O'simta hujayralari onkogenlardan CD4+ T hujayralariga MHC-II bilan cheklangan epitoplarni taqdim eta olmaydi.
Oct 09, 2023
CD4+ T hujayralari MHC II sinfida (MHC-II) taqdim etilgan peptid antijenlarini tanib olish orqali o'smaga qarshi immunitetda muhim rol o'ynaydi. Ba'zi qattiq saratonlar MHC-II ni ifodalash uchun qo'zg'atilishi mumkin bo'lsa-da, bu o'simtaga xos CD4+ T hujayralari tomonidan to'g'ridan-to'g'ri tanib olish imkonini beradigan darajada aniq emas. Biz bosh va bo'yin skuamoz hujayrali karsinomasi bo'lgan bemorlardan 2 ta onkoprotein, HPV-16 E6 va faollashtiruvchi KRASG12V mutatsiyasiga xos tabiiy astarlangan CD4+ T hujayralaridan T hujayra antijeni retseptorlarini (TCR) ajratib oldik va tavsifladik. va me'da osti bezi kanali adenokarsinomasi, o'z navbatida, va ularning otologik yoki inson leykotsit antijeni bilan mos keladigan antigenni ifodalovchi o'simta hujayralarini tanib olish qobiliyatini aniqladi. Ikkala holatda ham TCRlar antijenler endogen tarzda ifodalangan va endosomal yo'lga yo'naltirilgan, ammo o'simtani taniy olmaganida, tegishli MHC-II yoki B hujayra antigenini taqdim qiluvchi hujayralarni (APC) ifodalovchi peptid yuklangan maqsadli hujayralarni taniy olishini aniqladik. IFN- tomonidan sirt MHC-II ifodasini induksiya qilgandan keyin ham manba oqsilini ifodalovchi hujayralar yoki CIITA bilan transduktsiya. Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, ikkala yadro (E6) va membrana bilan bog'langan (KRAS) onkoproteinning ishlab chiqarilishi va funktsional tan olinishi MHC-II ni ifodalash uchun qo'zg'atilgan o'simta hujayralarini to'g'ridan-to'g'ri tanib olish orqali emas, balki asosan o'zaro faoliyat ko'rsatadigan APClar bilan chegaralanadi.
Cistanche tubulosa-Antitumorning foydalari
Kirish
Somatik hujayralarning malign transformatsiyasi hujayra o'sish yo'llarini tartibga soluvchi va nazoratsiz proliferatsiyaga olib keladigan faollashtirilgan onkogenlar ta'sirida boshlanadi (1). HPV bilan bog'liq saraton holatlarida HPV erta genlari E6 va E7 ekspressiyasi mos ravishda p53 va Rb o'simtani bostiruvchi genlarni inhibe qilish orqali onkogenezga hissa qo'shadi (2). Shu bilan bir qatorda, konstitutsiyaviy onkogen faollashuvi RAS oilasi kabi hujayra o'sishi va ko'payish yo'llarini tartibga soluvchi genlardagi somatik mutatsiyalar orqali sodir bo'lishi mumkin. Darhaqiqat, KRASG12V kabi faollashtiruvchi KRAS mutatsiyalari odatda oshqozon osti bezi, yo'g'on ichak va o'pka saratoni bilan og'rigan bemorlarda uchraydi (3). Garchi onkogenlar kasallikni qo'llab-quvvatlasa-da, ular immunitet tizimi uchun maqsadlarni ham ta'minlashi mumkin. So'nggi yillarda HPV bilan bog'liq saratonni nazorat qilishda immunitet tizimining roli keng e'tirof etildi. HPV bilan bog'liq bemorlarning periferik qonida va o'simta infiltratsion limfotsitlarida (TIL) HPV E6 va E7 ni, shuningdek, boshqa HPV oqsillarini taniydigan CD8+ va CD4+ T hujayralari aniqlangan. saraton (4-6). Ushbu antijenlarga qaratilgan immunoterapiyalar, shu jumladan terapevtik saratonga qarshi vaktsinalar va TIL yoki TCR tomonidan ishlab chiqilgan T hujayralari bilan qabul qilingan hujayra terapiyasi (ACT) klinikgacha va klinik tekshiruvning faol sohasi hisoblanadi (2). Onkogen mutatsiyalarga T-hujayralarining javoblari ham keng tavsiflangan (7-9). Bundan tashqari, mutant KRASga qaratilgan TILlar bilan ACT ob'ektiv javoblarni kuchaytirishi mumkinligi to'g'risida bevosita klinik dalillar mavjud (10). Onkogenlardan olingan epitoplarni taniydigan CD8+ T hujayralari o'simta hujayralariga (11-13) to'g'ridan-to'g'ri sitotoksiklikka vositachilik qilsa-da, CD4+ T hujayralarining o'smaga qarshi immunitetdagi roli unchalik tushunilmagan. So'nggi tadqiqotlar inson saratonida granzim B (GrzmB) kabi sitotoksik belgilarni ifodalovchi CD{27}} T hujayralarining bir qismini ta'kidladi (14, 15). Biroq, bu hujayralarning antigen o'ziga xos xususiyatlari va shu bilan ularning terapevtik salohiyati ko'p jihatdan noma'lum bo'lib qolmoqda. Bundan tashqari, ushbu sitotoksik CD{30}} T hujayralari o'simta hujayralarini tanib olishi va o'ldirishi uchun nafaqat o'simta hujayrasi MHC-IIni ifodalashi kerak, balki tegishli antijenler ham tegishli taqdimot yo'liga yo'naltirilishi kerak. Ushbu tadqiqotda biz HPV-16 E6 va KRASG12V onkoproteinlariga xos bo'lgan CD{32}} T hujayralarining antigenni ifodalovchi o'simta hujayralarini tanib olish qobiliyatini o'rgandik. Ikkala TCR ham HLA-mos keladigan B hujayralarining endosoma bo'limiga yo'naltirilgan endogen tarzda qayta ishlangan va taqdim etilgan antijenlarni to'g'ridan-to'g'ri taniy olgan bo'lsa-da, ikkalasi ham MHC-II induktsiyasi bilan antigenni ifodalovchi o'simta hujayralarini taniy olmadi. Umuman olganda, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, faqat ma'lum antijenler to'g'ridan-to'g'ri MHC-II+ o'simta hujayralarida mavjud bo'lib, ular o'simta hujayralarini to'g'ridan-to'g'ri tanib olish va yo'q qilishga qodir CD4+ T hujayralarining hajmini cheklashi mumkin.
Cistanche erkaklar uchun foydalari-immun tizimini mustahkamlaydi
Cistanche Enhance Immunity mahsulotlarini ko'rish uchun shu yerni bosing
【Batafsil ma'lumot so'rang】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Natijalar
Bosh va bo'yin skuamoz hujayrali karsinomasining TILlaridan HPV-16 E6-maxsus CD4+ va CD8+ T hujayralari javoblarini aniqlash. Biz HPV{7}} bosh va bo'yin skuamoz hujayrali karsinomasi (HNSCC) bilan kasallangan bemordan (Hu{6}}) 2 dan 4 mm gacha bo'lgan o'simta bo'laklaridan ajratilgan bir qator individual TIL kulturalarini skrining qildik (1-jadval; qo'shimcha material Ushbu maqola bilan onlayn mavjud; https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1) IFN-ELISPOT tahlillari orqali HPV-16 virusli E6 va E7 virusli onkoproteinlariga qarshi T hujayra javoblarini aniqlash uchun peptid hovuzlari yordamida E6 va E7 oqsillari uzunligini qamrab oluvchi 15-bir-birining ustiga chiqadigan merslar. Shunisi e'tiborga loyiqki, TIL 12 va 29 fragmentlari E6 peptid hovuzi bilan qayta tiklanganda fonda juda ko'p dog'lar hosil qilgan va CD4+ va CD8+ T hujayralarini o'z ichiga olgan (1A-rasm va qo'shimcha rasm 1A). Tegishli T-hujayra kichik guruhlarini aniqlash uchun biz sitokin sekretsiyasi tahlili yordamida ushbu TIL madaniyatlarini tahlil qildik. Bu shuni ko'rsatdiki, TIL fragmenti 29 (F29) E{29}}reaktiv CD8+ T hujayralarini, 12-fragmentida (F12) ham CD4+, ham CD8+ T hujayralarini o'z ichiga olgan. E6 peptid hovuzini tanib olish (1B-rasm). CD4+ T hujayralarining hech biri E6 qayta stimulyatsiyasiga javoban IL-5 ishlab chiqarmadi, bu Th1-o'xshash fenotipni tasdiqladi. E6-maxsus TILlarning TCR klonalligini aniqlash uchun biz F12 dan bitta IFN- – ajratuvchi CD4+ T hujayralarini va F12 va F29 dan CD{45}} T hujayralarini saraladik. TCR ketma-ketligi IFN- - ajratuvchi CD4+ T-hujayralari (31 ta hujayradan n=31 tasi), shuningdek, IFN- tomonidan ajratilgan yagona TCR klonini - maxfiy CD{{53 tomonidan ifodalangan yagona TCRni aniqladi. }} F12 va F29 dan T hujayralar (n=40 41 va 38 ta hujayradan mos ravishda 37 tasi) (2-qo'shimcha jadval). Bu natijalar shuni ko'rsatadiki, monoklonal CD4+ va CD{62}} E6 ga reaktiv T hujayralari ushbu bemorning TILlarida mavjud. HLA-A*02:01–cheklangan CD8+ TILlardan olingan T xujayralari bemordan olingan o'simta hujayralari liniyasi tomonidan taqdim etilgan E6 ni taniydi. F29 dan olingan TILlar E629-38 peptid bilan qayta stimulyatsiya qilinganida IFN- hosil qildi, bu F29 TCR ilgari tasvirlangan HLA-A*02:01-cheklangan epitopni tan olganligini ko'rsatadi (Qo'shimcha rasm 1B) (11). Bu E629-38/HLA-A*02:01 yordamida, inson CD8-ni ifodalovchi TCR yetishmayotgan J76 hujayralarini belgilash uchun tetramer bilan bog‘lanish tadqiqotlari bilan tasdiqlangan va avvalroq tavsiflangan E{87}}-maxsus TCR musbat sifatida tasdiqlangan. nazorat qilish (2A-rasm) (11). Ikkala TCR ham E{93}} peptidning titrlangan kontsentratsiyasi bilan impulslangan otolog B limfoblastoid hujayra chiziqlari (B-LCL) bilan stimulyatsiya qilingandan so'ng J76 da CD69 o'tkir faollashuv belgisining ko'tarilishi bilan ko'rsatilgandek, funktsional avidlikning o'xshash darajalarini namoyish etdi (2-rasm, B va C). Ushbu ma'lumotlar klinik sharoitda sinovdan o'tgan TCRga o'xshash funktsional xususiyatlarga ega E6 ning ma'lum epitopi uchun xos bo'lgan CD8+ T hujayra klonining mavjudligini tasdiqlaydi (16). Keyinchalik biz E{98}}maxsus CD8+ TCR endogen tarzda ifodalangan antijenlarni taniy oladimi yoki yo'qligini aniqlashga harakat qildik va shu bilan o'smaga qarshi sitotoksiklikka vositachilik qildik. Buning uchun biz yaxshi tavsiflangan HLA-A*02:01+ HPV-16+ o‘simta chizig‘i, CaSki, shuningdek, HNSCC-56 orqali hosil qilingan autolog o‘simta hujayralari chizig‘idan foydalandik. in vitro sitotoksiklik tahlillari uchun ilgari ta'riflanganidek (17) birlamchi o'simta to'qimasini hujayrali qayta dasturlash. RNK-seq tahlili HPV{108}} erta genlari, shu jumladan E6, birlamchi o'simta namunasi va otologik hujayra liniyasi tomonidan ifodalanishini tasdiqladi (Qo'shimcha 1C-rasm). F29 TCR ni ifodalovchi birlamchi inson CD8+ T hujayralari in vitroda turli effektor-maqsad nisbatlarida CaSki va HNSCC-56 hujayralarining o‘limiga vositachilik qilishi mumkin (2-rasm, D va E). Birgalikda bu ma'lumotlar F29 TCR endogen tarzda ifodalangan E6 antijenini taniganligini tasdiqlaydi. TILlardan HLA-DQ cheklangan, E6-maxsus CD4+ T hujayrasini aniqlash. Keyinchalik funktsional tahlil qilish uchun E{122}}maxsus TILlarni kengaytirish uchun biz OKT bilan ilgari tasvirlangan tezkor kengayish madaniyati protokolidan-3 va F12 dan TILlarni kengaytirish uchun nurlangan allogen PBMClardan foydalandik. Birlamchi F12 kulturasi dastlab CD8+ va CD{127}} E6 reaktivligiga ega T hujayralarini o'z ichiga olgan bo'lsa-da, tez kengayishdan so'ng yakuniy hujayra mahsuloti 99% CD4+ T hujayralarini o'z ichiga olgan, shundan taxminan 38,33 tasi. IFN- uchun hujayra ichidagi sitokinni bo'yash orqali ko'rsatilgandek, E6 ga nisbatan % reaktivlikni ko'rsatdi (3A-rasm).
Xitoy o'ti cistanche o'simligi - Antitumor
IFN-ga qo'shimcha ravishda, stimulyatsiyalangan E{1}}maxsus CD4+ TILlar TNF-ni chiqarishi mumkin, lekin IL-2 emas (Qo'shimcha rasm 2A). Garchi GrzmB+ hujayralarining umumiy chastotasi antigen stimulyatsiyasi bilan ortib ketmasa ham, TNF-sekret qiluvchi hujayralarni o'tkazish E{8}}maxsus CD4+ TILlar o'ziga xos bo'lmagan TILlarga qaraganda ko'proq saqlanadigan hujayra ichidagi GrzmBni o'z ichiga olganligini aniqladi (Qo'shimcha rasm 2B). ). IFN- – ajraladigan CD4+ TILlar, shuningdek, oʻsimta-reaktiv CD4+ TILlarning nashr etilgan imzolariga mos keladigan dasturlashtirilgan hujayra oʻlimi 1 (PD-1) koinhibitor belgisini ham ifodaladi (Qoʻshimcha rasm 2C) ( 18, 19). E{20}}maxsus CD4+ TILlar yuqori funktsional avidlikni namoyish etdi, chunki bu hujayralar 1 ug/ml dan kam peptid konsentrasiyalarida sitokinlarni ajratishi mumkin edi (3B-rasm). F12 TIL madaniyatining o'ziga xosligini aniqlash uchun biz asl E6 hovuzidagi 37 peptidning har biriga mos keladigan individual peptidlar bilan autolog B-LCLlarni impuls qildik (3-jadval). F12 dan CD{29}} TILlar E61-15 va E65-19 peptidlari bilan rag'batlantirilganda IFN- ajralib chiqadi, ular 11-aminokislota yadrosi ketma-ketligiga ega (Qo'shimcha rasm 2D). HLA blokirovka qiluvchi abs ishtirokida o'tkazilgan kokultura tajribalari B-LCL lar anti-HLA-DQ Abs bilan bloklangan, ammo anti-HLA-DR yoki izotip nazorat qiluvchi abs bilan bloklanganida TILlar tomonidan IFN-sekretsiyasi sezilarli darajada kamayganligini aniqladi (3C-rasm). Ushbu epitopning taqdimoti uchun qaysi HLA-DQ allellari mas'ul ekanligini aniqlash uchun biz ma'lum HLA-DQ allellarini ifodalovchi B-LCLlarni (Qo'shimcha jadval 4) E61-15 bilan impuls qildik va HLA-DQA1*01 ifodalovchi KAS011 hujayralari ekanligini aniqladik. :02 va DQB1*05:02, lekin DQA1*05:05 va DQB1*03:01 ifodalovchi Hu-195 B-LCL emas, TILlarga antigenni autolog Hu{{63} bilan solishtiradigan tarzda taqdim etishi mumkin. } B-LCLs (3D-rasm). Va nihoyat, biz ilgari aniqlangan TCR ketma-ketligi haqiqatan ham E6 tan olinishi uchun javobgar ekanligini tekshirishga harakat qildik. Insonning birlamchi sog'lom donor CD4+ T hujayralarida F12 TCR ifodalanishi E61-15 peptidini tanib olishga yordam berish uchun etarli bo'lgan, bu CD69 va PD-1 ko'tarilishidan dalolat beradi (3E-rasm). ). Birgalikda bu natijalar monoklonal CD{75}} TILlar tomonidan tan olingan HLA-DQ cheklangan E6 epitopining identifikatsiyasini ko‘rsatadi. E6-maxsus CD4+ T xujayralari MHC-II ifodalovchi otologik o'simta hujayralarini tanimaydi yoki o'ldirmaydi. Yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar ba'zi inson saratonlarida sitotoksik CD4+ TILlarning genetik belgilarini aniqladi (14, 15). Biroq, sitotoksik CD{82}} T hujayralari HPV tomonidan boshqariladigan saratonlarda rol o'ynaydimi yoki yo'qmi noma'lum. TILlardagi E{84}}maxsus CD4+ T hujayralari HNSCC-56 to'g'ridan-to'g'ri taniy oladimi yoki yo'qligini aniqlash uchun birinchi navbatda uning MHC-II ifoda holatini tekshirdik. O'simta hujayralari kulturada aniqlanmaydigan MHC-II sirtini ifodalamasa ham, MHC-II ning yuqori regulyatsiyasini qo'zg'atish uchun 72 soat davomida IFN- bilan davolash etarli edi (4A-rasm). Keyinchalik, biz HNSCC-56 CD4+ F12 TILlar bilan o'stirdik. Muhimi, IFN- bilan oldindan shartlangan MHC-II+ o'simta hujayralari IFN- sekretsiyasi bilan o'lchangan CD4+ TILlarni rag'batlantirishga qodir emas edi (4B-rasm).
1-rasm. HPV-16+ HNSCC dan E6-reaktiv CD4+ va CD8+ TILlarni aniqlash. (A)
2-rasm. HLA-A*02:01-cheklangan, Hu-56 TILlardan E6-maxsus TCRning funksional xarakteristikalari. (A)
Biroq, TIL qo'shilishidan oldin E61-15 bilan impulslangan IFN bilan davolash qilingan o'simta hujayralari T-hujayra reaktsiyasini rag'batlantirishga muvaffaq bo'ldi, bu endogen tarzda ifodalovchi hujayra chizig'ida cheklovchi HLA-DQ allellarining sirt ifodalanishini ko'rsatadi. E6 o'simtani aniqlash uchun etarli emas edi, lekin maqsadli peptidning ekzogen yuklanishini talab qildi. Ekzogen maqsadli peptid yuklanishining bir xil talabi MHC-II sirtining yuqori darajasini konstitutsiyaviy ravishda ifodalovchi CIITA transduktsiyali o'simta hujayralarida (HNSCC -56 CIITA) kuzatildi (4B-rasm). CD{8}} TILlar APCda E6 epitopining endogen tarzda qayta ishlangan va taqdim etilgan versiyasini taniy oladimi yoki yo'qligini tekshirish uchun biz MHC-ga birlashtirilgan E6 ning dastlabki 50 ta aminokislotalarini kodlovchi ekspressiya konstruktsiyasi bilan autolog B-LCLlarni retrovirus tarzda transduktsiya qildik. I transmembran domeni (E6-MITD), bu plazma membranasiga birlashtirilgan aminokislotalar ketma-ketligini mahalliylashtirishni keltirib chiqaradi va endosoma savdosi orqali MHC-II taqdimotini qo'llab-quvvatlaydi (20). E6-MITD konstruksiyasini ifodalovchi B-LCLlar E6-maxsus CD4+ TILlarni rag‘batlantirishi mumkin, bu esa ushbu TILlar tomonidan tan olingan peptid epitopi tabiiy ravishda qayta ishlanishi va MHC-IIda taqdim etilishi mumkinligini ko‘rsatadi. tegishli yo'lga yo'naltirilgan (4C-rasm).
3-rasm. Klonal kengaytirilgan, HLA-DQ-cheklangan, E6-maxsus CD4+ TILlarning funksional xarakteristikalari. (A)
Keyinchalik, biz F12 E6-maxsus CD4+ TILlarning bevosita o'simta sitotoksikligiga qodirligini aniqlashga harakat qildik. Tanib olish tahlillarimizdan olingan ma'lumotlarga muvofiq, E{3}}maxsus CD4+ TILlar MHC-II ni ifodalamaydigan HNSCC-56 o'simta hujayralarining o'sishini cheklay olmadi (4D-rasm) . Bundan tashqari, HNSCC-56 CIITA o'simta hujayralari ham CD4+ TILlar ishtirokida to'sqinliksiz o'sdi. Biroq, E61-15 peptid bilan impulslangan HNSCC-56 CIITA o'simta hujayralarining o'sishi effektor hujayra dozasiga bog'liq tarzda inhibe qilingan. Umuman olganda, bu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, HNSCC-56 CD8+ T hujayralariga E6 epitoplarini taqdim eta olsa ham, E6-maxsus CD4+ TILlar MHC-ni to'g'ridan-to'g'ri taniy olmaydi va lizlaydi. II+ otologik o'simta hujayralari. Antigen taqdimotida ishtirok etadigan genlar ko'pincha saraton kasalligida mutatsiyaga uchraydi, bu T hujayralari tomonidan tan olinishiga to'sqinlik qilishi mumkin (21). HNSCC{21}} o'simta hujayralarida MHC-IIda antigen paydo bo'lishiga xalaqit beradigan har qanday somatik mutatsiyalar mavjudligini aniqlash uchun biz mos yozuvlar namunasi sifatida Hu-56 o'simta hujayralari va PBMClarning butun ekzoma ketma-ketligini o'tkazdik. Aniqlangan 104 ta sinonim bo'lmagan somatik mutatsiyadan MHC-II taqdimot yo'lining tarkibiy qismlarida, jumladan HLADMA, HLADMB va CD74da aniq mutatsiyalar yo'q edi (5-jadval). Pankreatik kanal adenokarsinomasi bo'lgan bemorning qonidan HLA-DRB5 * 01: 01 - cheklangan, KRASG12V-ga xos TCRni aniqlash. Ushbu natijalardan so'ng biz o'simta hujayralarining MHC-II ga antijeni taqdim eta olmasligi boshqa onkogenlar uchun to'g'ri yoki yo'qligini aniqlashga kirishdik. Saraton bilan og'rigan odamda aylanib yuruvchi o'simtaga xos T hujayralari aniqlanganligini hisobga olib (8, 22), biz peptidlar hovuziga ega bo'lgan oshqozon osti bezi kanali adenokarsinomasi (Hu-66) bilan og'rigan bemorning PBMClarini rag'batlantirdik (1-jadval). ELISPOT tomonidan tegishli T hujayralari javoblarini aniqlash uchun individual peptidlar bilan qayta tiklashdan oldin 14 kun davomida umumiy onkogen mutatsiyalarga mos keladigan (6-qo'shimcha jadval). Ushbu natijalar KRASG12V ga qarshi qaratilgan T-hujayra javobining mavjudligini ko'rsatdi, bu KRASG12V aminokislotalari 1-15 ga javoban fonda IFN-dog'lar sonining ko'payishi bilan tasdiqlanadi (5A-rasm). Ushbu javob bilan bog'liq bo'lgan tegishli TCRlarni aniqlash uchun biz yana IFN---sekret qiluvchi hujayralarni saralash uchun sitokin sekretsiyasi tahlilidan foydalandik. Sitokin sekretsiyasi tahlili KRASG12V bilan qayta tiklashga javoban CD4+ T hujayralari tomonidan IFN-ning o'ziga xos ishlab chiqarilishini aniqladi (5B-rasm). Saralangan IFN--sekret qiluvchi hujayralardagi TCR zanjirlarini ushbu bemorning kengaytirilmagan PBMClarida mavjud bo'lganlar bilan taqqoslash ikkala populyatsiyada eng yuqori chastotada mavjud bo'lgan yagona TCR klonotipini aniqladi (5C-rasm va 2-jadval). Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, ushbu T-hujayra klonining chastotasi PBMClarda boshlang'ich darajada kengaytirilgan, bu bizning kengayish madaniyatimizda in vitro tayyorlashdan ko'ra tabiiy ravishda paydo bo'ladigan in vivo javobdan dalolat beradi. Ushbu TCR ning antigen o'ziga xosligini tekshirish uchun biz uni birlamchi inson CD{60}} T hujayralarida retrovirus transduktsiya yo'li bilan ifodaladik va bu hujayralarni mutant KRASG12V yoki mos keladigan WT peptid bilan impulslangan otologik B-LCLlar bilan o'stirdik. Mutant bilan rag'batlantirilganda, WT, KRAS peptidi emas, balki bu TCR KRASG12V uchun o'ziga xosligini tasdiqlovchi muhandislik T hujayralari IFN-ni chiqaradi (5D-rasm). E6 TCR natijalariga muvofiq, KRASG12V-ga xos TCRni ifodalovchi muhandislik T-hujayralari ham MITD qo'shilishi orqali endosomaga yo'naltirilgan WT KRAS emas, balki KRASG12V fragmentini ifodalovchi B-LCLlarni taniy oldi. TCR endogen tarzda qayta ishlangan va taqdim etilgan antigenni taniydi (5D-rasm).
4-rasm. Otolog o'simta hujayralari CD4+ T hujayralarida MHC-IIda endogen E61-15 ni ko'rsatmaydi. (A)
Shakl 5. Pankreatik kanal adenokarsinomasi bo'lgan bemorning qonidan HLA-DRB5*01:01-cheklangan, KRASG12V-ga xos TCRni aniqlash. (A)
Cheklovchi HLA allelini aniqlash uchun biz HLA genlarining turli kombinatsiyalarini ifodalovchi B-LCLlar yordamida peptid stimulyatsiya tajribalarini takrorladik. Umumiy HLA-B7-DR15-DQ6 haplotipini ifodalovchi B-LCLlar ishlab chiqilgan T-hujayralarini rag'batlantirishi mumkin, ammo bu allellarsiz B-LCLlar bu mumkin emas (5E-rasm). Oxir-oqibat, bu hujayralarni peptid impulsli IHW03304, inson HLA-DRB5 * 01:01 bilan transfektsiyalangan sichqonchaning DAP3 hujayra liniyasi orqali stimulyatsiyasi buni cheklovchi HLA molekulasi sifatida tasdiqladi (5F-rasm). MHC-II+ NCI-H2444 va DAN-G o'simta hujayralari CD4+ T hujayralarida KRASG12Vdan olingan epitopni ko'rsatmaydi. Keyinchalik, biz o'simta hujayralarining MHC-II da KRASG12V dan olingan epitoplarni to'g'ridan-to'g'ri taqdim etish qobiliyatini tekshirdik. Ushbu tadqiqotlar uchun HLA-mos keladigan MHC-II+ hujayra liniyalarini yaratish uchun biz CIITA va HLA-DRB5*01 kodlovchi konstruksiya bilan mos ravishda inson o‘pkasi va oshqozon osti bezi saratonidan olingan NCI-H2444 va DAN-G KRASG12V+ hujayra qatorlarini transduktsiya qildik: 01 kesilgan CD34 reportyor geni bilan (6A-rasm). Oldingi natijalarimizga muvofiq, cheklovchi HLA allelini ifodalovchi MHC-II+ o'simta hujayralari, agar maqsadli hujayralar birinchi marta ekzogen peptid bilan impuls qilinmasa, TCR tomonidan ishlab chiqilgan T hujayralarini rag'batlantira olmadi (6B-rasm). Muhimi, MHC-II taqdimot genlarida (masalan, HLADMA, HLADMB, CD74) NCI-H2444 yoki DAN-G uchun ommaviy ma'lumotlarda (23) ro'yxatga olingan somatik mutatsiyalar mavjud emas edi. NCI-H2444 CIITA hujayralari TCR tomonidan ishlab chiqilgan T hujayralari ishtirokida to'sqinliksiz o'sdi, KRASG12V peptidi bilan impulslangan NCI-H2444 CIITA hujayralari esa o'simta o'sishining kechikishini boshdan kechirdi (6C-rasm). HNSCC-56, CD{59}} uchun olingan natijalarga muvofiq, HLA-A*03:01-cheklangan, KRASG12Vga xos TCR (24) ifodalovchi CD{59}} T-hujayralari NCI-H2444 hujayralarini taniy oldi, ammo tan olmadi. HLA-A*03:01 ni ifodalovchi CaSki hujayralari, lekin KRASG12V emas (6D-rasm). Ushbu natijalar sitozolda mavjud bo'lgan aniq onkogen MHC-I da samarali taqdim etilganiga qaramay, MHC-II + o'simta hujayralari tomonidan ham taqdim etilmasligini ko'rsatadi. Dasturlashtirilgan hujayra o'limi ligand 1 (PD-L1) kabi koinhibitor ligandlarning o'simta hujayralari tomonidan ifodalanishi T hujayralarida TCR signalini cheklaydi (25). Ushbu mexanizm MHC-II+ o'simta hujayralarini CD{82}} T hujayralari tomonidan tan olinishiga to'sqinlik qilishi mumkinligini aniqlash uchun biz KRASG12Vga xos TCR yoki E{86}}maxsus TKRni ifodalovchi CD{83}} T hujayralarini o'stirdik. F12 TCR, mos ravishda NCI-H2444 CIITA va HNSCC-56 CIITA, anti-PD-L1 blokirovka qiluvchi Abs bilan yoki ularsiz. PD-L1/PD-1 o'zaro ta'sirini blokirovka qilish o'simta hujayralarini aniqlashni rivojlantirish uchun etarli emas edi (Qo'shimcha rasm 3). Xuddi shunday, anti-CD28 agonisti Ab qo'shilishi o'simta hujayralarini tanib olishni modulyatsiya qilmadi. Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, bu fenotip uchun mos ravishda koinhibitor yoki kostimulyator signallarning mavjudligi yoki yo'qligi emas, balki antigen taqdimotining etishmasligi. Ba'zi tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, plazma membranasidan olingan endogen oqsillar boshqa subhujayra bo'linmalari bilan solishtirganda taqdim etish uchun MHC-II ga yuklanadi (26). KRAS oqsillari ko'pincha lipid modifikatsiyalari orqali membranalar bilan bog'langan bo'lsa-da, ular transmembran domenini ifoda etmaydi va bu o'zaro ta'sirlar barqaror emas (3, 27). Shuning uchun biz KRASG12V ning immunogen fragmentini o‘simta hujayralarining plazma membranasiga bog‘lash CD4+ T hujayralari tomonidan antigenni to‘g‘ridan-to‘g‘ri tanib olish imkonini beradi, deb o‘yladik. Biroq, KRASG12V-MITD konstruktsiyasini ifodalovchi o'simta hujayralari, P2A bilan bog'langan EGFP muxbirining ifodasi bilan tasdiqlanganidek, xuddi shunday tarzda TCR tomonidan ishlab chiqilgan CD{109}} T hujayralarini rag'batlantira olmadi (4-rasm). Ushbu natijalar subcellular onkogenning lokalizatsiyasi MHC-II ning o'simta hujayralari tomonidan to'g'ridan-to'g'ri namoyon bo'lishining yagona hal qiluvchi omili emasligini ko'rsatadi. Bundan tashqari, bu natijalar antigenning haddan tashqari ifodalanishi MHC-II taqdimotini rag'batlantirish uchun etarli emasligini ko'rsatadi. Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, o'simtaga xos CD4+ T-hujayralari o'simta hujayralarining o'ziga qaraganda APClar tomonidan taqdim etilgan antigenlarni ko'proq taniydi. Shuning uchun biz HLADRB5*01:01+ DClarning ekzogen oqsillardan olingan antijenlarni taqdim etish qobiliyatini baholadik. In vitro ishlab chiqarilgan HLA mos keladigan DClar TCR tomonidan ishlab chiqilgan CD4+ T-hujayralarini KRASG12Vga xos TCRni ifodalovchi T-hujayralarni rag'batlantirishga qodir bo'lgan, qachonki yetilmagan DClar KRASG12V 20-mer peptid bilan impulslanganda yoki KRASG12V butun protein bilan oziqlanganda. KRAS WT oqsili emas (6E-rasm). Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, TCR o'simta hujayralari tomonidan taqdim etilgan endogen antigenlarni taniy olmasa ham, u DC kontekstida o'zaro taqdim etilgan ekzogen antigenlarni taniy oladi.
cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi
Munozara
Ushbu tadqiqotning maqsadi saraton kasalligi bilan og'rigan bemorlardan olingan tabiiy astarlangan T hujayralaridan ajratilgan TCRlar onkogenlarni ifodalovchi o'simta hujayralarini taniy oladimi yoki yo'qligini aniqlash edi. HNSCC TILlaridan olingan I (HLA-A*02:01) – cheklangan, HPV-16 E629-38 TCR sinfiga kelsak, tan olinishi, ehtimol, hayratlanarli bo'lmagan holda, autolog o'simta hujayralari qatori uchun tasdiqlangan. va yaxshi tavsiflangan HLA-moslashgan va E6-ekspressiv o'simta hujayrasi CaSki (muhimi, 2-rasmga qarang). Xuddi shu TILlar (1-rasm) E6-maxsus CD4+ IFN hosil qiluvchi sezilarli miqdordagi IFN hujayralarini ham o'z ichiga olgan (3-rasm), aksincha, E6- ni tanimagan. IFN-davolash yoki CIITA transduktsiyasi orqali to'g'ri taqdim etuvchi allelning (DQA1 * 01: 02 / DQB1 * 05: 02) keng sirt MHC klassini II ekspressiyasiga olib kelgan bo'lsa ham, o'simta hujayralarini ifodalaydi (4-rasm). CIITA ifodasi nafaqat MHC-II oqsillarining sirt ifodasini, balki antigenni qayta ishlash va taqdim etish uchun zarur bo'lgan HLA-DM va o'zgarmas zanjir molekulalarini ham qo'zg'atadi (28). HLA-mos keladigan B hujayralari, aksincha, antigen MHC-II yo'liga yo'naltirilganda ushbu TCR tomonidan tan olingan. Xuddi shunday holat KRASG12V-ga xos, HLA-DRB5*01:01-cheklangan, HLA-mos keladigan B hujayralarini taniy oladigan, ammo MHC-II-ekspressiv o'simta hujayralarini taniy oladigan TCR holatida ham kuzatilgan, antigen antigenga yo'naltirilganda. MHC-II taqdimot yo'li. Ikkala TCR ham yuqorida tavsiflangan sharoitlarda endogen tarzda ifodalangan antijenlarni tanib olishda vositachilik qilish uchun etarli funktsional avidlikka ega edi va ikkalasi ham peptid yuklangan maqsadli hujayralarning sitotoksikligiga vositachilik qilishi mumkin edi. Ushbu oxirgi kuzatuv sitotoksik CD4+ T hujayralari bo'yicha bir nechta hisobotlarda keltirilgan vaziyatni aks ettiradi, garchi bizning ma'lumotlarimiz ushbu kuzatuv kontekstini manba antijenining endogen ekspressiyasi va MHC-II ning IFN- tomonidan induksiyasini ko'rsatishi bilan kengaytiradi. yadro yoki membrana bilan bog'langan antigenlarga qarshi TCR uchun epiteliyadan olingan o'simta hujayralarida fiziologik maqsadni olish. Inson qovuq saratoni va melanomasi bo'yicha so'nggi tadqiqotlar TILlar orasida sitotoksik CD4+ T hujayralariga mos keladigan genetik belgilarni aniqladi (14, 15). Funktsional jihatdan, bu sitotoksik CD4+ TILlar MHC-II ga bog'liq bo'lgan o'simtalarni to'g'ridan-to'g'ri aniqlashga qodir, natijada ularning CD8+ hamkasblariga o'xshash tarzda granzimlar tomonidan maqsadli lizisga olib keladi. Biroq, bu topilmalarning terapevtik tarjimasi bir nechta qattiq o'smalarning MHC-II ni ifodalashi bilan cheklanishi mumkin. Darhaqiqat, 2 ta mustaqil tadqiqot natijalari shuni ko'rsatdiki, melanoma bilan og'rigan bemorlarning atigi uchdan birida MHC-II+ o'simta hujayralari mavjud va bu hujayralarning o'simtadagi chastotasi ko'pincha 10% dan kam (15, 29). Buning o'rniga, o'simta mikro muhitida MHC-II ning asosiy hujayrali manbai infiltratsiya qiluvchi leykotsitlar bo'lib ko'rinadi (26).
6-rasm. MHC-II+ KRASG12V+ o'simta hujayralari CD4+ T hujayralarida KRASG12Vdan olingan epitoplarni ko'rsatmaydi. (A)
Ba'zi qattiq o'simta hujayralari konstitutsiyaviy yoki induksiyalangan MHC-II ni ifodalashiga qaramasdan, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, TILlar va PBMClar orasida onkogenga xos CD{3}} T hujayralari mavjudligiga qaramay, bu hujayralar antigenni ifoda etuvchini to'g'ridan-to'g'ri taniy olmaydi va lizlaydi. MHC-II+ o'simta hujayralari, bir xil oqsildan olingan epitoplar esa MHC-I dagi CD{7}} T hujayralariga samarali tarzda taqdim etilishi mumkin (13). Bu shuni ko'rsatadiki, oddiygina maqsadli antigenni ifodalash MHC-II ni ifodalovchi o'smalar quyi to'plamini CD4+ T hujayralari tomonidan tan olinishi uchun etarli bo'lmasligi mumkin. Bundan tashqari, bu natijalar bir nechta o'sma turlari bo'yicha mos keladi, chunki ushbu tadqiqotda so'ralgan hujayra chiziqlari HNSCC, o'pka adenokarsinomasi va oshqozon osti bezi saratonidan olinganlarni o'z ichiga oladi. MHC-II ni tabiiy ravishda yoki CIITA transduktsiyasidan keyin ifodalovchi melanoma hujayralarining bevosita CD4+ T hujayralari tomonidan tan olinishi 2 ta tadqiqotda qayd etilgan (30, 31). Biroq, ushbu ikkala tadqiqotda ham sinovdan o'tgan TCRlarning muhim qismi o'simta hujayralarini to'g'ridan-to'g'ri tanimagan. Ushbu TCRlar o'simta antijenlarini tanimaydigan "ko'ruvchi" klonotiplarni yoki ushbu tadqiqotda ta'kidlanganlar kabi antigen taqdimoti kamchiliklari tufayli o'zlarining qarindosh antigenlarini taniy olmaydigan o'simtaga xos TCRlarni ifodalaydimi yoki yo'qmi, noaniq. Oliveira va boshqalar. (31) CD4+ T hujayralari tomonidan to'g'ridan-to'g'ri tan olinishi o'ta yuqori o'simta mutatsion yukiga ega bo'lgan 2 melanoma bilan cheklanganligini ko'rsatdi, bu fenotip MHC-II o'simta antijenlarini taqdim etish imkonini beruvchi qo'shimcha zarur o'zgarishlarni keltirib chiqarishi mumkinligini ko'rsatdi. KRASG12V ning immunogen fragmentiga MITD biriktirilishi CD4+ T hujayralari tomonidan o'simta hujayralarini to'g'ridan-to'g'ri tanib olishiga olib kelmasa ham, tadqiqotlar MHC-II dan elutsiya qilingan membrana bilan bog'langan oqsillardan olingan endogen peptidlar uchun noto'g'riligini tasvirlagan, ehtimol, membranani qayta ishlash tufayli (26, 32). Melanoma antijeni Trp1 plazma membranasida mavjud bo'lib, u B16 o'simta hujayralari tomonidan CD{29}} T hujayralariga to'g'ridan-to'g'ri tushishini osonlashtirishi mumkin (33). Melanoma bilan bog'liq bo'lgan yana bir antijen, gp100 o'simta hujayralari tomonidan CD{34}} T hujayralariga gp100 transmembran domeniga bog'liq bo'lgan tarzda taqdim etiladi (34). Sichqoncha sarkomasi modelidagi neoantigenga xos CD4+ T hujayralarining rolini o'rganuvchi so'nggi ishda mutatsiyaga uchragan integrin bo'linmasidan olingan epitoplar, shuningdek, membrana bilan bog'langan oqsil, MHC-II dan CIITA o'tkazgan o'simtadan elutsiya qilindi. hujayralar (35). Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, membrana bilan bog'langan oqsillar MHC-IIda to'g'ridan-to'g'ri taqdim etish uchun endosomalarga afzallik bilan o'tkazilishi mumkin bo'lsa-da, faqat immunogen membrana oqsilining mavjudligi bu taqdimotni rivojlantirish uchun etarli emas. Sitozolik yoki yadro oqsillarining MHC-II ga kirishiga imkon beradigan boshqa klassik bo'lmagan taqdimot yo'llari tasvirlangan, jumladan hujayra ichidagi oqsillarning autofagiya bilan bog'liq taqdimoti va antigenni qayta ishlash bilan bog'liq bo'lgan tashuvchining CD{48}} T hujayralariga taqdim etilishi, bu orqali antigenik peptidlar, ehtimol, membranani qayta ishlash jarayonida MHC-I dan MHC-II ga o'tkaziladi (36, 37). E7 epitoplari uchun xos bo'lgan CD4+ T hujayralari tomonidan autolog o'simta hujayralarining to'g'ridan-to'g'ri MHC-II ga bog'liq tan olinishi xabar qilingan (38, 39); ammo, bu tadqiqotlar ikkalasi ham HLA-DR molekulalarida bachadon bo'yni saratoni hujayralari tomonidan taqdim etilgan kamroq tarqalgan onkogen HPV subtiplari (masalan, HPV-33 va HPV-59) bilan ifodalangan E7 oqsillariga tegishli. Shuning uchun HPV subtipi, o'simta gistologiyasi va HLA allellarini cheklash ham MHC-II+ o'simta hujayralarida HPV yadroviy antijenlarining differentsial namoyishida muhim omillar bo'lishi mumkin. Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, to'g'ridan-to'g'ri o'simta sitotoksikligi E{64}} va KRASG12Vga xos CD4+ T hujayralarining ehtimoliy mexanizmi emas, CD4+ T hujayralarining boshqa antitumor mexanizmlari tasvirlangan va Saraton kasalligi bilan og'rigan bemorlarda o'simtaga xos CD4+ T hujayralarini qabul qilib o'tkazish antitumor faolligini ko'rsatdi (7, 40, 41). Shuning uchun, ushbu tadqiqotda aniqlanganlar kabi MHC-II cheklangan TCRlar inson bemorlarida ACT uchun foydali bo'lishi mumkin, chunki bunday TCRlar HLA haplotiplari bilan cheklangan haydovchi onkoproteinlaridan olingan epitoplarni nishonga olgan holda 1,27% va 16,10% AQSh White. HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 va HLA-DRB5*01:01 (42) uchun mos ravishda aholi soni. Shunisi e'tiborga loyiqki, CD4+ T hujayralari CD40L ga bog'liq holda antigen o'z ichiga olgan DClarni litsenziyalash orqali o'simtaga xos CD8+ T hujayralarini tayyorlashga yordam beradi (43-45). Biz ushbu tadqiqotda aniqlangan KRASG12V-ga xos TCR DC kontekstida o'zaro taqdim etilgan antijenlarni tanib olishini ko'rsatamiz, bu hujayralar ushbu funktsiya orqali o'smaga qarshi immunitetga hissa qo'shishi mumkinligini ko'rsatadi. CD4+ T hujayralari, shuningdek, IL-2 va IFN- kabi sitokinlarni ajratib, CD8+ T hujayralarining omon qolishini qo'llab-quvvatlab, o'simtalardagi CD8+ T hujayralariga mahalliy yordam berishi mumkin. o'simtaga jalb qilish (46). Bundan tashqari, CD{106}} TILlar makrofaglar kabi miyeloid hujayralardagi o‘sma mikromuhitidagi antijenlarni tanib olishi mumkin. Haqiqatan ham, klinikadan oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, o'simta hujayralarida MHC-II bo'lmasa, qabul qilingan Trp1 CD4+ T hujayralari baribir IFN-ga bog'liq o'smaga qarshi immunitetni qo'llashi va makrofaglarning sitotoksik faolligi oshishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin (47). Biroq, bu hodisa o'simta antijeni sekretsiyasiga bog'liq ko'rinadi, biz ko'pchilik onkogenlar uchun minimal deb taxmin qilamiz. Umuman olganda, bizning tadqiqotimiz endogen antigenlarning MHC-II+ o'simta hujayralari tomonidan to'g'ridan-to'g'ri taqdim etilishining selektivligini ta'kidlaydi va o'simta hujayralarini CD tomonidan to'g'ridan-to'g'ri tanib olish uchun CIITA ifodasi ham, membrana bilan bog'langan antigenning mavjudligi ham etarli emasligini ko'rsatadi{{115} } T hujayralari. Saratondagi CD4+ T hujayralarining kontekstga bog'liq rolini to'liq tushunish uchun qaysi antigenlarni MHC-II+ o'simta hujayralari qanday sharoitlarda to'g'ridan-to'g'ri taqdim etishini tavsiflash uchun ko'proq tadqiqotlar talab etiladi.
cistanche o'simlik - immunitet tizimini oshiradi
Usullari
Hujayra madaniyati. TILlar yig'ib olingan va yuqorida tavsiflanganidek ekilgan (48). Qisqacha aytganda, birlamchi o'simta to'qimasi 2–3 mm bo'laklarga ajratildi, ular 24-quduq plastinkasiga joylashtirildi va 1{{102}}% bilan to'ldirilgan RPMI-1640 da yetishtirildi. inson AB zardobi, penitsillin-streptomitsin, HEPES, gentamitsin va 6,000 IU/ml IL-2. Ekstravazatsiyalangan TILlar har 2-3 kunda yarim media almashtirish orqali ekilgan. Periferik qondan olingan birlamchi inson T-hujayralari 50% AIM V va 50% RPMI-1640, 10% inson AB zardobi, penitsillin-streptomitsin (100 U/) bilan toʻldirilgan 50:50 muhitda yetishtirildi. Har biri ml; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 300 IU/ml IL-2, 5 ng/ml IL-7 va 5 ng/ml IL-15. Bemordan olingan o'simta hujayralari liniyalari ilgari ta'riflanganidek hosil qilingan va ekilgan (17). Qisqacha aytganda, birlamchi o'simta to'qimasi 2 mm dan kichik bo'laklarga bo'lingan va GentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) yordamida ajratilgan. O'simta hujayralari 5 mkM Rho kinaz inhibitori bo'lgan F-Media ichida qayta suspenziya qilindi va nurlangan 3T3 fibroblastlar (30 Gy) to'shagiga qo'yildi. Dastlabki madaniyatdan so'ng o'simta hujayralari 3:1 nisbatda nurlangan 3T3-konditsioner muhit va tarkibida 5 mkM Rhokinaz inhibitori bo'lgan F-Media aralashmasida ko'paytirildi. CaSki (ATCC), NCI-H2444 (ATCC), DAN-G (ATCC), J76 Jurkat (ATCC), 3T{46}}CD40L va B-LCLlar l-glutamin va HEPES bilan to'ldirilgan RPMI muhitida saqlangan. 10 mM; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 10% FBS, 1 mM natriy piruvat (Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1 × MEM muhim bo'lmagan aminokislotalar (Gibco, Thermo Fisher Scientific) va penitsillin-streptomy (1000) har biri ml; Gibco). Biz 10% FBS va penitsillin-streptomitsin (har biri 100 U/ml; Gibco, Thermo Fisher Scientific) bilan DMEM muhiti qo'shimchasida 293GP (ATCC) ni saqladik. IHW03304, GM3107, KAS011, D8 va D66 hujayralari Alessandro Settedan (La Jolla immunologiya instituti) sovg'alar edi. ELISPOT tahlillari. TILlar yoki PBMClar antiIFN- Abs (1-D1K, Mabtech) bilan qoplangan ELISPOT plastinalarida har bir quduqda 100,{67}} hujayra bilan qoplangan. Hujayralar HPV-16 E6 va E7 PepMix (JPT) peptid hovuzlari, tanlangan onkogen mutatsiyalarni ifodalovchi peptid hovuzlari yoki ko'rsatilgan individual peptidlar bilan 22 soat davomida hovuzlar uchun 5 ug/ml yoki peptidlar uchun 10 ug/ml bilan qayta stimulyatsiya qilingan. ELISPOT plitalari ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq (Mabtech). Ijobiy nazorat uchun 5 ug/ml fitohemagglutinin-L ishlatilgan. Ex vivo kengaytirish madaniyati. PBMClar 5 ug/ml da tanlangan onkogen mutatsiyalarni ifodalovchi peptid hovuzi bilan qoplangan. 4, 7 va 10-kunlarda 10 IU/ml IL-2 o'z ichiga olgan yangi muhit qo'shildi. 14-kuni PBMC'lar ELISPOT yoki sitokin sekretsiyasi tahlillarida foydalanish uchun qayta stimulyatsiya qilindi. TCR ketma-ketligi. TILlar yoki PBMClar 5 ug/ml HPV-16 E6 PepMix (JPT) yoki KRASG12V peptidlari bilan qayta stimulyatsiya qilindi va IFN- salgılayan hujayralar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq (Miltenyi Biotec) Inson IFN-Sekretsiya tahlili to'plamidan foydalangan holda floresan belgilar bilan belgilandi. . Yagona IFN- + hujayralari FACSAria (BD Biosciences) yordamida 96-quduq plastinkasiga saralandi va RNK-seq bog‘langan TCR va zanjirlarni aniqlash uchun Illumina Miseq yordamida amalga oshirildi. E{94}}maxsus CD4+ TCR klonini identifikatsiya qilish uchun IFN-sekret qiluvchi hujayralar yuqoridagidek saralangan va TCR va TCR ketma-ketliklari avval tavsiflanganidek, ichki, multiplekslangan PCR orqali kuchaytirilgan (49). PCR mahsulotlari Sanger sekvensiyasi (ETON Biosciences) uchun taqdim etildi. TCR chastotasini tahlil qilish uchun PBMCs 14-kun oldin va keyin koʻrsatilgan peptidlar bilan ex vivo kengayishi Adaptive Biotechnologies kompaniyasiga yuborildi. HPV ifodasini tahlil qilish. RNK Hu{99}} birlamchi o'simta hujayralari va o'simta hujayralari qatoridan ajratib olindi va ommaviy RNK-seq uchun taqdim etildi. Juftlangan sekvensiya oʻqishlari BWA (v0.7.12) (50) yordamida HPV toʻliq genomiga (GenBank kirish № NC_001526.2) va uning mos keladigan transkriptomiga koʻrsatilgan. Olingan ketma-ketlikni tekislash xaritasi fayli tartiblangan ikkilik hizalama xaritasiga aylantirildi va indekslandi, so'ngra SAMtools (v1.2) (50) yordamida xaritalangan o'qishlarni hisoblash. Butun ekzoma ketma-ketligi. Butun ekzoma ketma-ketligi va RNK-seq mos ravishda Agilent butun ekzoma ushlash va Illumina to'plamlari yordamida La Jolla Immunologiya Sequence Core institutida amalga oshirildi. FFPE bionamunalari Mures saraton markazi tomonidan periferik qon namunalari yordamida mos mos yozuvlar DNK bilan birga keyingi avlod sekvensiyasi uchun Tempusga tarqatildi. O'simtaning ekzoma ketma-ketligidan olingan ketma-ketlik ko'rsatkichlari va normal namunalar SpeedSeq Align (v0.1.0) (51) yordamida GRCh38 mos yozuvlar genomiga moslashtirildi. Ekzom variantlari SpeedSeq Somatic yordamida aniqlangan va variantlar SNPeff (v4.3i) (52) yordamida izohlangan. Ushbu qo'lyozma uchun RNK-Seq va butun ekzoma ketma-ketligi ma'lumotlari NCBI BioProject, kirish raqami PRJNA924789ga yuklangan. T hujayralarining retrovirus transduktsiyasi. TCR nukleotidlari ketma-ketligi BioXP 3200 (Codex) yordamida MSGV1 retrovirus magistralida sintez qilindi va klonlandi. Ketma-ketlik kodon inson hujayralarida ifodalash uchun optimallashtirilgan. Inson TCR doimiy hududlari sirt ifodasini yaxshilash va imtiyozli juftlikni rag'batlantirish uchun almashtirishlar bilan sichqoncha TCR doimiy hududlariga almashtirildi (53, 54). Inson PBMC'lari buffy paltolardan ajratilgan. CD4+ yoki CD8+ T hujayralari magnit tanlash yo‘li bilan olib tashlandi va qolgan barcha limfotsitlarni o‘z ichiga olgan manfiy fraksiya T hujayrali muhitda 50 ng/ml anti-CD3 Ab (OKT3) bilan 2 marta yetishtirildi. kunlar.
Cistanche tubulosa-Antitumorning foydalari
TCR retrovirus supernatantlari tegishli TCR ketma-ketligi va RD113 plazmidini o'z ichiga olgan MSGV1 vektori bilan 293GP hujayralarining kotransfeksiyasi orqali hosil qilingan. Transfeksiyadan ikki kun o'tgach, retrovirus supernatantlar yig'ib olindi va yangi yoki muzlatilgan holda -80 darajada foydalanildi. Transduktsiyalar RetroNectin bilan qoplangan plitalarda (Takara) yuqorida tavsiflanganidek amalga oshirildi (5). Murin TCR doimiy mintaqasi ifodasi transdüksiya samaradorligini aniqlash uchun oqim sitometriyasi bilan baholandi. TCR tomonidan ishlab chiqilgan T hujayralari dastlabki stimulyatsiya qilinganidan keyin 7-kundan kechiktirmay ishlatilgan. T hujayralarining funktsional tahlillari. Biz 5 × 104 TIL, transduktsiyalangan T-hujayralari yoki J76 Jurkat hujayralarini 1 × 105 B-LCL bilan bir kechada pulsatsiyalangan peptid yoki 5 × 103 o'simta hujayralarining ko'rsatilgan konsentratsiyasi bilan bir kechada kokultura qildik {{16} }quduq U-pastki yoki tekis pastki plitalar, mos ravishda. Belgilangan hollarda anti-CD28 agonisti (klon CD28.2, BioLegend) yoki anti-PD-L1 blokirovkasi (klon 29E.2A3, BioLegend) Abs mos ravishda 5 va 10 ug/ml T hujayra va o'simta hujayralari kokulturalariga qo'shildi. Sitokin va faollashuv markerini tahlil qilish uchun ijobiy nazorat sifatida PMA va ionomitsinni o'z ichiga olgan 1 × hujayra faollashtirish kokteyli (BioLegend) ishlatilgan. HLA blokirovkasini tadqiq qilish uchun peptid impulsli B-LCLlarga T hujayralari qo'shilishidan kamida 2 soat oldin quyidagi Abs ning 20 ug/ml qo'shilgan: anti-HLA-DQ (Tü169, BioLegend), anti-HLA-DR (L243, BioLegend) yoki sichqonchaning IgG2a izotipini boshqarish (MOPC-173, BioLegend). Belgilangan hollarda, o'simta hujayralari T hujayralari qo'shilishidan oldin 10 ng / ml rekombinant IFN- bilan 72 soat davomida o'stirildi. Supernatantlar 18-24 soatdan keyin yig'ib olindi, IFN- ELISA (Thermo Fisher Scientific) tomonidan o'lchandi va hujayra pelletlari oqim sitometriyasi uchun bo'yaldi. Sitotoksiklik tahlillari ko'rsatilgan effektor-maqsad nisbatlarida o'simta hujayralari bilan T hujayralarining kokulturasi orqali amalga oshirildi. Qisqacha aytganda, 5 × 103 o'simta hujayralari ko'rsatilgan nisbatlarda T hujayralarini qo'shishdan oldin bir kechada ekilgan va ekilgan. Maqsadli hujayra lizisi xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (ACEA Biosciences) yordamida aniqlandi, u tajriba tugaguniga qadar har 30 daqiqada hujayra yopishishi sababli elektr impedansni baholadi. Ma'lumotlar xCELLigence RTCA dasturiy paketi yordamida tahlil qilindi va natijalar T hujayralari qo'shilgan paytda 1 ga normallashtirilgan hujayra indeksi sifatida xabar qilindi. MHC-II taqdimot tahlili. Quyidagilarni kodlaydigan sintetik DNK konstruksiyalari BioXP 3200 (Kodex) yordamida MSGV1 ga klonlandi va yaratildi: inson HLA-B genining N-terminal 25 aminokislotalari, keyin esa HPV-16 E6 ning dastlabki 50 ta aminokislotalari. yoki KRASG12V ning 25 aminokislotalari C-terminaliga birlashtirilgan 55 aminokislotalar inson HLA-B, T2A o'z-o'zidan ajraladigan elementi va EGFP kodlash ketma-ketligi. Virusli supernatantlar yuqorida ta'riflanganidek hosil bo'ldi va autolog B-LCL lar inson CD40L (3T3-CD40L) ni ifodalovchi nurlangan (0,5 Gy) 3T3 hujayralari to'shagida tun davomida stimulyatsiya qilingandan so'ng RetroNektin bilan qoplangan plitalarga o'tkazildi. Transduktsiya samaradorligi EGFP ifodasining oqim sitometrik miqdori bilan baholandi. O'tkazilgan B-LCLlar 3T{81}}CD40L bilan 200 IU/ml rekombinant inson IL-4 (PeproTech) ishtirokida, otolog TILlar bilan kokulturadan oldin 2-3 kunlik ketma-ket 2 raund davomida rag'batlantirildi. Antigen taqdimotini tahlil qilish uchun DC ni yaratish. DClar plastik yopishish usuli yordamida yaratilgan. Muzlatilgan PBMClar eritildi va doimiy to'g'ridan-to'g'ri muhitda (RPMI{88}} l-glutamin, 5% issiqlik bilan inaktivlangan inson AB zardobi va har bir penitsillin-streptomitsin bilan 100 U/ml) 37 darajada 2 soat davomida qoplandi. Yopishmagan hujayralar iliq PBS bilan yuvish orqali olib tashlandi va yopishgan hujayralar 6 kun davomida 800 U/ml GM-CSF (Tonbo, Cytek Biosciences) va 500 U/ml IL-4 (PeproTech) bilan to'ldirilgan DC muhitida yetishtirildi. . Biz bir kechada to'g'ridan-to'g'ri 1 ug / ml KRASG12V peptidini yoki 20 ug / ml KRASG12V yoki WT KRAS oqsilini (Abcam) qo'shdik. Ertasi kuni DC lar yig'ib olindi va oqim sitometriyasi orqali CD137 ko'tarilishini baholashdan oldin bir kechada 1: 1 nisbatda TCR tomonidan ishlab chiqilgan T hujayralari bilan kokulturatsiya qilindi. O'simta hujayralarining retrovirus transduktsiyasi. Inson CIITA kodlash ketma-ketligi Gibson Assambleyasi tomonidan sintez qilingan (Integrated DNK Technologies) va MSGV1 ga klonlangan. HLADRB5*01:01 kodlash ketma-ketliklari va P2A ketma-ketligi bilan ajratilgan zanjirlar sintez qilindi (Integrated DNK Technologies) va Gibson Assembly tomonidan kesilgan CD34 reportyor ketma-ketligidan so'ng T2A ketma-ketligidan yuqorida o'zgartirilgan pHAGE lentiviral vektorga klonlandi. Yuqorida aytib o'tilganidek, MSGV1 bilan retrovirus supernatantlari yaratilgan. Lentiviral supernatantlar 293T hujayralarining pHAGE, tat, rev, gag/pol va vsv-g plazmidlari bilan kotransfeksiyasi natijasida hosil bo'ldi. Virusli supernatantlar 24 soatdan keyin to'plangan va Amicon Ultra 5 naychalarida (MilliporeSigma) santrifüjlash orqali konsentratsiyalangan. O'simta hujayralari qoplangan va 1 kundan keyin muhit 10 ug / ml polibrene bilan to'ldirilgan retrovirus yoki lentiviral supernatant bilan almashtirildi. To'rt soat o'tgach, virus o'z ichiga olgan supernatant aspiratsiya qilindi va madaniy muhit bilan almashtirildi. MHC-II+ va CD{126}} o'simta hujayralari FACS Fusion hujayra tartiblagichi (BD Biosciences) yordamida saralangan. Oqim sitometriyasi. Hujayralar quyidagi antijenlarga ftorxrom bilan konjugatsiyalangan monoklonal Abs bilan belgilandi: insonga qarshi CD3-PE (OKT3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD4-PE-Cyanine7 (SK3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD8-APC (Hit8a, Tonbo). , Cytek Biosciences), CD34–Alexa Fluor 647 (581, BioLegend), CD69–PerCP– Cyanine5.5 (FN50, BioLegend), CD137–PE (4B4-1, Miltenyi Biotec), PD-1 –BV650 (EH12.2H7, BioLegend), HLA-II–APC (Tü39, BioLegend) va sichqonchaga qarshi TCR -APC (H57-597, Tonbo, Cytek Biosciences). O'lik hujayralar DAPI yoki LIVE/DEAD Fixable Aqua (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) bilan bo'yalgan. E629-38– HLA-A*02:01–PE tetrameri NIH Tetramer Core Facility tomonidan yig‘ilgan va etiketlangan. Hujayralar 1 ug/ml tetramer bilan 1 soat davomida muz ustida bo'yalgan. Muz ustida 15 daqiqa davomida sirt antijenlari uchun Ab binoni amalga oshirildi. Hujayra ichidagi sitokinlarni bo'yash (ICS) uchun T-hujayralar Brefeldin A ishtirokida 4-6 soat davomida peptid impulsli APClar bilan kokulturatsiya qilindi. Hujayralar o'tkazuvchanlashtirildi va sirt bo'yalganidan keyin Cytofix/Cytoperm Kit (BD Biosciences) bilan hujayra ichidagi sitokinlar uchun bo'yalgan. , ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq. Quyidagi ftorxrom konjugatsiyalangan abs sitokinlarni bo'yash uchun ishlatilgan: IFN- –APC (4S.B3, BioLegend), IL-2–FITC (MQ1- 17H12, BioLegend), TNF- –BV785 (Mab11) , BioLegend) va Granzyme B–PE (QA16A02, BioLegend). Ma'lumotlar FACSCelesta oqim sitometri (BD Biosciences) bilan olingan va FlowJo v10.7 dasturi bilan tahlil qilingan. Statistika. Statistik tahlillar Prism 8 (GraphPad Software) yordamida amalga oshirildi. ICS taqqoslashlari uchun juftlashtirilmagan 2-quyruqli t-testi ishlatilgan. HLA blokirovkasini Ab-Ab vositachiligida T hujayra signalizatsiyasini bostirishni solishtirish uchun ANOVA usuli ishlatilgan. P <0,05 statistik ahamiyatga ega deb hisoblandi. O'qishni tasdiqlash. Ushbu tadqiqotda foydalanilgan aniqlanmagan inson namunalari UCSD IRB protokoli 101391CX, "O'simta muhitini fenotiplash va hujayra izolyatsiyasi" orqali xabardor qilingan rozilik ostida olingan. Yozma ma'lumotli rozilik tadqiqotda ishtirok etgan shaxslar tomonidan berilgan.
Ma'lumotnomalar
1. Hanahan D, Weinberg RA. Saraton kasalligining belgilari: keyingi avlod. Hujayra. 2011;144(5):646–674.
2. Shamseddine AA va boshqalar. HPV bilan bog'liq saraton kasalliklari uchun o'sma immuniteti va immunoterapiya. Saraton Discov. 2021;11(8):1896–1912.
3. Simanshu DK va boshqalar. RAS oqsillari va ularning inson kasalliklarida regulyatorlari bo'yicha etakchi sharh. Hujayra. 2017;170(1):17–33. 4. De Vos Van Steenwijk PJ va boshqalar. HPV ga xos T hujayralarining kutilmagan darajada katta poliklonal repertuari bachadon bo'yni saratoni bilan og'rigan bemorlarda harakat qilishga tayyor. Saraton Res. 2010;70(7):2707–2717.
5. Stevanovic S va boshqalar. Virusli epiteliya saratonining muvaffaqiyatli immunoterapiyasida immunogen o'simta antijenlarining manzarasi. Fan. 2017;356(6334):200–205.
6. Bhatt KH va boshqalar. HPV{1}}o'ziga xos T-hujayra javoblarining profilini aniqlash orofaringeal saraton bemorlarida keng antigen reaktivligini ko'rsatadi. J Exp Med. 2020;217(10):e20200389.
7. Veatch JR va boshqalar. O'simtaga infiltratsiya qiluvchi BRAF V600E - o'ziga xos CD4 + T hujayralari melanomada to'liq klinik javob bilan bog'liq. J Clin Invest. 2018;128(4):1563–1568.
8. Veatch JR va boshqalar. Endogen CD{1}} T hujayralari o'pka saratoni bilan og'rigan bemorlarda neoantigenlarni, shu jumladan takroriy onkogen KRAS va ERBB2 (Her2) haydovchi mutatsiyalarini taniydi. Saraton Immunol Res. 2019;2(13):910–922.
9. Cafri G va boshqalar. Epiteliya saratoni bilan og'rigan bemorlarning periferik qonida aniqlangan onkogen mutatsiyalarga qaratilgan xotira T hujayralari. Nat Commun. 2019;10(1):449.
10. Tran E va boshqalar. Saraton kasalligida mutant KRASga mo'ljallangan T-hujayrali transfer terapiyasi. N Engl J Med. 2016;375(23):2255–2262.
11. Draper LM va boshqalar. HPV-16+ epitelial saraton hujayralarini E6 ga qarshi qaratilgan TCR gen-muhandisli T hujayralari tomonidan nishonga olish. Clin Cancer Res. 2015;21(19):4431–4439.
12. Jin BY va boshqalar. E7-ga mo'ljallangan ishlab chiqilgan T hujayralari sichqoncha modelida inson papillomavirusi saratonining regressiyasiga vositachilik qiladi. JCI Insight. 2018;3(8):e99488.
13. Bear AS va boshqalar. Mutant KRAS epitoplarining biokimyoviy va funktsional tavsifi bu onkoproteinni immunologik maqsadlilik uchun tasdiqlaydi. Nat Commun. 2021;12(1):4365.
14. Oh DY, va boshqalar. Intratumoral CD4+ T hujayralari odamning qovuq saratonida o'simtaga qarshi sitotoksiklikka vositachilik qiladi. Hujayra. 2020;181(7):1612–1625.
15. Cachot A va boshqalar. O'simtaga xos sitolitik CD4 T hujayralari inson saratoniga qarshi himoya immunitetiga vositachilik qiladi. Sci Adv. 2021;7(9):eabe3348.
16. Doran SL va boshqalar. Inson papillomavirusi bilan bog'liq epiteliya saratoni uchun T-hujayra retseptorlari gen terapiyasi: insonda birinchi, I/II faza tadqiqoti. J Clin Oncol. 2019;37(30):2759–2768.
17. Liu X va boshqalar. Inson bionamunalaridan oddiy va o'simta hujayralarini shartli qayta dasturlash va uzoq muddatli kengaytirish. Nat Protoc. 2017;12(2):439–451.
18. Veatch JR va boshqalar. Odam melanomasidagi neoantigenga xos CD4+ T hujayralari turli xil differensiatsiya holatiga ega va CD8+ T hujayralari, makrofaglar va B hujayralar funktsiyasi bilan bog'liq. Saraton hujayrasi. 2022;40(4):393–409.
19. Lowery FJ va boshqalar. Metastatik inson saratonidan antitumor neoantigen-reaktiv T hujayralarining molekulyar belgilari. Fan. 2022;375(6583):877–884.
20. Kreiter S va boshqalar. Antigenlarni MHC klass I savdo signallariga ulash orqali antigen taqdimoti samaradorligini oshirish. J Immunol. 2008;180(1):309–318.
21. Zaretskiy JM va boshqalar. Melanomada PD-1 blokadasiga orttirilgan qarshilik bilan bog'liq mutatsiyalar. N Engl J Med. 2016;375(9):819–829.
22. Gros A va boshqalar. Aylanma PD-1+ limfotsitlar orqali odamning oshqozon-ichak saratoni neoantigenlarini aniqlash. J Clin Invest. 2019;129(11):4992–5004.
23. Scholtalbers J va boshqalar. TCLP: HLA turi, bashorat qilingan neo-epitoplar, viruslar va genlar ifodasini birlashtirgan saraton hujayralarining onlayn katalogi. Genom Med. 2015;7(1):118.
24. Juneja V, Choi J, ixtirochilar; BioNTech US Inc., tayinlovchi. T-hujayra retseptorlari tuzilishi va ulardan foydalanish. AQSh Patenti No US202103040215A1. 2021 yil 4-noyabr.
25. Sharpe AH, Pauken KE. PD1 inhibitiv yo'lining turli funktsiyalari. Nat Rev Immunol. 2018;18(3):153–167.
26. Abelin JG va boshqalar. HLA-II ligandlarini qayta ishlash va massa spektrometriyasi bilan bog'lanish qoidalarini aniqlash saraton epitopini bashorat qilishni kuchaytiradi. Immunitet. 2019;51(4):766–779.
27. Silvius JR va boshqalar. K-ras4B va "ikkinchi signallari" bo'lmagan prenillangan oqsillar hujayra membranalari bilan dinamik ravishda bog'lanadi. Mol Biol hujayra. 2006;17(1):192–202.
28. Chang CH, Flavell RA. II sinf transaktivatori antigen taqdimotida ishtirok etadigan bir nechta genlarning ifodasini tartibga soladi. J Exp Med. 1995;181(2):765–767.
29. Rodig SJ va boshqalar. MHC oqsillari davolanmagan metastatik melanomada CTLA-4 va PD-1 blokadasiga differentsial sezgirlikni beradi. Sci Transl Med. 2018;10(450):eaar3342.
30. Ahmadzadeh M va boshqalar. O'simta infiltratsiya qiluvchi CD{2}} tartibga soluvchi T hujayralari aniq TCR repertuarini namoyish etadi va o'simta va neoantigen reaktivligini namoyish etadi. Sci Immunol. 2019;4(31):eaao4310.
31. Oliveira G va boshqalar. Melanomada yordamchi va tartibga soluvchi antitumor CD4+ T hujayralari manzarasi. Tabiat. 2022;605(7910):532–538.
32. Rok KL va boshqalar. O'zingizni taqdim eting! MHC sinf I va MHC sinf II molekulalari bo'yicha. Immunol tendentsiyalari. 2016;37(11):724–737.
33. Takechi Y va boshqalar. Melanosoma membranasi oqsili melanoma terapiyasi uchun hujayra sirtining maqsadi hisoblanadi. Clin Cancer Res. 1996;2(11):1837–1842.
34. Lepage S, Lapointe R. gp100 dan melanosomal maqsadli ketma-ketliklar MHC II klassi cheklangan endogen epitop taqdimoti va endosoma bo'linmalariga mobilizatsiya qilish uchun zarurdir. Saraton Res. 2006;66(4):2423–2432.
35. Alspach E va boshqalar. MHC-II neoantigenlari o'simta immunitetini va immunoterapiyaga javobni shakllantiradi. Tabiat. 2019;574(7780):696–701.
36. Dengjel J va boshqalar. Avtofagiya hujayra ichidagi manba oqsillaridan peptidlarning MHC II klassi taqdimotini rag'batlantiradi. Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102(22):7922–7927.
37. Matsuzaki J, va boshqalar. NY-ESO-1- o'ziga xos CD4+ T hujayralari tomonidan MHC II klassi cheklangan to'g'ridan-to'g'ri o'simtani aniqlash uchun klassik bo'lmagan antigenni qayta ishlash yo'llari talab qilinadi. Saraton Immunol Res. 2009;2(4):341–350.
38. Höhn H va boshqalar. Bachadon bo'yni saratonida CD4+ o'simta infiltratsiya qiluvchi limfotsitlar inson papillomavirusi-E7 tomonidan taqdim etilgan HLA-DR cheklangan peptidlarni taniydi. J Immunol. 1999;163(10):5715–5722.
39. Höhn H va boshqalar. Bachadon bo'yni saratonida o'simta infiltratsiya qiluvchi T hujayralariga HLA-DR * 0402 tomonidan taqdim etilgan inson papillomavirusi turi 33 E7 peptidlari. J Virol. 2000;74(14):6632–6636.
40. Lu YC va boshqalar. Metastatik saraton bilan og'rigan bemorlarni MAGE-A3 saraton germline antijenini maqsad qilgan II-cheklangan T-hujayra retseptorlari toifasidagi asosiy gistologik muvofiqlik kompleksi yordamida davolash. J Clin Oncol. 2017;35(29):3322–3329.
41. Tran E va boshqalar. Epiteliya saratoni bilan og'rigan bemorda mutatsiyaga xos CD4+ T hujayralariga asoslangan saraton immunoterapiyasi. Fan. 2014;344(6184):641–645.
42. Gonsales-Galarza FF va boshqalar. Allel chastotasi aniq ma'lumotlar bazasi (AFND) 2020 yangilanishi: oltin standart ma'lumotlar tasnifi, ochiq kirish genotip ma'lumotlari va yangi so'rov vositalari. Nuklein kislotalari Res. 2020;48(d1): D783–D788.
43. Schoenberger SP va boshqalar. Sitotoksik T-limfotsitlar uchun T-hujayra yordami CD40-CD40L o'zaro ta'siri orqali amalga oshiriladi. Tabiat. 1998;393(6684):480–483.
44. Ahrends T va boshqalar. CD4+ T hujayralari sitotoksik T hujayralari effektor dasturini ishlab chiqishda yordam beradi, shu jumladan koinhibitor retseptorlarni pastga regulyatsiya qilish va to'qimalarning invazivligini oshirish. Immunitet. 2017;47(5):848–861.
45. Ferris ST va boshqalar. cDC1 prime va CD4+ T hujayralari tomonidan o'simtaga qarshi immunitetni qo'zg'atish uchun litsenziyalangan. Tabiat. 2020;584(7822):624–629.
46. Bos R, Sherman LA. CD4+ T-limfotsitlarning to'planishi va sitolitik funktsiyasi uchun o'simta muhitida CD4+ T-hujayra yordami talab qilinadi. Saraton Res. 2010;70(21):8368–8377.
47. Haabeth OAW va boshqalar. CD4+ T xujayrasi - MHC sinf II-musbat o'simta hujayralarini vositachilik bilan rad etishi antigen sekretsiyasiga va xost APClarida bilvosita namoyon bo'lishiga bog'liq. Saraton Res. 2018;78(16):4573–4585.
48. Dudley ME va boshqalar. Melanomali bemorlar uchun qabul qiluvchi transfer terapiyasida foydalanish uchun o'simta-infiltratsiya qiluvchi limfotsitlar madaniyatini yaratish. J Immunother. 2003;26(4):332–342.
49. Dash P va boshqalar. T-hujayra retseptorlari repertuarining bir hujayrali tahlili. Usullari Mol Biol. 2015;1343:181–197.
50. Li H va boshqalar. Ketma-ketlikni tekislash/xarita formati va SAM vositalari. Bioinformatika. 2009;25(16):2078–2079.
51. Chiang C va boshqalar. SpeedSeq: o'ta tezkor shaxsiy genom tahlili va talqini. Nat usullari. 2015;12(10):966–968.
52. Cingolani P va boshqalar. Yagona nukleotid polimorfizmlarining ta'sirini izohlash va bashorat qilish dasturi, SnpEff: Drosophila melanogaster shtammi w1118 genomidagi SNPlar; iso-2; iso-3. Uchish (Ostin). 2012;6(2):80–92.
53. Haga-Fridman A va boshqalar. TCRga transmembranli hidrofobik mutatsiyalarning kiritilishi uning sirt ifodasini va T hujayralarining funktsional avidligini oshiradi. J Immunol. 2012;188(11):5538–5546.
54. Cohen CJ va boshqalar. Ikkinchi disulfid aloqasi bilan T-hujayra retseptorlarini ifodalash uchun yaratilgan T hujayralarining o'smaga qarshi faolligi. Saraton Res. 2007;67(8):3898–3903.
