonidan faollashtirilgan birinchi omillardir. TRAF3 TBK1-IRF3 signalizatsiyasini faollashtiradi va MAVS-TRAF6 kompleksi IFN-1 ifodasini27,29 targ‘ib qiluvchi NF-kB signalizatsiyasini faollashtiradi.
Cistanche erkaklar uchun foydalari-immun tizimini mustahkamlaydi
TRAF6 faollashuvining molekulyar mexanizmi allaqachon namoyish etilgan. Dimer shaklidagi TRAF6 Ubc13 va Uev1A katalizlari ostida avtoubiquitinatsiyaga uchraydi, bu halqa barmoq va ZF barmoqlari domeniga tegishli. TRAF6/Ubc13~UB modeli TRAF6 dimerining K63 ubiquitin zanjirini yig'ish va uzatishda muhim rolini tasdiqlaydi30. Bundan tashqari, halqali barmoq va ZF barmoqlari domenlari zebrafish TRAF6 kristalli modelida E2~ub konjugatlarini jalb qilganligi va TRAF6 birinchi marta bir xil TRAF oilasidan TRAF5 bilan heterodimer hosil qilishi aniqlangan16. Deubiquitination oilasi oqsillari: A20, CYLD, USP2a, USP4 va USP20 K63-bog'langan ubiquitinatsiyani olib tashlash va quyi oqim signalini kamaytirish uchun TRAF6 ni maqsad qiladi31-35. Xamirturush ikki gibrid tizimi UBE2O va TRAF6 o'rtasidagi o'zaro ta'sirni tekshiradi va bu o'zaro ta'sir MyD8836 tomonidan TRAF6 ning faollashishiga bevosita ta'sir qilishini tasdiqlaydi. TRAF6 ning quyi oqim signalini uzatish jarayonida ECSIT oraliq oqsil sifatida mos ravishda TRAF6 va TAK1 bilan o'zaro ta'sir qiladi va bu o'zaro ta'sir TRAF6 va TAK137 ning ulanishini kuchaytiradi. LPS tomonidan qo'zg'atilgan TLR4 signalizatsiyasida PRDXlar TRAF6 ning K63 ubiquitin zanjirini etkazib berish uchun ECSITni jalb qilishiga to'sqinlik qiladi va shuningdek, autofagiya yo'lida TRAF6 tomonidan faollashtirilgan BECN1 ni inhibe qiladi38. MST4 Thr463 va Thr486 da TRAF6 fosforillanishini faollashtiradi va TRAF6 dimerizatsiyasi va ubiquitinatsiyasini inhibe qiladi39. Sutemizuvchilarda TRAF6 ning oqsillarni tartibga solish mexanizmi antibakterial va antiviral immunitetda keng o'rganilgan. Biroq, pastki umurtqali hayvonlarda TRAF6 tadqiqotlari kamroq o'rganilgan. Teleost baliqlarining immun javobi, asosan, patogen infektsiyadan keyin immun javobni amalga oshirish uchun TLR va RLR yo'llariga tayanadi. Shuning uchun TRAF vositachiligidagi signal yoʻllarining tartibga solish mexanizmini oʻrganish juda muhimdir. kalpain2 (m-kalpain) kalsiyga bogʻliq proteazlar oilasi boʻlib, sut emizuvchilar va boshqa koʻplab organizmlarda 16 dan ortiq aʼzodan iborat40. Kalpain oqsillari oilasining eng dastlabki tadqiqoti hujayralar harakati bilan bog'liq41. kalpain hujayra migratsiyasini rag'batlantiradi va neytrofillar migratsiyasini va p38 MAPK va ERK MAPK42 faollashuvini inhibe qilishi aniqlandi. Gidrolazaning faolligi kalpaning muhim funktsiyalaridan biridir. Immunitetni tartibga solishda kalpain{56}} IkB ni gidrolizlash orqali NF-kB ning chiqarilishiga yordam beradi va signalizatsiya yo'lini faollashtiradi43. Ushbu tadqiqotda biz calpain2a ning TRAF6 bilan o'zaro ta'sir qilishini va teleost baliqlari, miiuy croaker (Miichthys miiuy) da antibakterial va antiviral javoblarda salbiy regulyator sifatida harakat qilishini aniqladik. calpain2a gidrolaza faolligi orqali TRAF6 oqsil darajasining degradatsiyasiga yordam beradi. Shu bilan birga, gidrolaza faolligi bo'lmagan mutant kalpain2a TRAF6 dimerini inhibe qilish orqali K63 ubiquitin zanjirining shakllanishiga to'sqinlik qiladi. Kalpain2a ham, mutant kalpain2a ham TRAF6 ning ECSIT/BENC1/ IRF3/IRF7 ga ubiquitinatsiyasini to'xtatadi. calpain2a NF-kB va IFN signalizatsiya jarayonini TRAF6 ga yo'naltirish orqali to'xtatadi. Natijalarimiz quyi umurtqali hayvonlarda TRAF{75}}vositachiligi immun tartibga solishni o‘rganish uchun molekula beradi.
Natijalar
calpain2a TRAF6 bilan o'zaro ta'sir qiladi va NF-kB signalizatsiyasini salbiy tartibga soladi.
Teleost baliqlarida tug‘ma immunitet reaktsiyasidagi TRAF{0}}bog‘langan oqsillar haqida tushunchaga ega bo‘lish uchun biz yaqinlikni tozalash va mass-spektrometriya yordamida miiuy croaker TRAF6 interaktomini tavsifladik. Yorliqsiz miqdorni aniqlash (LFQ) intensivligi bo'yicha tartiblangan, biz ma'lumotlarning bir qismini ushlab oldik va uni ko'rsatdik (1a-rasm). TRAF{4}}bog'langan oqsillar orasida calpain2a TRAF6 faolligini tartibga solgan va TRAF vositachiligidagi signal yo'llariga ta'sir qilgan bo'lishi mumkin. Birinchidan, protein darajasida calpain2a va TRAF6 o'rtasidagi munosabatni tekshirish kerak, biz Miiuy croaker buyrak hujayralarida (MKC) calpain2a ning TRAF6 bilan o'zaro ta'sirini tekshirdik. Endogen koimmunopresipitatsiya tajribalari calpain2a ning TRAF6 bilan o'zaro ta'sir qilishini ko'rsatdi (1b-rasm, c). Vaqtinchalik transfeksiya va koimmunoprecipitatsiya tajribalarida ko'rsatilgandek, haddan tashqari ifodalangan kalpain2a va TRAF6 bir-biri bilan o'zaro ta'sirlashgan (1d, e-rasm). Bularning barchasi calpain2a ning TRAF6 bilan o'zaro ta'sirini ko'rsatadi va ularning ta'sir qilish mexanizmini tekshirish uchun qo'shimcha tajribalar zarur. Odam, sichqoncha, zebrafish va may croaker calpain2a oqsillarining bir nechta ketma-ketligi bilan kalpain2a baliq va sutemizuvchilar o'rtasida evolyutsion tarzda saqlanib qoladi (1f-rasm). Kalpain2a ning tug'ma immunitetdagi funktsiyasini aniqlash uchun biz kalpain2a ning LPS stimulyatsiyasi natijasida kelib chiqqan NF-kB faollashuvi bilan bog'liqligini tekshirdik. Biz epithelioma papulosum cyprinid (EPC) hujayralarini NF-kB lusiferaza muxbiri, ichki nazorat renilla lusiferaza muxbiri va vektor kodlash calpain2a yoki bo'sh vektor bilan transfektsiya qildik. calpain2a dozaga bog'liq tarzda LPS stimulyatsiyasida NF-kB reportyor faolligini sezilarli darajada kamaytirdi (1g-rasm). Bundan tashqari, LPS stimulyatsiyasiga javob beruvchi IL{32}} va IL-8 proinflamatuar sitokinlar calpain2a haddan tashqari ifodalangan EPC hujayralarida sezilarli darajada kamaydi (1h, i-rasm), bu yallig'lanish signalizatsiyasida kalpain2a ning potentsial rolini ko'rsatadi. LPS stimulyatsiyasi tomonidan qo'zg'atilgan yo'llar.
cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi
Cistanche Enhance Immunity mahsulotlarini ko'rish uchun shu yerni bosing
【Batafsil ma'lumot so'rang】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
LPS-induktsiyali NF-kB signalizatsiyasini calpain2a tomonidan salbiy tartibga solish.
NF-kB signalizatsiyasida calpain2a ning potentsial rolini o'rganish uchun biz LPS vaqt gradienti bilan MKCda kalpain2a transfektsiyasini o'tkazdik va LPSga javob beradigan yallig'lanishga qarshi sitokinlarni baholadik. Kalpain2a ning haddan tashqari ko'payishi IL-1 , IL-8 va IL-6 ifodalarining pasayishiga olib keldi (2a-rasm). Keyinchalik, biz ikkita kalpain2a-ga xos bo'lgan kichik aralashuvchi RNKni (siRNK) samarali ravishda pastga tushirilgan kalpain2a ni ishlab chiqdik (2b, d-rasm). Calpain2a ning nokdaunti LPS tomonidan qo'zg'atilgan yallig'lanishga qarshi sitokinlarni, shu jumladan MKC va Miiuy croaker ichak hujayralarida (MIC) IL-1 va IL-8ni sezilarli darajada kuchaytirdi (2c, e-rasm). LPS bilan qo'zg'atilgan hujayralar guruhida calpain2a ning qulashi hujayra proliferatsiyasini kuchaytirdi. Xuddi shunday, hech qanday stimulyatsiya bo'lmasa, biz calpain2a ning yiqilishini ham hujayra proliferatsiyasini kuchaytirganini aniqladik (2f-rasm). Calpain2a LPS tomonidan qo'zg'atilgan NF-kB signalizatsiyasida oqsillarni inhibe qilganligini aniqlash uchun calpain2a MyD88, IRAK4 yoki TAK1 ni emas, balki TRAF6 ning endogen protein darajasini sezilarli darajada inhibe qildi (2g-rasm). Xulosa qilib aytganda, kalpain2a kinetikasi va yallig'lanishga qarshi sitokin ifodasi kalpain2a ning LPS tomonidan qo'zg'atilgan NF-kB signalizatsiyasida funktsional ishtirokini taklif qildi.
1-rasm calpain2a TRAF6 bilan o'zaro ta'sir qiladi va NF-kB signalizatsiya yo'lini inhibe qiladi. Yorliqsiz miqdorni aniqlash intensivligiga asoslangan TRAF6 interaktomlari ro'yxati (bo'lim). b, c MKC hujayralari 6 sm2 idishlarga ekilgan. 24 soatdan so'ng hujayra lizatlari anti-TRAF6 yoki anti-kalpain2a yaqinlik jellari bilan immuno-presipitatsiya qilindi (IP). Keyin immunoprecipitatlar va hujayra lizatlari IB tomonidan mos ravishda anti-TRAF6 va anti-calpain2a Abs bilan tahlil qilindi. d, e 6 sm2 idishga ekilgan HEK 293 hujayra calpain2a-Flag va TRAF{22}}Myc plazmidlari (har biri 2 ug) bilan transfektsiya qilindi. 24 soatdan so'ng hujayra lizatlari anti-Myc d yoki anti-Flag e yaqinlik jellari bilan immuno-presipitatsiya qilindi (IP). Keyin immunoprecipitatlar va hujayra lizatlari IB tomonidan mos ravishda anti-Myc va anti-Flag Abs bilan tahlil qilindi. f Qora fon bilan inson kalpain2a (Hu-kalpain2), sichqoncha kalpain2a (Mu-kalpain2), zebrafish kalpain2a (ZF-kalpain2a) va miiuy calpain2a (M-kalpain2a) orasida bir xil aminokislotalar ajratilgan. g–I EPC hujayralari NF-kB, IL-1 va IL{45}} lusiferaza muxbirlari bilan birga calpain2a-Flag yoki bo'sh vektor bilan transfektsiya qilindi. Transfektsiyadan 24 soat o'tgach, hujayralar davolanmagan (Mock) yoki 6 soat davomida LPS bilan davolangan. Lusiferaza faolligi qiymati Renilla lusiferaza faolligiga nisbatan erishildi (har bir guruh uchun n=3). Vaqtinchalik transfektsion calpain2a bayrog'ining ifodasini o'lchash uchun Western blot tahlili ishlatilgan. Tubulin ifodasi yuklash nazorati sifatida ishlatilgan. Ma'lumotlar ikki tomonlama ANOVA (g, h, i) yordamida tahlil qilindi. **p < 0.01. Barcha tajribalar kamida uchta mustaqil tajribada o'tkazildi.
Kalpain2a ning TRAF6 bilan o'zaro ta'siri.
Domen tahlili Conserved Domain Database (CDD) NCBI yordamida amalga oshirildi. calpain2a uchta domenni o'z ichiga oladi: Calpain oilasi sistein proteaz (CysPc) domeni (aa 46-339), markaziy Kalpain katta subunit III domeni (aa 360-499) va C-terminal Penta-EF qo'l domeni ( aa 500-697). TRAF6 bilan oʻzaro taʼsirida calpain2a ning qaysi domen(lar)i zarurligini aniqlash uchun biz uchta kesish mutantlarini yaratdik: kalpain2a (1-339), kalpain2a (340-697) va kalpain (500-697) (3a-rasm). HEK293 hujayralari calpain2a-Flag yovvoyi turi (WT), calpain2a-Flag kesish mutantlari yoki TRAF{19}}HA vektori bilan transfektsiyalangan. Biz to'liq uzunlikdagi calpain2a va uchta kesish mutantlari TRAF6 bilan o'zaro ta'sir qilishi mumkinligini aniqladik (3c-rasm). TRAF6 C-terminal TRAF domenidan, o'ralgan lasan domenidan, sink barmoqlari domenidan va halqa barmoq domenidan iborat38. TRAF6 ning qaysi domen(lar)i uning calpain2a bilan o‘zaro ta’siri uchun zarurligini tekshirish uchun biz bir qator TRAF6 kesuvchi mutantlarni yaratdik, jumladan TRAF6 (1-139), TRAF6 (140-574), TRAF6 ({{36) }}) va TRAF6 (400-574). Shu bilan birga, biz domen mutantlarini yaratdik: TRAF6DRing (bunda Ring barmoq domeni o'chiriladi), TRAF6DZF (bunda sink barmoqlari domeni o'chiriladi), TRAF6DCC (o'ralgan domeni o'chiriladi) va TRAF6DRAF-C ( C-terminalida TRAF domeni o'chiriladi) (3b-rasm). calpain2a to'liq uzunlikdagi TRAF6 bilan, shuningdek, C-terminal TRAF domeni, o'ralgan domeni, sink barmoqlari domenini o'z ichiga olgan TRAF6 ning kesishlari bilan o'zaro ta'sir qildi (3d-rasm, f), lekin halqali barmoq domeni bilan emas (3e-rasm) . Lusiferaza tahlillari shuni ko'rsatdiki, kalpain2a va bu kesish mutantlarining haddan tashqari ifodalanishi EPC hujayralarida NF-kB va IL-1 reportyor faolligini sezilarli darajada inhibe qilgan (3h-rasm). Bundan tashqari, kalpain2a ning TRAF6 bilan subhujayraviy kolokalizatsiyasi o'rganildi. Biz EPC hujayralarini TRAF{60}}GFP va boʻsh vektor yoki calpain2a-mCherry bilan transfektsiya qildik. Konfokal mikroskopiya tahlili shuni ko'rsatdiki, TRAF6 ning yashil signallari calpain2a ning qizil signallari bilan bir-biriga mos keladi, bu calpain2a EPC hujayralarida TRAF6 bilan birgalikda lokalizatsiya qilishini ko'rsatdi (3i, j-rasm). Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, TRAF6 ning bir nechta domenlarining tarkibiy asoslari (C-terminal TRAF domeni, o'ralgan domeni, Sink barmoqlari domeni), lekin halqa barmoq domeni emas, balki uning calpain2a bilan bog'lanishi uchun hal qiluvchi ahamiyatga ega (3g-rasm).
2-rasm calpain2a manfiy LPS-induktsiyali NF-kB signalizatsiya yo'lini tartibga soladi. MKCdagi IL-1, IL-8 va IL-6 mRNK calpain2a-Flag yoki bo'sh vektor bilan transduktsiyalangan va sho'r suv bilan ishlov berilgan (0) yoki turli xillar uchun LPS bilan sinovdan o'tgan. marta (2 soat, 4 soat, 6 soat, 8 soat, 10 soat) (har bir guruh uchun n=3). b, d MKC hujayralari va MIC hujayralari si-kalpain2a #1 va si-kalpain2a #2 (100 nM) yoki si-ctrl (100 nM) bilan transfektsiya qilingan. Transfektsiyadan 48 soat o'tgach, kalpain2a ifodasi qRT PCR (har bir guruh uchun n=3) bilan o'lchandi. Kalpain2a oqsilining darajasi Western blotting yordamida aniqlandi. c, e IL-1 , IL{31}} MKC va MICdagi mRNK si-calpain2a №1 yoki si-ctrl (nazorat vektori) bilan barqaror transduktsiyalangan va tuz (0) bilan ishlov berilgan yoki turli xillar uchun LPS bilan tekshirilgan. marta (4 soat, 8 soat) (har bir guruh uchun n=3). f MKC hujayralari si-ctrl yoki si-calpain2a №1 bilan transfektsiya qilingan. Transfektsiyadan 36 soat o'tgach, hujayralar 12 soat davomida LPS bilan rag'batlantirildi, so'ngra hujayra proliferatsiyasi tahlili o'lchandi (har bir guruh uchun n=3). O'lchov paneli, 100 mkm. g calpain2a-Flag turli vaqtlarda (3 soat, 6 soat, 9 soat) LPS bilan sinovdan o'tgan MKC hujayralariga transfektsiya qilindi. Ko'rsatilgan Abs bilan hujayra lizatlarining immunoblot tahlili. Nisbiy mRNK darajasi har bir namunadagi aktinni kodlovchi gen ifodasi uchun normallashtirildi. Barcha tajribalar kamida uchta mustaqil tajribada o'tkazildi. Ma'lumotlar ikki tomonlama ANOVA (a, c, e, f) yoki bir tomonlama ANOVA (b, d) tomonidan tahlil qilindi. *p <0,05, **p <0,01.
3-rasm Kalpain2a ning TRAF6 bilan o'zaro ta'siri. a, b Ushbu tadqiqotda miiuy croaker calpain2a, TRAF6 va mutantlarda domen tashkilotining sxematik diagrammalaridan foydalanilgan. "+" TRAF6 yoki calpain2a bilan o'zaro ta'sirni anglatadi, "-" o'zaro ta'sir yo'q degan ma'noni anglatadi. c HEK293 hujayralari soxta, calpain2a-Flag yovvoyi turi (WT) va calpain2a-Flag kesilgan mutantlar yoki ko'rsatilgandek TRAF{14}}HA bilan transfeksiya qilingan. Transfektsiyadan 24 soat o'tgach, transfektsiyalangan hujayralar ekstraksiya qilindi va hujayra lizatlari anti-HA antikorlari bilan immunopresipitatsiyadan o'tkazildi, so'ngra anti-HA yoki anti-Flag antikorlari yordamida IB. d–f HEK293 hujayralari soxta, TRAF{21}}HA yovvoyi turi (WT) va TRAF6-HA kesilgan mutantlar yoki ko'rsatilgandek calpain2a-Flag bilan transfektsiya qilindi. Transfektsiyadan 24 soat o'tgach, transfektsiyalangan hujayralar ekstraksiya qilindi va hujayra lizatlari anti-HA antikori d, f yoki anti-Flag antikor e bilan immunopresipitatsiyadan o'tkazildi, so'ngra anti-HA yoki anti-Flag antikorlari yordamida IB. g TRAF6 va kalpain2a ning o'zaro ta'sir qilish joyi. h EPC hujayralari NF-kB va IL{39}} lusiferaza muxbirlari bilan birgalikda TRAF6-HA, calpain2a-Flag yoki calpain2a-Flag kesilgan mutantlar bilan transfektsiya qilindi. Transfektsiyadan keyin 36 soat o'tgach, lusiferaza faolligi qiymati renilla lusiferaza faolligiga (har bir guruh uchun n=3) erishildi. I j EPC hujayralari soxta, calpain2a-mCherry va TRAF6-GFP bilan transfektsiya qilindi. DAPI bilan bo'yalgan yadrolar ko'k rangda ko'rsatilgan. calpain2a qizil floresan bilan, TRAF6 esa yashil floresan bilan aniqlandi. Masshtab paneli, 10 mkm. Barcha tajribalar kamida uchta mustaqil tajribada o'tkazildi. Ma'lumotlar bir tomonlama ANOVA (h) tomonidan tahlil qilindi. **p <0,01.
calpain2a proteolitik faollik bilan TRAF6 protein ifoda darajasini inhibe qiladi.
TRAF6 da calpain2a ning tartibga solish mexanizmini o'rganish uchun biz birinchi navbatda kalpain2a ning protein darajasida TRAF6 ga ta'siri bor-yo'qligini tekshirdik. calpain2a-Myc va TRAF6-Flag EPC hujayralariga birgalikda transfektsiya qilindi, TRAF6 ning oqsil darajasi 30 soatda qisman degradatsiyaga uchradi (4a-rasm). 4b-rasmda ko'rsatilganidek, calpain2a dozaga bog'liq holda TRAF6 ning degradatsiyasiga yordam berdi. Kalpain2a mavjud bo'lganda, u TRAF6 ning mRNK darajasiga ta'sir qilmadi, bu calpain2a faqat TRAF6 protein darajasiga ta'sir qilishini ko'rsatadi. Ayni paytda, inhibitor sikloheksimid (CHX) tahlili calpain2a TRAF6 oqsilining yarim umrini tezlashtirishi mumkinligini ko'rsatdi (4c-rasm). MKC hujayralarida kalpain2a ning haddan tashqari ko'payishi endogen TRAF6 ning beqarorlashishiga olib keldi (4d-rasm). Kalpain2a vositachiligida TRAF6 parchalanishi ubiquitin-proteazoma, autofagosoma, lizosomal yo'llar yoki boshqalarga bog'liqligini tekshirish uchun EPC hujayralari ushbu yo'llarni inhibe qiluvchi reagentlar bilan ishlov berildi: MG132, 3-}MA va NH4Cl. Shu bilan birga, TRAF6 ning kalpain2a vositachiligidagi beqarorligi MG132 proteasomal inhibitori, otofagik inhibitör 3-MA yoki lizosomal inhibitor NH4Cl tomonidan qaytarilmadi (4e-rasm). Keyinchalik, EPC xujayralari reagentlar bilan ishlov berildi: E-64 (kalpain gidrolaza faolligini inaktivatsiya qiluvchi kalpain inhibitori) va PMSF (nospesifik serin proteaza inhibitori). Kalpain inhibitori E-64 TRAF6 protein darajasida degradatsiyani oldini olganini topdik (4f-rasm). 4g-rasmda ko'rsatilganidek, E-64 calpain2a tomonidan endogen TRAF6 oqsil darajasining degradatsiyasini ham qaytardi.
4-shakl calpain2a TRAF6 oqsili ifodasini inhibe qiladi. a Bo'sh vektorlar yoki calpain2a-Myc plazmidlarining TRAF6- bayrog'i bilan birga vaqt gradienti tajribasi EPC hujayralarida o'tkazildi. Hujayra lizatlari anti-Myc, anti-Flag va anti-tubulin Abs bilan IB ga duchor qilindi. RNK hujayralardan ajratib olindi va teskari transkripsiya qilindi, so'ngra TRAF6 va aktin PCR primerlari bilan kuchaytirildi. b EPC hujayralari bir kechada 12-quduq plastinkalariga ekilgan va TRAF6-Flag va calpain2a-Myc (0.3, 0.6 yoki {{) bilan birgalikda transfektsiya qilingan. 18}}.9 ug) 48 soat davomida. TRAF6-Flag va calpain2a-Myc oqsillari ifodasi Western blotting yordamida aniqlandi. Hujayralardan RNK olindi va teskari transkripsiya qilindi, keyin TRAF6 va aktin PCR primerlari bilan kuchaytirildi. c calpain2a-Myc yoki boʻsh vektorlar EPC hujayralariga TRAF6-Flag bilan birgalikda transfektsiya qilindi. Transfektsiyadan 36 soat o'tgach, transfektsiyalangan hujayralar 2 yoki 4 soat davomida sikloheksimid (CHX) bilan ishlov berildi. d MKC hujayralari calpain2a-Flag yoki bo'sh vektorlar bilan transfektsiya qilingan. Transfektsiyadan 48 soat o'tgach, hujayra lizatlari anti-TRAF6, anti-Flag va anti-tubulin Abs bilan IBga duchor bo'ldi. e, f EPC hujayralari ko'rsatilgan plazmidlar bilan MG132, 3-MA, NH4CL, E-64 (50 yoki 75 mkM) yoki 6 uchun PMSF mavjudligi yoki yo'qligida transfektsiya qilingan. h immunoblot tahlilini o'tkazishdan oldin. g MKC hujayralari immunoblot tahlilini o'tkazishdan oldin 6 soat davomida E{{50}} (50 yoki 75 mkM) mavjudligi yoki yo'qligida calpain2a-Flag bilan transfektsiya qilingan. h calpain2a-Flag va calpain2a-DCysPc-Flag EPC hujayralariga TRAF{60}}HA bilan birgalikda transfektsiya qilindi. Transfektsiyadan 48 soat o'tgach, hujayra lizatlari ko'rsatilgan Abs bilan IB ga duchor qilindi. I calpain2a-Flag va calpain2a-DCysPc-Flag MKC hujayralariga kotransfektsiya qilindi. Transfektsiyadan 48 soat o'tgach, hujayra lizatlari anti-TRAF6, anti-Flag va anti-tubulin Abs bilan IBga duchor bo'ldi. j IL-1 , IL-8 MKCdagi mRNK calpain2a-Flag va calpain2a-DCysPc-Flag bilan barqaror transduktsiya qilinadi va tuz (0) bilan ishlov beriladi yoki 4 soat davomida LPS bilan tekshiriladi (n=3 har bir guruh uchun). Nisbiy mRNK darajasi har bir namunadagi aktinni kodlovchi gen ifodasi uchun normallashtirildi. Barcha tajribalar kamida uchta mustaqil tajribada o'tkazildi. Ma'lumotlar ikki tomonlama ANOVA (j) yordamida tahlil qilindi. **p <0,01.
TRAF6 ning degradatsiyasi calpain2a ning gidrolaza faolligiga bog'liqligini aniqlash uchun. Sutemizuvchilarda kalpain2a ning oldingi strukturaviy va biokimyoviy tadqiqotlaridan foydalanib, biz kalpain2a ning sistein, gistidin va asparagin qoldiqlarini alaninga (kalpain2a C105A, H262A, N286A va 3 A) mutatsiya qildik, bu esa katalizatorni yo'qotdi. Biz TRAF6 ning degradatsiyasiga ushbu mutatsiya ta'sir qilmaganini kuzatdik (qo'shimcha 1a-rasm). Shunday qilib, biz calpain2a (calpain2a-DCysPc sifatida belgilangan) ning Calpain oilasi sistein proteaz (CysPc) domeni bo'lgan proteaza domenini mutatsiyaga aylantirdik. Na haddan tashqari ifodalangan TRAF6, na endogen TRAF6 calpain2a-DCysPc tomonidan ta'sirlanmaydi (4h, i-rasm). Biroq, yallig'lanishga qarshi sitokinlar IL-1 va IL{23}} bir vaqtning o'zida LPS stimulyatsiyasida yovvoyi turdagi yoki mutatsiyaga uchragan kalpain2a bilan ta'sirlanadi (4j-rasm). Gidrolaza faolligi bo'lmagan mutant kalpain2a TRAF6 oqsil darajasiga ta'sir qilmaydi, ammo gidrolaza faolligi bo'lmagan mutant kalpain2a hali ham quyi oqimdagi yallig'lanishga qarshi sitokinlarning ifodalanishiga ta'sir ko'rsatdi. Bu calpain2a TRAF6 ni tartibga soluvchi potentsial mexanizmlarni o'rganishimizga sabab bo'ldi. Birgalikda olingan bu natijalar shuni ko'rsatadiki, calpain2a o'zining kalpain gidrolaza faolligi orqali TRAF6 protein darajasining ifodasini bostirish orqali NF-kB signalini tartibga soladi.
calpain2a TRAF6 ubiquitin-ligaza faolligini inhibe qiladi.
Keyinchalik, biz calpain2a TRAF{1}}faollashtirilgan NF-kB signalizatsiyasini salbiy boshqaradigan molekulyar mexanizmlarni va fermentativ faollikni yo'qotganda calpain2a ning TRAF6 bilan o'zaro ta'siri uning ubiquitin ligaza faolligini modulyatsiya qiladimi yoki yo'qligini o'rganib chiqdik. Biz MKC hujayralarini LPS bilan davolashdik va keyin immunoprecipitatsiya qilingan TRAF6. Tozalangan rekombinant oqsillar bilan ubiquitinatsiya tahlili calpain2a va calpain2a-DCysPc TRAF6 ning ubiquitinatsiyasini kamaytirganini tasdiqladi (5a-rasm). 5b, c-rasmda ko'rsatilganidek, calpain2a va calpain2a-DCysPc ham TRAF6 ning WT va K63 ubiquitinatsiyalangan oqsillarini sezilarli darajada kamaytirdi. Kalpain2a va kalpain2a-DCysPc kontsentratsiyasi gradientlari dozaga bog'liq holda TRAF6 ning WT va K63 ubiquitinatsiyalangan oqsillarini kamaytirdi. calpain2a-DCysPc hali ham TRAF6 protein darajasiga ta'sir qilmasdan TRAF6 ning K63 ubiquitin zanjiri agregatsiyasini oldini oldi (5d-rasm, e). Keyin biz Myc-belgilangan TRAF6-ni Flag-belgili calpain2a-DCysPc bor yoki yo'qligini ifodalash uchun MKC hujayralarini transfektsiya qildik, so'ngra anti-Myc antikori bilan immunopresipitasyon tajribalarini o'tkazdik va anti-UB bilan immunoblot bilan tahlil qildik. TRAF6 ning bunday ubiquitinatsiyasi calpain2a- DCysPc tomonidan sezilarli darajada zaiflashdi (5f-rasm). LPS tomonidan rag'batlantirilgan TRAF6 K{41}}bog'langan ubiquitin zanjirini TAK1 ga yetkazib beradi, bu TAK1 avtofosforilatsiyasini rag'batlantiradi va NF-kB18 ni faollashtiradi. TAK1 ning WT va K63 ubiquitin oqsillari TRAF6 ishtirokida sezilarli darajada kuchaygan, TAK{49}}bog'langan ubiquitinatsiya esa kalpain2a-DCysPc ishtirokida inhibe qilingan (5g, h-rasm). Ushbu ma'lumotlar gidrolaza faolligiga ega bo'lmagan mutant kalpain2a TRAF6 protein darajasiga ta'sir qilmasdan TRAF6 ubiquitin ligaza faolligini xuddi shunday inhibe qilishini qo'llab-quvvatlaydi.
Cistanche tubulosa foydalari- immunitet tizimini mustahkamlash
calpain2a TRAF6 gomo-oligomerizatsiyasini inhibe qiladi.
TRAF6 tomonidan sintez qilingan Lys63 ubiquitin zanjiri signal uzatishda asosiy rol o'ynaydi. Ma'lum bo'lishicha, TRAF6 ning dimerizatsiyasi uning ubiquitin zanjiri sintezi uchun zarurdir16. Dimerizatsiya modeli K63 ubiquitination16,30 ishlab chiqarish uchun Ubc13 birikmasi bilan chambarchas bog'liq. Baliq TRAF6 dimerlarni hosil qila oladimi yoki yo'qligini tekshirish uchun biz turli teglar bilan TRAF6 plazmidlaridan foydalandik: ko-IP tajribalari uchun Myc-tagged TRAF6 va HA-tagged TRAF6. IP tahlili anti-HA antikori yordamida amalga oshirildi, HATRAF6 Myc-TRAF6 bilan o'zaro ta'sir qildi (6a-rasm). Kalpain2a ning TRAF{21}}dimer oʻzaro taʼsirida inhibitiv taʼsirini oʻrganish uchun bayroq bilan belgilangan calpain2a, HA-belgili TRAF6 va Myc-yorliqli TRAF6 vaqtinchalik HEK293 hujayralariga ekspressiya qilindi. Kutilganidek, kalpain2a ishtirokida TRAF{29}}dimerning o'zaro ta'siri kamayadi (6b-rasm). Shu bilan birga, calpain2a tomonidan TRAF6 degradatsiyasining mavjudligini oldini olish uchun. Biz bayroq bilan belgilangan calpain2a-DCysPc ni transfektsiya qildik va calpain2a-DCysPc ishtirokida TRAF{37}}dimerning o‘zaro ta‘siri asta-sekin kamayganini aniqladik (6c-rasm). Shakl 6d, e da ko'rsatilganidek, biz Myc-TRAF6 ning HA-TRAF6 rivojlangan WT va K63 ubiquitinatsiyasini topdik. HEK293 hujayralari calpain2a va calpain2a- DCysPc bilan birgalikda transfektsiya qilingan bo'lsa-da, yaxshilangan ubiquitinatsiya bostiriladi. Ushbu natijalar gidrolaza faolligi bo'lmagan yovvoyi turdagi kalpain2a va mutant kalpain2a TRAF6 gomooligomerizatsiyasi va avtomatik ubiquitinatsiyani inhibe qilishini ko'rsatadi.
calpain2a ECSIT va BECN1 ga TRAF6 ubiquitinatsiyasini etkazib berishni inhibe qiladi.
5d-rasmda tasvirlanganidek, biz calpain2a TRAF6 dan TAK1 gacha bo'lgan ubikvitatsiya jarayoniga xalaqit berganligini aniqladik. Xabar qilinishicha, ECSIT TAK1 va TRAF6 ning adapter oqsili sifatida LPS stimulyatsiyasi orqali NF-kB signalini rag'batlantirish uchun harakat qilgan37. ECSIT teleost baliqlarida yuqorida aytib o'tilgan funktsiyalarga ega yoki yo'qligini tekshirish uchun biz ECSIT oqsillarini odam, sichqoncha va may croakerda bir nechta ketma-ket tekislashni amalga oshirdik (Qo'shimcha rasm. 1b). Biz EPC hujayralarini NF-KB lusiferaza muxbiri bilan transfektsiya qildik, ECSIT LPS stimulyatsiyasidan so'ng NF-kB reportyor faolligini sezilarli darajada oshirdi (Qo'shimcha 1c-rasm). MKC hujayralarida ECSITning haddan tashqari ifodalanishi TNF- ning mRNK darajasining ko'tarilishiga olib keldi (Qo'shimcha rasm 1d). HEK293 hujayralarida baliq ECSIT va TRAF6 transfektsiyasidan so'ng, biz TRAF6 ning ECIST bilan o'zaro ta'sir qilganini aniqladik (7a-rasm). Xuddi shunday, ECSIT va TAK1 birgalikda transfektsiya qilindi va ikkala oqsil ham o'zaro ta'sirni saqlab qoldi (7b-rasm). Keyinchalik, calpain2a-DCysPc TRAF6-ECSIT kompleksining shakllanishiga to'sqinlik qiladimi yoki yo'qligini tekshirish uchun biz uchta plazmidni HEK293 hujayralariga transfektsiya qildik va calpain2a-DCysPc TRAF6-ECSIT kompleksini oldini olishini aniqladik (7c-rasm). ). NF-kB signalizatsiyasida ubiquitin zanjirining uzatish jarayonini tekshirish. 7d-rasmda ko'rsatilganidek, TRAF6 ECSIT ning ubiquitinatsiyasiga yordam berishi mumkin; kutilganidek, calpain2a-DCysPc TRAF6 ubiquitin zanjirini ECSIT ga uzatish jarayonini inhibe qildi. BECN1 LPS tomonidan qo'zg'atilgan otofagiyadagi muhim oqsildir. K63 ubiquitinatsiyasi BECN1 ni o'zgartirishi va faollashtirishi mumkinligi tasdiqlangan. Deubiquitinating fermenti A20 BECN1 ning ubiquitinatsiyasini olib tashlaydi va LPS tufayli kelib chiqqan autofagiyani inhibe qiladi va TRAF6 bu signalda BECN1 ubiquitinatsiyasi uchun mas'ul E3 ligaza47. 7e-rasmda ko'rsatilganidek, TRAF6 BECN1 bilan o'zaro ta'sir qildi va BECN1 ning ubiquitinatsiyasiga yordam berdi. Keyin biz BECN1, TRAF6, calpain2a va calpain2a-DCysPc ni HEK293 hujayralariga transfektsiya qildik, TRAF6 BECN1 ning ubiquitinatsiyasiga yordam berdi. calpain2a-DCysPc TRAF6 ubiquitin zanjirini BECN1 ga uzatadigan jarayonni inhibe qildi (7f-rasm). Ushbu natijalar gidrolaza faolligiga ega bo'lmagan yovvoyi tipdagi kalpain2a va mutant kalpain2a LPS tomonidan qo'zg'atilgan autofagiya va NF-kB signalizatsiyasida TRAF6 ning ubiquitinatsiya qobiliyatini inhibe qilishini ko'rsatadi.
Kalpain2a tomonidan antiviral javobning salbiy regulyatsiyasi.
RLR yo'lida TRAF6 NF-kB, IFN va sitokinlarni ishlab chiqarishni faollashtirish uchun MAVS tomonidan jalb qilingan E3 ligaza sifatida ishlaydi. Keyinchalik biz calpain2a IFN vositachiligidagi antiviral jarayonda TRAF6 ning oldini olishda rol o'ynaganmi yoki yo'qligini tekshirdik. EPC hujayralarida IFN -1, ISRE va IRF3 promouter tomonidan boshqariladigan lusiferaza muxbirlari ifodalangan. Biz calpain2a Ploy (I: C) stimulyatsiyasi va Siniperca cheats rabdovirus (SCRV) infektsiyasida dozaga bog'liq ravishda promotor tomonidan boshqariladigan lusiferaza faolligini sezilarli darajada kamaytirganini aniqladik (8a, b-rasm). Calpain2a ning nokdaunti Ploy (I: C) va SCRV tomonidan qo'zg'atilgan gen ekspressiyasini sezilarli darajada kuchaytirdi, shu jumladan Viperin, Mx1 va ISG15 (8c, d-rasm). Kalpain2a ning ishdan chiqishi MKC hujayralarida SCRV infektsiyasida hujayra hayotiyligining yuqori ifodalanishiga olib keldi (8e-rasm). 8f-rasmda ko'rsatilganidek, hujayra proliferatsiyasi tahlillari shuni ko'rsatdiki, calpain2a ning ishdan chiqishi SCRV infektsiyasida hujayra proliferatsiyasini kuchaytirdi. Kalpain2a ning haddan tashqari ko'payishi virus tarqalishini keskin oshirdi, bu SCRV infektsiyasidan keyin virusli replikatsiyada aks ettirilgan (8g-rasm). calpain2a va calpain2a-DCysPc Ploy (I:C) stimulyatsiyasi va SCRV infektsiyasi bilan IFN-1, ISRE va IRF3 promotoriga asoslangan lusiferaza muxbirlarini sezilarli darajada kamaytirdi (Qo'shimcha rasm 2a, b). Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, calpain2a TRAF6 ni inhibe qilish orqali RLR signalizatsiya yo'lini salbiy tartibga solishi va shu bilan IFN faollashuvini inhibe qilishi mumkin.
5-rasm calpain2a TRAF6 ubiquitin-ligaza faolligini inhibe qiladi. a Ubiquitination of endogenous TRAF6 in MKC cells transduced with calpain2a-Flag and calpain2a-ΔCysPc-Flag and unchallenged (−) or challenged with LPS (+), assessed by immunoblot analysis with anti-ubiquitin after immunoprecipitation with anti-TRAF6 and input immunoblot analysis ko'rsatilgan Abs bilan. Transfektsiyadan 24 soat o'tgach, hujayralar lizing qilindi va Ni-NTA agaroza bilan tozalandi. d, e HEK293 cells were cotransfected with TRAF{{30}}HA and WT-ubiquitin-His or K63O-ubiquitin-His (in which only lysine 63 is kept) together with calpain2a-Flag ({{45 }}.5 ug, 1 ug), calpain2a-DCysPc-Flag (0,5 ug, 1 ug) yoki bo'sh vektor. Transfektsiyadan 24 soat o'tgach, hujayralar lizing qilindi va Ni-NTA agaroza bilan tozalandi. Transfektsiyadan 24 soat o'tgach, hujayralar lizing qilindi va Ni-NTA agaroza bilan tozalandi. Anti-Myc, anti-Flag, anti-HA va anti-tubulin Abs bilan barcha immunopresipitatlar va kiritilgan immunoblot tahlillari. Barcha tajribalar kamida uchta mustaqil tajribada o'tkazildi.
calpain2a IRF3 va IRF7 ning TRAF6 dan ubiquitinatsiyasini bostiradi.
Ma'lum qilinishicha, MAVS-TRAF3/6 kompleksi tomonidan ishga tushirilgan virusga qarshi signalda TRAF6 faolligi IRF3 va NF-kB48 faollashuvi uchun zarur. 9a, b-rasmda ko'rsatilganidek, TRAF6 IRF3 ning WT va K63-bog'langan ubiquitinatsiyasini rag'batlantiradi va bu kuchaytirish calpain2a- DCysPc ifodasi bilan inhibe qilinadi. Ayni paytda, virus TLRga bog'liq signalizatsiya signalini ishga tushirganda, TRAF6 IRF7 bilan chambarchas bog'liq va faollashtirilgan virusga qarshi omillar bilan birga IRF7 ning ubiquitinatsiyasiga yordam beradi22,49,50. TRAF6 IRF7 ning WT va K{21}}bog'langan ubiquitinatsiyasini rag'batlantiradi va bu kuchayish kalpain2a-DCysPc ifodasi bilan inhibe qilinadi (9c, d-rasm). Bu maʼlumotlar shuni koʻrsatadiki, gidrolaza faolligi boʻlmagan yovvoyi turdagi kalpain2a va mutant kalpain2a IRF3 va IRF7 ning TRAF vositachiligida ubiquitinatsiyasini inhibe qiladi.
Munozara
TRAF6 o'simta nekroz omili (TNF) retseptorlari bilan bog'liq omillar (TRAFs) oilasining etti a'zosidan biri bo'lib, u signal adapteri sifatida aniqlangan va signal uzatishni amalga oshiradi51,52. TRAF oilasi E3 ligaza faolligiga ega bo'lgan Ring barmoq domenini o'z ichiga oladi. HECT domeniga ega E3 ligazalari substratning poliubiquitinatsiyasini rag'batlantiradi va Ring domeniga ega E3lar poliubiquitinatsiyani uzatish uchun E2 ~ ub ni talab qiladi53,54. Dimer Ub-bog'lovchi ferment Ubc13/Uev1A TRAF6 poliubiquitinatsiyasi16 agregatsiyasida ishtirok etishi tasdiqlangan. Sichqoncha TRAF6 K124 nokaut qilinganda, TRAF6 K63 avtomatik ubiquitinatsiya faolligini yo'qotadi va bu saytdagi mutatsiya TRAF vositachiligidagi NEMO ning ubiquitinatsiyasini va TAK1, IKK va NF-kB55 faollashuvini bartaraf qiladi. . Bu aniq, chunki PRDX1 K124 tarkibidagi TRAF6 Ring Finger domeniga bog'lanadi va TRAF638 ning ubiquitinatsiyasini yo'q qiladi. TRAF6 ning ubiquitinatsiyasi uning N-terminal domenining dimerizatsiyasi bilan chambarchas bog'liqligi haqida xabar berilgan (Ring barmoq va ZF barmoqlari domeni). Ubc13 bilan bir nechta N-terminal o'zaro ta'sir joylari mutatsiyaga uchragan va Ubc13 poly~ubni TRAF616 ga uzata olmadi. Calpain2a va TRAF6 mutantlari o'rtasidagi o'zaro ta'sir TRAF6 domenlarining aksariyati halqa barmoq domenidan tashqari calpain2a bilan o'zaro ta'sir qilishini ko'rsatdi. Calpain2a va TRAF6 ning ZF barmoqlari domeni o'rtasidagi o'zaro ta'sir tufayli biz calpain2a TRAF6 ning dimerizatsiyasini blokirovka qilish orqali avtomatik ubiquitinatsiyani inhibe qilishi mumkin deb taxmin qildik. Keyinchalik, biz TRAF6 ning turli teglarining o'zaro ta'sirini tekshirdik. Gidrolaza faolligi yo'q mutant kalpain2a ifodasi ortishi bilan TRAF6 ning turli teglarining o'zaro ta'siri zaiflashdi. HA-belgili TRAF6 Myc-belgili TRAF6 ning ubiquitinatsiyasiga yordam beradi va mutant calpain2a HA-belgili TRAF6 tomonidan kuchaytirilgan ubiquitinatsiyani inhibe qiladi. TRAF6-TAK1 signalini uzatish jarayonida oraliq vosita sifatida ECSIT TRAF6 ning C-terminal domeniga (CC domeni va TRAF-C domeni) ulanadi va NF-kB signalizatsiyasida ishtirok etishi tasdiqlanadi37. ECSITKD THP{61}} hujayralarida proinflamatuar sitokinlar ifodasi kamaydi. Biroq, ECSIT ning ECSITKD THP{62}} hujayralarida haddan tashqari ifodalanishidan so'ng, IRF7, IL-1 va CD44 kabi genlar sezilarli darajada oshdi37. PRDX1 TRAF6 ning halqa barmog'i domeniga bog'lanadi va TRAF6 poliubikitinatsiyasi38 shakllanishini inhibe qilish orqali NF-kB va autofagiya signallarida ECSIT va BECN1 ning ubiquitinatsiyasini inhibe qiladi. Teleost baliqlarida biz ECSIT faollashtirilgan NF-kB signalizatsiya yo'lini tasdiqladik, mos ravishda TRAF6 va TAK1 bilan o'zaro ta'sir qildik va TRAF6 tomonidan ishlab chiqarilgan poliubikitin zanjirini uzatdik. calpain2a TRAF6 ning ZF domeni, CC domeni va TRAF-C domeniga bog‘langan, bu esa TRAF6-ECSITning o‘zaro ta‘sirini inhibe qilgan. Biz gidrolaza faolligi bo'lmagan mutant kalpain2a poliubikitin zanjirini TRAF6 dan ECSIT va BECN1 ga to'sqinlik qilganini tasdiqladik.
6-rasm calpain2a TRAF6 ning autoubiquitinatsiyasini susaytiradi. HEK293 hujayralari TRAF6-Myc, TRAF6-HA yoki bo'sh vektor bilan transfektsiya qilindi. Transfektsiyadan 24 soat o'tgach, hujayralar lizing qilindi va IP HA antikori bilan tahlil qilindi. b HEK293 hujayralari TRAF6-Myc, TRAF6-HA, bo'sh vektor yoki calpain2a-Flag bilan transfektsiyalangan. Transfektsiyadan 24 soat o'tgach, hujayralar lizing qilindi va IP HA antikori bilan tahlil qilindi. c HEK293 xujayralari TRAF6-Myc, TRAF6-HA, bo'sh vektor yoki calpain2a-DCysPc-Flagning turli konsentratsiyasi bilan transfektsiya qilingan. Transfektsiyadan 24 soat o'tgach, hujayralar lizing qilindi va IP HA antikori bilan tahlil qilindi. d, e HEK293 xujayralari TRAF6-Myc, TRAF6-HA va WT-ubiquitin-His yoki K63O-ubiquitin-His (faqat lizin 63 saqlanadi) bilan birga calpain2a-Flag bilan kotransfektsiya qilingan. , calpain2a-DCysPc-Flag yoki bo'sh vektor. Transfektsiyadan 24 soat o'tgach, hujayralar lizing qilindi va Ni-NTA agaroza bilan tozalandi. Anti-Myc, anti-Flag, anti-HA va anti-tubulin Abs bilan immunoprecipitates va kiritish immunoblot tahlil. Barcha tajribalar kamida uchta mustaqil tajribada o'tkazildi.
7-rasm Ecaf 6- Eksit va Bec1ning fitnalarini buzib tashlaydi. Hek293 hujayralari eksit-myc, trava {{6} {{} {{} {bo'sh vektor bilan kesilgan. Qozog'istondan keyingi 24 soatdan keyin hujayralar lized va bayroq antikobasi bilan tahlil qilingan. B heek293 hujayralari Tak 1- bayroq, eksit-myc, yoki bo'sh vektor bilan kesilgan. Qozog'istondan keyingi 24 soatdan keyin hujayralar lized va myc antikobasi bilan tahlil qilindi. C HEK293 hujayralari Trafaf 6- Myc, Ecit-Ha, bo'sh vektor yoki taqiqlangan Calpain2a-Decyna-bayrog'ining turli konsentratsiyasi bilan o'tkazildi. Qozog'istondan keyingi 24 soatdan keyin hujayralar lized va myc antikobasi bilan tahlil qilindi. D HEK293 hujayralari Ecsit-MyC, Traf {{{{{{{{{{{{6- bilan kotransfie-da, "WT-Ubuitin" bilan birgalikda Kalpain2a-Deccc-bayroq yoki bo'sh vektor bilan birga. Transfektsiyadan 24 soat o'tgach, hujayralar lizing qilindi va Ni-NTA agaroza bilan tozalandi. E Hek293 hujayralari Bek 1- bayrog'i, tri 6- myc yoki bo'sh vektor bilan kesilgan. Qozog'istondan keyingi 24 soatdan keyin hujayralar lized va myc antikobasi bilan tahlil qilindi. F HEK293 hujayralari beck 1- Traf 6- Myc, WT-Ubuitin - "XT-Ubuitin" - "XT-Ubuitin" - "XT-Ubuitin", Calpain2a-Deccc-bayroq yoki bo'sh vektor bilan birga. Transfektsiyadan 24 soat o'tgach, hujayralar lizing qilindi va Ni-NTA agaroza bilan tozalandi. Mycga qarshi, bayroqga qarshi, ga qarshi va Anti-Hega va Tubulyin ABR bilan emas Barcha tajribalar kamida uchta mustaqil tajribada o'tkazildi.
Biz kalpain2a kaltsiyga bog'liq proteazlar oilasidan biri sifatida gidrolaza faolligiga ega ekanligini ko'ramiz. m-kalpain (kalpain{3}}) HepG2 jigar hujayralarining NF-kB signalizatsiya yo'lida ijobiy tartibga soluvchi rol o'ynaydi. 26 s proteazoma yondashuvidan qat'i nazar, calpain2a NF-kB transkripsiya faktorini chiqarish uchun IkB ni gidrolizlaydi. Xotira proteinining o'ziga xos inhibitori IKB 56-ning tanazzulgachini oldini oladi. Ammo, XALBAINA UChUN BAGNESning tug'ma immunining ta'sirida bir nechta tadqiqotlar mavjud. MKC hujayralarida calpain2a ning haddan tashqari ifodalanishi LPS tomonidan qo'zg'atilgan NF-kB quyi oqim proinflamatuar sitokinlarini inhibe qildi. Bu hodisa HepG2 jigar hujayralaridagi natijalarga zid edi. Kalpain oqsillari oilasining turga xosligi turli xil ta'sirlarni keltirib chiqargan bo'lishi mumkin. Xuddi shunday, biz kalpain2a ning TRAF6 ni gidrolizlanishini oldini olish uchun kalpain oqsili E-64 ning maxsus inhibitoridan foydalandik. Gidrolaza faolligi bo'lmagan mutant kalpain2a protein darajasiga ta'sir qilmasdan TRAF6 ubiquitin ligaza faolligini inhibe qiladi. Biz calpain2a uchun ferment faol saytlarni topmadik. Sutemizuvchilarda oldingi tadqiqotlarga ko'ra, uchta joy: sistein (C105A), histidin (H262A) va asparagin qoldiqlari (N286A). Biroq, bizning tajribalarimiz MIIyu kremakerning uchta faol saytlari Trafpain2a protein darajasining ifodasiga ta'sir qilmaydi, Traf6 protein darajasining ifodasiga ta'sir qilmaydi, ammo gidroleaza domeni yo'q. Shuning uchun biz butun fermentni faollashtiruvchi strukturaviy domenni mutatsiya qilishni tanladik. Protein Kalpain2a sutsizlar va past umurtqali hayvonlarda tashqi darajada saqlanadi, ammo fermentativ faoliyat saytlari qo'shimcha tergovga loyiqdir.
cistanche o'simlik - immunitet tizimini oshiradi
Xulosa qilib aytganda, biz calpain2a ni LPS tomonidan qo'zg'atilgan NF-kB signalizatsiyasi va virus tomonidan qo'zg'atilgan IFN faollashuvining salbiy regulyatori sifatida aniqladik (9e-rasm). Mass-spektrometriyada calpain2a TRAF6 bilan o'zaro ta'sir qilishi mumkin va biz bu hodisani endogen koimmunopresipitatsiya tajribasi orqali ko'rsatdik. Biz calpain2a LPS tomonidan qo'zg'atilgan NF-kB signalizatsiya yo'lini tartibga solishda ishtirok etishini aniqladik. Bundan tashqari, TRAF6 antiviral signalizatsiya yo'llarida ham muhim rol o'ynaydi. Biz IFN signalizatsiya yo'lini rag'batlantirish uchun SCRV va Ploy (I: C) dan foydalandik va calpain2a oqsil darajasini va TRAF6 ning autoubiquitinatsiyasini tartibga solish orqali IFN signalizatsiyasini ham inhibe qilishi mumkinligini aniqladik. Chunki TLR3 virusli infektsiyalar tomonidan ishlab chiqarilgan ikki zanjirli RNK (dsRNK) tuzilishini taniy oladi. Biz TRAF vositachiligidagi IFN signalizatsiya yoʻlining calpain2a{16}}regulyatsiyasini tushuntirishga koʻproq qiziqamiz, lekin calpain2a va TLR3 signalizatsiya yoʻllari oʻrtasidagi potentsial aloqani istisno qilmaymiz. calpain2a TRAF6 ning gidrolitik tarzda degradatsiyasini rag'batlantirdi va dimerlarning shakllanishini va avtoubiquitinatsiyani inhibe qilish uchun TRAF6 bilan o'zaro ta'sir qildi. Ushbu inhibisyon TRAF6 va ECSIT ning o'zaro ta'sirini va ubiquitinatsiyani TRAF6 dan ECSIT, BECN1, IRF3 va IRF7 ga o'tkazish jarayonini oldini oldi. Bizning joriy natijalarimiz tug'ma immunitet reaktsiyalarida TRAF6 ga yo'naltirilgan holda salbiy tartibga solish mexanizmlarini tushunishga yordam beradi. Bundan tashqari, ushbu tadqiqot baliqning tug'ma immunitet reaktsiyasi jarayonida TRAF6 gomooligomerizatsiyasi va avtoubiquitinatsiyaning asosiy rolini ko'rsatadi. Shu bilan birga, calpain2a TRAF6 ning immun javobini inhibe qilish va normal va tartibli signal yo'llarini oldini olish uchun tartibga solish mexanizmi oqsili sifatida taklif etiladi. Ma'lumotlar umurtqali hayvonlar immunologiyasi va umurtqalilar immunitet tizimining evolyutsiyasini tushunishda yordam beradi.
8-rasm calpain2a SCRV- yoki Poly(I:C)-induktsiyali IFN faollashuvini inhibe qiladi. ab EPC hujayralari IFN-1, ISRE va IRF3-pro lusiferaza muxbirlari bilan birgalikda kalpain2a-Flag yoki bo'sh vektorning turli konsentratsiyasi bilan transfektsiya qilindi. Transfektsiyadan 24 soat o'tgach, hujayralar 12 soat davomida (har bir guruh uchun n=3) SCRV yoki Poly (I: C) bilan soxta infektsiyalangan yoki infektsiyalangan. Vaqtinchalik transfektsion calpain2a-Flag ifodasini o'lchash uchun Western blot tahlili ishlatilgan. Tubulin ifodasi yuklash nazorati sifatida ishlatilgan. c, d Viperin, Mx1, ISG15 mRNK MKCda si-calpain2a #1 yoki si-ctrl (nazorat vektori) bilan barqaror transduktsiya qilingan va tuzli eritma (0) bilan ishlov berilgan yoki SCRV yoki Poly(I: C) bilan tekshirilgan. 24 soat. Nisbiy mRNK darajasi har bir namunadagi gen kodlovchi -aktin ifodasi uchun normallashtirildi (har bir guruh uchun n=3). e, f MKC hujayralari si-ctrl yoki si-calpain2a №1 bilan transfektsiya qilingan. Transfektsiyadan 24 soat o'tgach, hujayralar 24 soat davomida SCRV bilan rag'batlantirildi, so'ngra hujayra hayotiyligi tahlili va hujayra proliferatsiyasi tahlili o'lchandi (har bir guruh uchun n=3). Masshtab paneli, 100 mkm. g MKC xujayralari calpain2a-Flag yoki pcDNA3.1 bilan transfektsiyalangan, so'ngra 24 soat davomida SCRV bilan infektsiyalangan (har bir guruh uchun n=3). qRT-PCR tahlili hujayra ichidagi va supernatant SCRV RNK ifodasi uchun o'tkazildi. Barcha tajribalar kamida uchta mustaqil tajribada o'tkazildi. Ma'lumotlar bir tomonlama ANOVA (a, b), ikki tomonlama ANOVA (c, d, e, f) yoki ikki dumli Student t-testi (g) bilan tahlil qilindi. *p <0,05, **p <0,01.
Usullari
Hujayra madaniyati.
Inson embrion buyragi (HEK) 293 hujayra liniyasi va Epithelioma papulosum cyprini (EPC) hujayra liniyalari Amerika turi madaniyati to'plamidan sotib olindi va laboratoriyamizda saqlangan. Miiuy croaker (M. miiuy) buyrak hujayralari liniyalari (MKC) va Miiuy croaker ichak hujayra liniyalari (MIC) miiuy croakerning buyrak va ichak to'qimalaridan madaniyatli edi57,58. Miiuy croaker buyrak hujayralari va Miiuy croaker ichak hujayralari liniyalari 15% FBS (Gibco) bilan to'ldirilgan L{7}} muhitda (HyClone, AQSH) 0,5% CO2 bo'lgan namlangan inkubatorda 26 darajada ekilgan. , AQSH), 100 U/ml penitsillin (Gibco, AQSh), 100 ug/ml streptomitsin (Gibco, AQSh) va 20 U/ml geparin (Solarbio, Xitoy). Epithelioma papulosum cyprini hujayralari 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penitsillin va 100 mg/ml streptomy bilan to'ldirilgan 199 (Hyclone) muhitida 5% CO2 o'z ichiga olgan namlangan inkubatorda 26 darajada o'stirildi. Inson embrion buyragi 293 hujayra 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penitsillin bilan to'ldirilgan Dulbecco modifikatsiyalangan Eagle muhitida (DMEM) (Invitrogen) 5% CO2 o'z ichiga olgan namlangan inkubatorda 37 darajada o'stirildi. /ml streptomitsin.
9-rasm calpain2a IRF7 va IRF3 ning TRAF vositachiligida ubiquitinatsiyasini inhibe qiladi. b HEK293 hujayralari IRF{6}}Myc, TRAF6-HA va WTubiquitin-His yoki K63O-ubiquitin-His (faqat lizin 63 saqlanadi) bilan birga calpain2a-Flag, calpain2a-DCysPc bilan kotransfektsiya qilingan. -Bayroq yoki bo'sh vektor. Transfektsiyadan 24 soat o'tgach, hujayralar lizing qilindi va Ni-NTA agaroza bilan tozalandi. c, d HEK293 hujayralari IRF7-Myc, TRAF6-HA va WT-ubiquitinHis yoki K63O-ubiquitin-His (faqat lizin 63 saqlanadi) bilan calpain2a-Flag, calpain2a bilan kotransfektsiyalangan. -DCysPc-Bayroq yoki bo'sh vektor. Transfektsiyadan 24 soat o'tgach, hujayralar lizing qilindi va Ni-NTA agaroza bilan tozalandi. Anti-Myc, anti-Flag, anti-HA va anti Tubulin Abs bilan barcha immunopresipitatlar va kiritish. Barcha tajribalar kamida uchta mustaqil tajribada o'tkazildi. TRAF vositachiligidagi signalizatsiya yoʻllaridagi calpain2a rollarini batafsil tavsiflovchi model. LPS va virusda TRAF6 faollashishi, homo-oligomerizatsiya va avtomatik ubiquitinatsiya bo'lishi mumkin. BECN1, ECSIT, IRF7 va IRF3 TRAF6 tomonidan ubiquitinatsiya qilinadi va quyi oqim signallarini faollashtirishni boshlaydi. calpain2a salbiy regulyator sifatida TRAF6 ni TRAF vositachiligidagi signalizatsiya yoʻllarini inhibe qilish uchun maqsad qiladi.
Ma'lumotnomalar
1. Akira, S., Uematsu, S. & Takeuchi, O. Patogenni tan olish va tug'ma immunitet. 124-uya, 783–801 (2006).
2. Takeuchi, O. & Akira, S. Pattern tan olish retseptorlari va yallig'lanish. 140-uya, 805–820 (2010).
3. Wu, J. & Chen, ZJ. Sitozolik nuklein kislotalarning tug'ma immunitetini sezish va signalizatsiya. Annu. Rev. Immunol. 32, 461–488 (2014).
4. Moresco, EM, LaVine, D. & Beutler, B. Toll kabi retseptorlari. Curr. Biol. 21, R488–R493 (2011).
5. Schlee, M. Patogen RNKning master sensorlari - RIG-I kabi retseptorlari. Immunobiologiya 218, 1322–1335 (2013).
6. Wilmanski, JM, Petnicki-Ocwieja, T. & Kobayashi, KS NLR oqsillari: tug'ma immunitetning ajralmas a'zolari va yallig'lanish kasalliklari vositachilari. J. Leukok. Biol. 83, 13–30 (2008).
7. Akira, S. & Hemmi, H. TLR oilasi tomonidan patogen bilan bog'liq molekulyar naqshlarning tan olinishi. Immunol. Lett. 85, 85–95 (2003).
8. Kawai, T. & Akira, S. Tug'ma immunitetda naqshni aniqlash retseptorlarining o'rni: Tollga o'xshash retseptorlarni yangilash. Nat. Immunol. 11, 373–384 (2010).
9. Kawagoe, T. va boshqalar. IRAK1 va IRAK2 tomonidan Tollga o'xshash retseptorlarga bog'liq javoblarni ketma-ket nazorat qilish. Nat. Immunol. 9, 684–691 (2008).
10. Suzuki, N. & Saito, T. IRAK-4−tug'ma va orttirilgan immunitetdagi NF-kappaB faollashtiruvchisi. Immunol tendentsiyalari. 27, 566–572 (2006).
11. Kawai, T. & Akira, S. TLR signalizatsiyasi. Hujayra o'limi farq qiladi. 13, 816–825 (2006).
12. Deng, L. va boshqalar. IkappaB kinaz kompleksini TRAF6 tomonidan faollashtirish uchun dimerik ubiquitin-konjugatsiya qiluvchi ferment kompleksi va noyob poliubikitin zanjiri talab qilinadi. 103-uya, 351–361 (2000).
13. Ninomiya-Tsuji, J. va boshqalar. TAK1 kinaz NIK-I kappaB ni, shuningdek, IL-1 signalizatsiya yo'lidagi MAP kinaz kaskadini faollashtirishi mumkin. Tabiat 398, 252–256 (1999).
14. Takaesu, G. va boshqalar. TAB2, yangi adapter oqsili, IL{5}} signal uzatish yo'lida TAK1ni TRAF6 bilan bog'lash orqali TAK1 MAPKKK faollashuviga vositachilik qiladi. Mol. Hujayra. 5, 649–658 (2000).
15. Qian, Y., Commane, M., Ninomiya-Tsuji, J., Matsumoto, K. & Li, X. IRAKm vositachiligida TRAF6 va TAB2 translokatsiyasi NF-kappa BJ ning interleykin -1-induktsiyasi bilan bog'liq. Biol. Kimyo. 276, 41661–41667 (2001).
16. Yin, Q. va boshqalar. TRAF6 ning kristall strukturasida E2 ta'siri va dimerizatsiyasi. Nat. Tarkibi. Mol. Biol. 16, 658–666 (2009).
17. Vang, C. va boshqalar. TAK1 MKK va IKKning ubiquitinga bog'liq kinazidir. Tabiat 412, 346–351 (2001).
18. Ajibade, AA, Vang, HY & Vang, tug'ma immun signalizatsiyasida TAK1 ning RF hujayra turiga xos funktsiyasi. Immunol tendentsiyalari. 34, 307–316 (2013).
19. Chjan, J., Klark, K., Lourens, T., Peggie, MW & Koen, P. IKKbeta faollashuviga kutilmagan burilish: TAK1 IKKbeta-ni avtofosforilatsiya orqali faollashtirish uchun ishga tushiradi. Biokimyo. J. 461, 531–537 (2014).
20. Emmerich, CH va boshqalar. Kanonik IKK kompleksini K63/M1- bog'langan gibrid ubiquitin zanjirlari orqali faollashtirish. Proc. Natl akad. Sci.110, 15247–15252 (2013).
21. Kawai, T. va boshqalar. Toll-o'xshash retseptorlari orqali interferon-alfa induktsiyasi IRF7 ning MyD88 va TRAF6 bilan bevosita o'zaro ta'sirini o'z ichiga oladi. Nat. Immunol. 5, 1061–1068 (2004).
22. Kitagava, Y. va boshqalar. Odamning 2 V tipidagi parainfluenza virusi oqsili TLR7- va TLR9- ga bog'liq interferon induktsiyasini oldini olish uchun IRF7 ning TRAF{2}}vositachiligi bilan ubiquitinatsiyasini inhibe qiladi. J. Virol. 87, 7966–7976 (2013).
23. Kawai, T. va boshqalar. IPS-1, RIG-I- va Mda5- vositachiligida I turdagi interferon induksiyasini ishga tushiruvchi adapter. Nat. Immunol. 6, 981–988 (2005).
24. Zust, R. va boshqalar. Riboz 2'-O-metilatsiyasi Mda5 RNK sensoriga bog'liq bo'lgan o'z-o'zidan va o'z-o'zidan bo'lmagan mRNKni farqlash uchun molekulyar imzoni beradi. Nat. Immunol. 12, 137–143 (2011).
25. Set, RB, Sun, L., Ea, CK & Chen, ZJ NF kappaB va IRF 3 ni faollashtiradigan mitoxondrial antiviral signalizatsiya oqsili bo'lgan MAVS ni aniqlash va tavsiflash. 122-hujayra, 669-682 (2005).
26. Xu, LG va boshqalar. VISA - bu virus tomonidan qo'zg'atilgan IFN beta signalizatsiyasi uchun zarur bo'lgan adapter oqsilidir. Mol. Hujayra. 19, 727–740 (2005).
27. Yoshida, R. va boshqalar. TRAF6 va MEKK1 RIG-I-ga o'xshash helikaz antiviral yo'lida hal qiluvchi rol o'ynaydi. J. Biol. Kimyo. 283, 36211–36220 (2008).
28. Liu, S. va boshqalar. MAVS virusga qarshi signalizatsiya kaskadlarini faollashtirish uchun bir nechta ubiquitin E3 ligazalarini jalb qiladi. Elife 2, e00785 (2013).
29. Ivashkiv, LB & Donlin, LT I turdagi interferon javoblarini tartibga solish. Nat. Rev. Immunol. 14, 36–49 (2014).
30. Fu, TM, Shen, C., Li, Q., Zhang, P. & Wu, H. TRAF6 tomonidan ilgari surilgan ubiquitin o'tkazish mexanizmi. Proc. Natl akad. Sci. 115, 1783–1788 (2018).
31. Boone, DL va boshqalar. Ubiquitinni o'zgartiruvchi A20 fermenti Tollga o'xshash retseptorlarning javoblarini tugatish uchun talab qilinadi. Nat. Immunol. 5, 1052–1060 (2004).
32. Kovalenko, A. va boshqalar. O'simta bostiruvchi CYLD NF kappaB signalini deubiquitination orqali salbiy tartibga soladi. Tabiat 424, 801–805 (2003).
33. U, X. va boshqalar. USP2a TRAF6 ni deubiquitinating orqali IL-1beta-va virus sabab bo'lgan NF kappaB faollashuvini salbiy tartibga soladi. J. Mol. Hujayra Biol. 5, 39–47 (2013).
34. Xiao, N. va boshqalar. Ubiquitin-spesifik proteaza 4 (USP4) deubiquitination uchun TRAF2 va TRAF6 ni nishonga oladi va TNFalpha sabab bo'lgan saraton hujayralari migratsiyasini inhibe qiladi. Biokimyo. J. 441, 979–986 (2012).
35. Yasunaga, J., Lin, FC, Lu, X. & Jeang, KT Ubiquitin-maxsus peptidaz 20 NF-kappaB signalizatsiyasini salbiy tartibga solish uchun TRAF6 va inson T-hujayrali leykemiya virusi 1-toifa soliqni maqsad qiladi. J. Virol. 85, 6212–6219 (2011).
36. Chjan, X., Chjan, J., Zhang, L., van Dam, H. & ten Dijke, P. UBE2O TRAF6 poliubikitatsiyasini inhibe qilish orqali TRAF{2}}vositachiligi NF-kappaB faollashuvini salbiy tartibga soladi. Hujayra Res. 23, 366–377 (2013).
37. Wi, SM va boshqalar. TAK1-ECSIT-TRAF6 kompleksi NF-kappaBni faollashtirish uchun TLR4 signalida asosiy rol o'ynaydi. J. Biol. Kimyo. 289, 35205–35214 (2014).
38. Min, Y., Kim, MJ, Li, S., Chun, E. & Li, KY PRDX1 tomonidan TRAF6 ubiquitin-ligaz faolligini inhibe qilish NFKB faollashuvi va autofagiya faollashuvining inhibisyoniga olib keladi. Autofagiya 14, 1347–1358 (2018).
39. Jiao, S. va boshqalar. MST4 kinazasi TRAF6 adapterining to'g'ridan-to'g'ri fosforlanishi orqali yallig'lanish reaktsiyalarini cheklaydi. Nat. Immunol. 16, 246–257 (2015).
40. Baudri, M. & Bi, X. Kalpain-1 va Kalpain-2: Sinaptik plastisiya va neyrodegeneratsiyaning Yin va Yang. Neurosci tendentsiyalari. 39, 235–245 (2016).
41. Franco, SJ & Huttenlocher, A. Hujayra migratsiyasini tartibga solish: kalpainlar kesishadi. J. Hujayra fanlari. 118, 3829–3838 (2005).
42. Katsube, M. va boshqalar. Kalpain vositachiligida inson neytrofillarida aniq signal yo'llari va hujayra migratsiyasini tartibga solish. J. Leukok. Biol. 84, 255–263 (2008).
43. Schaecher, K., Goust, JM & Banik, NL Kalpainni inhibe qilishning PBMClarni faollashtirgandan so'ng IkB alfa degradatsiyasiga ta'siri: kalpain parchalanish joylarini aniqlash. Neyrokimyo. Res. 29, 1443–1451 (2004).
44. Tompa, P. va boshqalar. Kalpain yorilishining ketma-ket determinantlari haqida. J. Biol. Kimyo. 279, 20775–20785 (2004).
45. Cuerrier, D., Moldoveanu, T. & Davies, PL. Mu-kalpain uchun peptid substratining o'ziga xosligini peptid kutubxonasiga asoslangan yondashuv bilan aniqlash: astarlangan yon shovqinlarning ahamiyati. J. Biol. Kimyo. 280, 40632–40641 (2005).
46. DuVerle, DA, Ono, Y., Sorimachi, H. & Mamitsuka, H. Kalpain bo'linishini bir nechta yadrolarni o'rganish yordamida bashorat qilish. PLoS One. 6, e19035 (2011).
47. Shi, CS & Kehrl, JH TRAF6 va A20 TLR4-induktsiyasi bilan bog'liq autofagiyani nazorat qilish uchun 63-Beclinning lizin bilan bog'langan ubiquitinatsiyasini-1 tartibga soladi. Sci. Signal. 3, ra42 (2010).
48. Loo, YM & Gale, M. RIG-I-ga o'xshash retseptorlar tomonidan immun signalizatsiyasi. Immunitet 34, 680–692 (2011).
49. Ling, T. va boshqalar. TARBP2 IRF7 ning TRAF{3}}vositalangan K63-bog'langan ubiquitinatsiyasini bostirish orqali IRF7 faollashuvini inhibe qiladi. Mol. Immunol. 109, 116–125 (2019).
50. Chjou, Z. va boshqalar. Zebrafish otud6b irf3 va irf7 ning K63-bog'langan ubiquitinatsiyasini bostirish orqali antiviral javoblarni salbiy tartibga soladi. J. Immunol. 207, 244–256 (2021).
51. Kobayashi, T., Walsh, MC & Choi, Y. Signal uzatishda TRAF6 ning roli va immun javob. Mikroblar yuqtiradi. 6, 1333–1338 (2004).
52. Wu, H. & Arron, JR TRAF6, moslashuvchan immunitet, tug'ma immunitet va osteoimmunologiyani qamrab oluvchi molekulyar ko'prik. Bioesse 25, 1096–1105 (2003).
53. Pickart, CM & Eddins, MJ Ubiquitin: tuzilmalar, funktsiyalar, mexanizmlar. Biochim. Biofizika. Acta. 1695, 55–72 (2004).
54. Pickart, CM & Fushman, D. Polyubiquitin zanjirlar: polimerik oqsil signallari. Curr. Fikr. Kimyo. Biol. 8, 610–616 (2004).
55. Lamothe, B. va boshqalar. Saytga xos Lys{2}}bog'langan o'simta nekrozi omili retseptorlari bilan bog'liq bo'lgan omil 6 avtomatik ubiquitinatsiyasi I kappa B kinaz faollashuvining muhim determinantidir. J. Biol. Kimyo. 282, 4102–4112 (2007).
56. Xan, Y., Weinman, S., Boldogh, I., Walker, RK & Brasier, AR Sitozolik m-kalpain vositachiligida o'simta nekrozi omil-alfa-induktsiyali IkappaBalpha proteolizi. Yadro omili-kappa B faollashishi uchun ubiquitin-proteazoma yo'liga parallel mexanizm. J. Biol. Kimyo. 274, 787–794 (1999).
57. Chu, Q. va boshqalar. Yuqori darajada saqlangan aylana RNK circRasGEF1B Quyi umurtqali hayvonlarda miR-21-3p/MITA yo‘lini tartibga solish orqali antiviral immunitetni kuchaytiradi. J. Virol. 95, e02145–20 (2021).
58. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W. & Xu, T. ACKR4a Vibrio harveyi infektsiyasini osonlashtirish uchun NF-kappaB signalini va apoptozni blokirovka qilish uchun otofagiyani keltirib chiqaradi. iScience 26, 106105 (2023).
59. Sepulcre, MP va boshqalar. Lipopolisakkaridni (LPS) tanib olish va signalizatsiya evolyutsiyasi: baliq TLR4 LPSni tanimaydi va NF kappaB faollashuvini salbiy tartibga soladi. J. Immunol. 182, 1836–1845 (2009).
60. Zheng, V., Chu, Q. & Xu, T. Uzoq kodlanmagan RNK NARL teleost baliqlarida mikroRNK vositachiligida NOD1 pastga regulyatsiyasi orqali immunitet reaktsiyalarini tartibga soladi. J. Biol. Kimyo. 296, 100414 (2021).
61. Zheng, W., Su, H., Lv, X., Xin, S. & Xu, T. Exon-Intron Circular RNK circRNF217 miR-130-3p ni kamaytirish orqali Teleost baliqlarida tug'ma immunitet va antibakterial faollikni kuchaytiradi. Funktsiya. J. Immunol. 208, 1099–1114 (2022).
62. Xu, T., Chu, Q. & Cui, J. Rabdovirus tomonidan qo'zg'atiladigan mikroRNK-210 baliqlarda STING/MITAni nishonga olish orqali antiviral tug'ma immun javobni modulyatsiya qiladi. J. Immunol. 201, 982–994 (2018).
63. Bi, D. va boshqalar. Lipopolisakkaridning tan olinishi va NF-kappaB ning Teleost Fishdagi NOD1 sitozolik sensori tomonidan faollashishi. Old. Immunol. 9, 1413 (2018 yil).
64. Yan, X., Zhao, X., Huo, R. & Xu, T. IRF3 va IRF8 Teleost Fish-da MyD88-ni nishonga olish orqali NF-kappaB signalini tartibga soladi. Old. Immunol. 11, 606 (2020).
65. Chen, Y., Cao, B., Zheng, V., Sun, Y. & Xu, T. eIF3k, teleost baliqlarida ATG5-vositalangan autofagik degradatsiya uchun MyD88 ni maqsad qilib, NF-kappaB signalini inhibe qiladi. J. Biol. Kimyo. 298, 101730 (2022).
