TUNEL tahlili: Buyrak shikastlanishini baholash uchun kuchli vosita

Aloqa:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Annotatsiya:Terminal deoksinukleotidil transferaza dUTP nick-end labeling (TUNEL) tahlili endonukleazlar tomonidan hujayra o'limi bilan bog'liq DNK parchalanishini (3'-OH DNK termini) aniqlash uchun ishlatiladigan uzoq vaqtdan beri tasdiqlangan tahlildir. Ushbu fermentlar buyrakda ayniqsa faol bo'lganligi sababli, TUNEL DNK parchalanishi va hujayra o'limini aniqlash va aniqlash uchun keng qo'llaniladi.buyrak natijasida hosil bo'lgan hujayralar va hayvon va inson buyraklaritoksik yoki gipoksik shikastlanish. TUNELning apoptotik tahlil sifatida erta tavsiflanishi uning mexanizmlarini ko'plab noto'g'ri talqin qilishiga olib keldi.buyrak hujayrasi jarohat.Shunga qaramay, TUNEL tobora ommalashib bormoqdabuyrak shikastlanishibaholash, chunki u madaniyatli va to'qima hujayralarida va hujayra o'limining barcha mexanizmlarida universal tarzda qo'llanilishi mumkin. Bundan tashqari, u sezgir, aniq, miqdoriy, ma'lum hujayralar yoki to'qimalar bo'linmalari bilan osongina bog'langan va hujayra turlarini yoki hujayra o'limining mumkin bo'lgan mexanizmlarini ishonchli aniqlash imkonini beradigan immunohistokimyo bilan birlashtirilishi mumkin. An'anaga ko'ra, TUNEL tahlili TUNEL signalining mavjudligi yoki yo'qligi bilan cheklangan. Biroq, hujayra o'limi mexanizmi haqida qo'shimcha ma'lumotni TUNEL naqshlarini tahlil qilishdan olish mumkin.

jinsiy qo'zg'alish buyrak kasalliklarini cistanche qo'shimcha kukuni bilan davolash

Kirish DNK hujayradagi ta'mirlanishi mumkin bo'lgan yagona molekuladir, ammo zararlangandan keyin uni to'liq qayta sintezlab bo'lmaydi. DNKni yo'q qilish ko'p bosqichli hujayra o'limi jarayonining yakuniy bosqichlaridan biri bo'lib, DNKning terminal parchalanish nuqtasiga qadar potentsial ravishda qaytarilishi mumkin. Shuning uchun ikkinchisi qaytarilmas hujayra o'limining umumiy atributi va mexanik belgisidir [1,2]. Hujayra o'limi bilan bog'liq bo'lgan DNK parchalanishi odatda terminal deoksinukleotidil transferaza dUTP nick-end labeling (TUNEL) tahlili, DNK zinapoyasi yoki kometa tahlili [3] orqali "vizuallashtiriladi". Impulsli maydon elektroforezi [4] va tasodifiy oligonükleotid-astarlangan sintez (ROPS) tahlili [5] kamdan-kam qo'llaniladigan ikkita boshqa ikkilamchi tahlildir. Kometa tahlilidan foydalanish faqat in vitro (madaniy hujayralar) bilan cheklangan va uning miqdorini aniqlash ko'p mehnat talab qiladi [6]. Izolyatsiya qilingan hujayra yadrolarida kometa tahlillarini o'tkazish mumkin, ammo bu yadrolarni izolyatsiya qilish paytida qo'shimcha chalkash omillar bilan bog'liq. Ikkinchi, DNK zinapoyasi tahlili miqdoriy usul emas va zinapoya namunasi va smear mos ravishda apoptoz va nekrozni ajrata oladi degan dastlabki umid bu yondashuv ishonchsiz ekanligi isbotlanganligi sababli bekor qilindi [7]. Uchta asosiy usuldan TUNEL eng sezgir, eng kam vaqt talab qiluvchi va eng universali hisoblanadi. U madaniyatli hujayralar va to'qimalarda va barcha hujayra o'lim mexanizmlarida qo'llanilishi mumkin. Bu aniq, miqdoriy, ma'lum hujayralar yoki to'qimalar bo'linmalari bilan osongina bog'langan va TUNEL-musbat signallari bilan bog'liq hujayra turlarini yoki hujayra shikastlanishi mexanizmlarini ishonchli aniqlash imkonini berish uchun immunohistokimyo bilan birlashtirilishi mumkin [2].

TUNEL tomonidan o'lchanadigan DNK buzilishlari asosan apoptotik endonukleazlar tomonidan ishlab chiqariladi. Buyrakdagi eng faol endonukleazlar deoksiribonukleaza 1 (DNaz I) va endonukleaza G (EndoG)dir [8-10]. DNase I sutemizuvchilarda eng faol va ko'p apoptotik endonukleazadir [11]. Buyrak, tuprik bezlari, oshqozon osti bezi va ichak koʻp miqdorda DNaz I ishlab chiqaradigan organlardir. Tuprik bezlari, oshqozon osti bezi va ichakdagi epiteliy hujayralari ovqat hazm qilish traktida ovqat hazm qilish fermenti sifatida DNaz I ni chiqaradi. Ba'zi uyali DNase I xost hujayralariga bostirib kirgan "begona" DNKga qarshi kurashadi [12]. Yashirin bo'lmagan DNase I xost-hujayra DNKsi uchun yashirin xavf tug'diradi, lekin odatda DNazalar hujayra jarohati yoki o'limigacha xost-hujayra DNKsiga ta'sir qilmaydi. Buyrakda DNase I quvurli epiteliya hujayralari tomonidan chiqariladi, ehtimol siydikdagi viruslar va bakteriyalarni yo'q qilish uchun. Bu funktsiya, ehtimol, proteinazalar, xususan, siydikdagi asosiy proteinaza bo'lgan meprin bilan birgalikda amalga oshiriladi [13]. U infektsiyadan himoyalangan bo'lsa-da, buyrakda yuqori faol DNase mavjudligi bu organni shikastlanishga zaif qiladi, bu erda DNase faolligi xost hujayralari uchun sitotoksik ekanligi ma'lum. DNazalar toksik yoki gipoksik stimullar natijasida kelib chiqqan hujayra o'limini rag'batlantiradi va hujayra o'limi natijasida chiqarilgan barcha xost buyrak DNK hujayralarini yo'q qiladi.

Buyraklartanadan zaharli birikmalarni olib tashlaydigan filtrlovchi organlardir. Buyraklardagi yuqori DNaz I faolligi buyrak hujayralarini zaharli birikmalar va ularning metabolik mahsulotlarining shikastlanishiga juda sezgir qiladi. Bu TUNELni buyrak shikastlanishini o'lchash uchun eng to'g'ri va qo'llaniladigan usulga aylantiradi. Ushbu sharhda biz TUNELga buyrakdagi hujayralar o'limi va to'qimalarning shikastlanishini o'lchash uchun keng qo'llaniladigan, informatsion va aniq tahlil sifatida qaratamiz. Biz TUNELning buyrak kasalliklari va shikastlanishiga taalluqli jihatlarini muhokama qilamiz va buyrak kasalliklarini tadqiq qilish, diagnostika qilish va davolashda ushbu kuchli tahlildan unumli va to'g'ri foydalanishni rag'batlantirish uchun TUNELning sifatlari, usullari va kam qo'llanilgan xususiyatlarini aniqlaymiz. Shuningdek, biz hujayra o'lim mexanizmlari bilan bog'lanishi mumkin bo'lgan turli xil TUNEL tasvir naqshlarini muhokama qilamiz. Ushbu sharhda ko'tarilgan fikrlar TUNELni buyrakdan boshqa organlarda qo'llash uchun keng qo'llaniladi.

Kalit so‘zlar:TUNEL; hujayra o'limi; buyrak; DNazalar; endonukleazlar; to'qimalarning shikastlanishi

TUNEL tamoyillariTUNEL tahlili 1992 yilda Gorczyca va boshqalar tomonidan ishlab chiqilgan. [14] va Gavrieli va boshqalar. [15], mos ravishda ftoroxrom va avidin-peroksidaza belgilaridan foydalangan holda. O'sha paytda apoptozni baholashning yangi usullariga juda ehtiyoj bor edi va TUNEL bu bo'shliqni muvaffaqiyatli to'ldirdi. Dastlab apoptoz paytida yoki u bilan bog'liq bo'lgan DNK zanjirining uzilishi uchun tahlil sifatida sotilgan [14,16], yaxshiroq tahlillar bo'lmaganda, TUNEL tezda apoptoz uchun standart tahlilga aylandi [17,18]. Biroq, tadqiqotchilar TUNEL nafaqat apoptoz bilan bog'liq bo'lganini emas, balki har qanday DNK parchalanishini beg'araz o'lchaganini deyarli darhol tan oldilar [19-21]. Shunga qaramay, apoptotik tahlillarga bo'lgan ehtiyoj shunchalik katta ediki, TUNELning apoptoz uchun o'ziga xos bo'lmaganligi haqidagi kam uchraydigan xabarlar umuman e'tibordan chetda qoldi. Bu buyrak va boshqa organlarda apoptoz haqida juda ko'p noto'g'ri-ijobiy xabarlarning paydo bo'lishiga olib keldi, shu darajagacha jami hujayralarning 2{15}% gacha o'zgarganda ham jarohatlarsiz apoptoz haqida xabar berilgan [22-25]. 0,01 foizgacha kichik bo'lsa, to'qimalar shikastlanishining statistik jihatdan muhim dalili bo'lishi mumkin.

TUNEL tahlili bir necha yil oldin apoptoz tadqiqotlaridagi bum tugaganidan so'ng so'nggi yillarda uyg'onishni boshdan kechirdi. "Buyrak" va "TUNEL" atamalarini o'z ichiga olgan jurnal maqolalari bo'yicha PubMed qidiruvimiz 1992 yildan 2020 yilgacha 1500 dan ortiq natijalarni berdi. 2019 yilda 170 ta maqola chop etildi, bu so'nggi 28 yil ichida bir yil ichida eng yuqori ko'rsatkich (S1-rasm) va qaysi Ushbu ko'rib chiqish uchun so'ralgan maqolalarning aksariyatini tashkil qiladi. Ko'pgina tadqiqotlar apoptozdan tashqari hujayra o'limining boshqa turlarida DNK parchalanishi bilan bog'liq hujayra o'limining universal o'lchovi sifatida TUNEL-pozitivlikdan foydalangan. Masalan, sichqonlarda buyrak ishemiyasi-reperfuziyasi (IR) paytida yuzaga keladigan oksidlovchi shikastlanish natijasida yuzaga keladigan dasturlashtirilgan, apoptotik bo'lmagan hujayralar o'limining yangi kashf etilgan shakli bo'lgan ferroptoz TUNEL [26] tomonidan aniqlanishi mumkin. Apoptoz va nekrozdan ajralib turadigan dasturlashtirilgan hujayra o'limining yallig'lanish shakli bo'lgan piroptoz TUNEL-musbat signallar bilan bog'liqligi ko'rsatilgan [27,28]. Subtotal nefrektomiyaga duchor bo'lgan kalamushlarda buyrak tubulalari hujayralarining asta-sekin kamayishiga yordam beradigan nekroptoz paytida TUNEL-pozitivligi kuzatildi [29]. Buyrak va boshqa to'qimalarda ijobiy TUNEL signallari nekroz [30,31], tartibga solinmagan autofagiya [32-35], anoikis [36,37], mitotik falokat [35,38], avtoliz [39], pautolizda topilgan. [39], proptoz [40] va aponevroz [30], bu TUNELni qaytarib bo'lmaydigan hujayra o'limi uchun haqiqiy universal tahlil ekanligini ko'rsatadi.

TUNEL tahlili 3'OH uchlarini 3'OH-uchiga xos DNK fermenti terminal deoksinukleotidil transferaza (TdT) tomonidan belgilanishiga asoslanadi (rasm). TdT o'rniga DNK polimeraza yoki Klenow fragmenti DNK polimerazasini qo'llash 3'OH uchlari (nikslar, bo'shliqlar yoki o'ta oligolar) turini aniqlashga yordam beradi, chunki DNK polimerazalari shablonga muhtoj (qarama-qarshi DNK zanjiri) va shuning uchun ularni belgilamaydi. osilgan yoki chiqadigan DNK uchlari. Shuni yodda tutish kerakki, 3ZOH DNK uchlarini ishlab chiqarish apoptotik (DNKni buzuvchi) endonukleazlarga xos emas. 3'OH DNK uchlari asosiy "kommunikator" signali bo'lib, ko'pchilik DNK fermentlarining umumiy maxrajidir. Ular eukaryotlardagi deyarli barcha DNK fermentlari, jumladan DNKni tuzatuvchi (apurinik/apirimidinik, AP) endonukleazalar, ekzonukleazlar, DNK polimerazalar, DNK ligazalari, DNK transferazalar va topoizomerazlar tomonidan ishlab chiqariladi va foydalaniladi. Bundan tashqari, 3'Id 3z-shakar yoki 3z-oqsil konjugatlari mos ravishda fosfatazalar, glikosilazalar va proteinazlar tomonidan 3'OH terminiga aylanishi mumkin. Shuning uchun TUNELni muvaffaqiyatli qo'llash va uning natijalarini sharhlash uchun o'lchanayotgan narsani aniq tushunish kerak.

DNK parchalanishini o'lchashning boshqa ikkita asosiy usuli, DNK zinapoyasi va kometa tahlili bilan solishtirganda, TUNEL fragmentlarni emas, balki DNK uchlarini aniqlashga asoslanganligi bilan afzalliklarga ega (2-rasm). Nazariy jihatdan, TUNEL shocld DNK zinapoyasi yoki kometadan ko'ra boshlang'ich (past) DNK parchalanishini aniqlash uchun sezgirroq va chiziqli bo'ladi, ularning ikkalasi ham kichik yuqori harakatchan fragmentlarning to'planish davriga ega. Har holda, TUNELni kometa )41,42] yoki DNK zinapoyasi [43,44] bilan birlashtirgan tadqiqotlar maksimal sezuvchanlik bilan erta DNK parchalanishini ushlashning afzalliklariga ega.

TUNEL ilovalariTUNEL turli xil ilovalarda, jumladan tibbiy muolajalar [45], atrof-muhit [46], qishloq xo'jaligi [41] va sanoat [47] ta'sirlari va hayvonlarning [48] klinik va asosiy toksikologik tadqiqotlarida buyrak shikastlanishini aniqlash va miqdorini aniqlash uchun ishlatiladi. ] va oziq-ovqat fanlari [49]. TUNEL deyarli barcha turlarni o'z ichiga olgan DNK va DNazalarga ega bo'lgan barcha hujayralar, organlar va turlarga nisbatan qo'llaniladi. TUNEL ko'plab hayvonlarda, jumladan, zebrafish [50], yapon guruch baliqlari [51], tovuqlar [48], gerbillar [52], sichqonlar [41], kalamushlar [45] kabi hayvonlarning buyrak shikastlanishini aniqlash va miqdorini aniqlash uchun ishlatilgan. rabb its [53], mini-cho'chqalar [54] va odamlar [55]. TUNELning muhim afzalligi shundaki, u fiksatsiyalangan ekilgan hujayralar bilan bir qatorda qo'zg'almas to'qimalarda ham qo'llanilishi mumkin. Bu in vitro va in vivo natijalari o'rtasidagi taqqoslash uchun metodologik izchillikni ta'minlaydi, unda mexanizmlar madaniyatli buyrak hujayralarida tekshirilishi mumkin, in vivo oqibatlari esa hayvonlarning buyraklarida baholanadi. Butun hujayralar va to'qimalar o'rtasidagi har qanday narsa, shu jumladan kulturali hujayra sferoidlari [56] va ex vivo buyrak bo'laklari [57,58] ham ishlatilishi mumkin.

Signal kuchi yoki TUNEL-musbat hujayralar soni bo'yicha TUNEL intensivligi DNazalarning faolligiga qarab turlar orasida farq qilishi mumkin. Bizning tajribamizga ko'ra, kalamush buyragi sichqonchaning buyragiga qaraganda faolroq DNase Iga ega va TUNEL-musbat signal kuchi bunga mos keladi. Buyrakni boshqa organlar bilan taqqoslaganda, uning TUNEL-musbat signali juda kuchli va DNase I faolligi yuqori bo'lgan boshqa organlarga, masalan, ichak va tuprik beziga o'xshaydi. Spektrning boshqa tomonida, eng past TUNEL-musbat signal kuchi miya va o'simta/saraton hujayralarida kuzatiladi, bu erda DNase I ifodasi kodlash mintaqasida muqobil qo'shilish orqali inaktivlanadi [59]. TUNEL-musbat signal buyrakdagi barcha hujayra turlarida kuzatiladi. O'rtacha, quvurli epiteliy glomeruliyaga qaraganda tez-tez shikastlanadi, ayniqsa o'tkir jarohatlarda (3A-rasm). Bu ushbu turdagi hujayralarda ustun bo'lgan DNaz I faolligi bilan yaxshi bog'liq. Tajribalarimizda kuzatilgan jins va yosh farqlaridan kelib chiqqan holda, DNase I erkaklarda urg'ochi va o'rta yoshli hayvonlarga qaraganda keksa yoki yangi tug'ilgan hayvonlarga qaraganda ko'proq va faolroqdir. Biroq, TUNEL-pozitivligida jins yoki yoshga nisbatan aniq farq ko'rinmaydi, ehtimol, asosiy yoki boshqa omillar ustunlik qiladi. Ba'zi buyrak modellarida (masalan, ishemiya-reperfuziya) DNaz I induktsiya qilinadi [9]; boshqalarda esa bostirilmaydi va hatto bostirilishi ham mumkin (masalan, sisplatin toksikligida) [10]. Endonukleazlarning faollashishi, agar mavjud bo'lsa, buyrak shikastlanishidan keyin birinchi 24 soat ichida sodir bo'lishi ko'rsatilgan [9,60,61]. Shu sababli, ushbu sharhda buyrak tadqiqotida TUNEL qo'llanmalarining kamida yarmi o'tkir buyrak shikastlanishi (AKI) uchun ishlatilgani ajablanarli emas, chunki AKIni baholash ko'pincha endonukleazlar eng faol bo'lgan jarohatlardan keyin 24-72 soat ichida amalga oshiriladi. . AKI tadqiqotlari ro'yxati uzoq va toksik, septik, transplantatsiya va gipoksik shikastlanishlarni o'z ichiga oladi. Ushbu ishda biz ushbu tadqiqotlarda ta'sirlangan modellar, ta'sir turlari, davolash usullari, baholash vaqtlari va hujayra turlarini o'rganib chiqdik. So'rovda o'tkazilgan tadqiqotlar buyrak shikastlanishining o'tkir va aralash o'tkir-surunkali usullarini va surunkali buyrak kasalligini qamrab oldi.

TUNEL-musbat signal bilan buyrak shikastlanishi tubulalarda yoki glomerulusda kuzatiladimi, bu zarar etkazuvchi vosita yoki kasallikning turiga bog'liq. Masalan, odamlarda qizil yuguruk nefriti va nikel nanozarrachalarining shikastlanishi qat'iy glomerulyar TUNEL-musbat signallarga ega [62,63] sifatida tasvirlangan. Boshqa tomondan, kalamushlarda ishemiya-reperfuziya va streptozototsin sabab bo'lgan diabetik nefropatiya faqat tubulalarda TUNEL-musbat hujayralarni ishlab chiqardi [64,65]. Proksimal kanalchalar, Henle halqasi, distal kanalchalar va kollektiv kanallar ishemiya-reperfuzion modellarda ko'pincha TUNEL-musbat bo'ladi. Siklosporin A [66] va doksorubitsin [67] kabi dorilar yoki rux oksidi nanozarrachalari [68] kabi iste'mol mahsulotlariga ta'sir qilgan kalamushlarda ham glomeruli, ham tubulalardagi TUNEL-musbat hujayralar va qandli diabetning kalamush modelida tasvirlangan. 69]. Odamlarda septik shokdan kelib chiqqan AKI ham glomerulyar, ham quvurli TUNEL-musbat hujayralar bilan bog'liq edi [70]. strangulyatsiya qilingan yopiq halqali ingichka ichak tutilishi 3 soat ichida buyrakda TUNEL-pozitivlikni keltirib chiqardi [87].

AKI transplantatsiya va gipoksik jarohatlardan keyin paydo bo'lishi mumkin. Odamlarda allograftni rad etish odatda TUNEL-musbat hujayralarning ko'tarilishi bilan bog'liq [88,89]. Sovuq ishemiyadan so'ng, TUNEL-musbat hujayralar odatda reperfuziya paytida 2-24 soat ichida [90] yoki aniqroq, ishemiyadan keyin 14 va 17 soat ichida [91] kuzatilgan va ba'zida biz hali ham 7 kun ichida kuzatamiz. transplantatsiyani rad etish [92]. Xuddi shunday, ishemiya-reperfuziya modellarida TUNEL-musbat hujayralar ko'pincha reperfuziyadan 24 soat o'tgach [44,93,94] yoki 4 [95,96] va 72 soat [97] oralig'ida kuzatilgan. Transplantatsiya va ishemik AKI tadqiqotlarida TUNEL-musbat hujayralar distal va proksimal quvurli epiteliya hujayralarida lokalizatsiya qilingan [44,93]. Sichqonchadabuyraklarishemiya-reperfuzion shikastlanishdan so'ng, TUNEL-musbat hujayralar ishemik shikastlanishning odatiy maqsadi bo'lgan kortikomedulyar birikmada to'planganligi tasvirlangan [98].

Bir tadqiqotda zaharli ta'sirlar, kasallik holatlari va/yoki baholashlar o'tkir (ya'ni, soatlar, kunlar) va surunkali (ya'ni, haftalar, oylar, yillar) bo'lgan aralash o'tkir va surunkali shikastlanishlar odam transplantatsiyasida kuzatilgan. rad etish (transplantatsiyadan keyingi 1 haftadan 3 yilgacha biopsiya) [88], cho'chqa gepatiti E virusi infektsiyasi (inokulyatsiyadan 7 va 14 kun o'tgach) [52], gidronefrotiklarda CO2 pnevmoperitoneum tomonidan qo'zg'atilgan stressbuyraklar(2 hafta gidronefroz, pnevmoperitoneumdan 2 kun keyin) [53], ilon zahari qo'zg'atadigan mezangial proliferativ glomerulonefrit (in'ektsiyadan 1-14 kun o'tgach) [99], bir tomonlama siydik yo'llarining obstruktsiyasi (1-14 kunlik obstruktsiya) [100], uranil asetat bilan ta'sir qilish (1 dan 28 kungacha ta'sir qilish) [101], aristoxol kislotasi nefropatiyasi (5 va 30-kunlik ta'sir qilish) [102] va neonatal giperoksiya (tug'ruqdan keyingi 1 dan 60 kungacha sinovdan o'tgan, birinchi 14 yilda giperoksiyaga duchor bo'lgan) kunlar) [103]. Ta'sirdan o'n to'rt kun o'tgach, bu turdagi holatlar uchun juda keng tarqalgan baholash vaqtibuyrak shikastlanishlari[52,53,99,101,103]. Aksariyat hollarda TUNEL-musbat hujayralar tubulalarda va kollektiv kanallarda lokalizatsiya qilingan. Yagona istisno ilon zaharining toksikligi edi, bu birinchi navbatda glomeruliyaga zarar etkazdi [99].

Surunkalibuyrakmavjudligi sifatida aniqlanadigan kasallik (CKD).buyrak3 oydan ko'proq vaqt davomida odamlarda glomerulyar filtratsiya tezligining (GFR) shikastlanishi yoki kamayishi ham TUNELni baholash uchun keng tarqalgan mavzu bo'lib, u CKD progressiv bilan bog'liqligini aniqlashi mumkin.buyrak shikastlanishi.TUNEL qo'llaniladigan eng ko'p o'rganilgan CKD diabetik nefropatiyadir. TUNEL-pozitivligi bilan aniqlangan shikastlanish qandli diabet bilan og'rigan bemorlarda TUNEL testidan oldin 7 yildan 30 yilgacha [104,105] va kemiruvchilarda streptozotsin bilan davolashdan 2 dan 16 haftagacha [106,107] qandli diabet bilan kasallangan bemorlarda tubulalar va podotsitlarda paydo bo'lgan. Xuddi shunday TUNEL-musbat gistopatologiya immunoglobulin A nefropatiyasida ham qayd etilgan [22]. Qizil nefrit va membranoproliferativ glomerulonefritda TUNEL-pozitivligi asosan glomeruliyalarda kuzatilgan [62,108,109]. Boshqa tomondan, sisplatin [110], xlorokin [45], doksorubitsin [67], finasterid [23], takrolimus [111] va levetirasetam [24] ning dori xavfsizligini oʻrganishda asosan quvurli shikastlanish kuzatilgan. Xuddi shunday, TUNEL-musbat naychali hujayralar tomonidan aniqlangan davomli o'tkir shikastlanish siydik kislotasi nefropatiyasi [112], metionin etishmovchiligi [48], atrof-muhit toksinlari mikrosistin-LR [50] va kadmiy [113] ta'sirida tasvirlangan va kaltsiy-oksalat bilan bog'liqligibuyraktoshlar [114] va kalsifikatsiya qiluvchi nanozarralar [115]. TUNEL tahlilini qo'llash orqali CKD paytida buyrakning progressiv shikastlanishini aniqlash foydali diagnostika vositasi bo'lsa-da, TUNEL tahlilini immunohistokimyo (IHC) bilan birlashtirish shikastlanish mexanizmini aniqlashda yanada ma'lumotli bo'lishi mumkin.

TUNEL miqdorini aniqlash va kolokalizatsiya usullari

TUNEL miqdorini aniqlash usullari har xil. Ko'pgina hisobotlarda TUNEL-musbat hujayralar/yadrolar umumiy hujayralar/yadrolarning foizi sifatida aniqlanadi [83,116,117]. TUNEL-musbat hujayralar soni o'lik hujayralar soniga to'liq mos kelmasa-da, bu to'g'ri ko'rinadi. Ba'zi hujayralar DNK parchalanishining aniq darajasiga etmagan bo'lishi mumkin, boshqalari esa makrofaglar tomonidan yo'q qilingan bo'lishi mumkin. Kvadrat birlik (mm2) uchun TUNEL-musbat hujayralar sonini aniqlash ham qo'llaniladi [118], lekin bu usul kamroq aniq ko'rinadi, chunki u hududlarning joylashishi va hujayra turi tarkibiga bog'liq. Kortikal bo'limlarda asosan glomerullar, tubulalar, qon tomirlari va medullar nurlari, medullar bo'limlarida esa birinchi navbatda Henle halqalari, yig'ish kanallari va qon tomirlari mavjud. "Fifild uchun" miqdori, albatta, qaysi soha ekanligiga bog'liq [72,119] va "bo'lim uchun" miqdori aniqlanmagan [61,120]. "Gistologik ball" [121], "apoptotik indeks" [113], "apoptoz darajasi" [92], "apoptoz foizi" [122] yoki davolanmagan nazorat ulushi [123,124] kabi yomon aniqlangan o'lchovlar ko'rinadi. kamroq mos bo'lishi va talqinni qiyinlashtiradi va ko'pchilik tadqiqotlar bilan taqqoslanmaydi.

Qo'shni hujayralardagi hujayralar o'limi notekis boshlanadi, chunki u qon tomirlariga, hujayra aylanishiga va boshqa o'zgaruvchilarga bog'liq. Bu ko'pincha to'qimadagi hujayralarning notekis TUNEL bo'yalishiga olib keladi [45,96,125]. Ajablanarlisi shundaki, TUNEL-musbat signalning umumiy intensivligi DNKning parchalanish darajasiga bevosita bog'liq bo'lishiga qaramay, TUNEL o'lchash uchun ishlatilmaydi. Buning sababi, hujayralar TUNEL signalining intensivligidan qat'iy nazar o'lik deb hisoblanadi, chunki TUNEL bo'yalishi kuchliroq bo'lsa, hujayra "o'likroq" bo'lolmaydi. TUNEL natijalarini aniqlash uchun turli xil usullardan foydalanadigan tadqiqotlarni solishtirish qiyin bo'lsa-da, nazorat hayvonlarida TUNEL-musbat hujayralar miqdori odatda 2 foizdan past bo'ladi [75,99,100,116,126]. O'tkir shikastlanish TUNEL-pozitivlikning ~ 5-40 marta oshishi bilan bog'liq [79,126,127]. Surunkali shikastlanish vaqtida TUNEL-musbat hujayralarning o'sishi davolanmagan nazorat bilan solishtirganda biroz pastroq, ~2–20- barobar [29,43,65].

Diaminobenzidin (DAB) bo'yashga asoslangan dastlabki TUNEL tahlili yorug'lik mikroskopiyasi uchun mo'ljallangan [14,15]. Ushbu an'anaviy usul hali ham ushbu sharhda so'ralgan tadqiqotlarning uchdan ikki qismida va inson biopsiyasi tadqiqotlarining aksariyat qismida ishlatilgan. Miqdorni aniqlash hujayralarni qo'lda hisoblash orqali amalga oshiriladi va aniq bo'lsa-da, bu ko'p vaqt talab etadi. Ko'pincha miqdorni aniqlash umuman qo'llanilmaydi va natijalar hujayra o'limi sodir bo'lganligining oddiy dalili sifatida davolangan va bo'yalgan namunalar tasvirlari yordamida taqdim etiladi. Avtomatlashtirish miqdorni aniqlash jarayonini tezlashtirishi mumkin [128,129]. Biroq, DABni bir xil namunadagi boshqa har qanday bo'yash bilan birlashtirib bo'lmaydi, shuning uchun DAB-ga asoslangan TUNEL hujayra turini (vizual tanib olishdan tashqari) yoki hujayra o'lim mexanizmini aniqlamasdan faqat o'lik hujayralar sonini ta'minlashi mumkin.

Insoniy tadqiqotlar asosan yorug'lik mikroskopidan foydalangan holda DAB asosidagi TUNELga tayangan bo'lsa-da, hayvonlar tadqiqotlarining taxminan yarmi FL floresan mikroskopidan foydalanadi (3-rasm). Floresan TUNEL vizual jihatdan jozibali, oson talqin qilinishi mumkin va bir qancha muhim afzalliklarga ega. TUNEL-musbat yadrolarni yoki rangning o'rtacha intensivligini aniqlash orqali aniq miqdorni aniqlashga qo'shimcha ravishda, FL floresan TUNEL signali gistokimyo uchun boshqa ranglar (masalan, DAPI) (3A-rasm) yoki IHC (3B-rasm) bilan birlashtirilishi mumkin. Ikkinchisida protein markerlaridan foydalanish turli xil kasalliklar bilan bog'liq TUNEL-musbat signallarni aniqlashga yordam beradi.buyrakbo'limlar yoki hujayra o'limi turi haqida ma'lumot bering. Ikki marta IHC antikorlarini bo'yash bilan birlashtirilgan TUNEL misollarini topa olmadik. Bunday kombinatsiya juda ma'lumotli bo'lsa-da, masalan, ma'lum hujayra turlarida hujayra o'limi mexanizmini aniqlash uchun, bunday binoni bilan bog'liq texnik qiyinchiliklar foydadan ustun bo'lishi mumkin.

Identifikatsiya qilishbuyrakhujayra turi, albatta, tajribali uchun muammo emasbuyrakpatolog [104]. Shu sababli, hujayra turini aniqlash uchun qo'shimcha markerlardan foydalanish, masalan, endotelial hujayralarni aniqlash uchun CD31 dan foydalanish [130] kamdan-kam uchraydi. Biroq, to'qimalarning shikastlanishini tavsiflash uchun IHC protein markerlaridan foydalanish ko'pincha qo'llaniladi. Ko'pgina tadqiqotlar apoptozning yagona dalili sifatida TUNEL-pozitivlikdan foydalanadi. Boshqa tadqiqotlarda TUNEL-musbatligi apoptoz uchun xos emasligini tan olish apoptozni tasdiqlash uchun ko'plab morfologik (masalan, gematoksilin va eozin yoki davriy kislota-Schiff bo'yalishi), biokimyoviy va IHC belgilarini TUNEL bo'yash bilan birlashtirishga olib keldi. Kaspazaga bog'liq apoptoz uchun eng ko'p qo'llaniladigan marker to'liq o'lchamli kaspazani tanimaydigan antikor yordamida ajraladigan (faol) kaspaza-3 hisoblanadi-3 [131,132]. TUNEL va yirtilgan kaspaz-3 tahlillari kalamush ishemiya-reperfuziyasida glomerulyar emas, faqat quvurli bo'yashni ko'rsatdi [64]. Boshqa kaspaz tadqiqotlari kaspaz-1 [27], -9 [53], -11 [28] va -12 [75] ishlatilgan. Boshqa apoptotik belgilar Bcl-2 [27], Bcl2L1 [43], Bcl-xl [71], Bax [99], Bak [49] va Bad oqsillarining B-hujayrali limfoma 2 (Bcl2) oilasini o'z ichiga oladi. [43]; apoptotik retseptor Fas [52] va apoptotik retseptor-ligand FasL [66]; forkhead box (FOX) protein transkripsiya omillari Fox01 [133] va Fox03 [27]; va sitoxrom c [53]. Yallig'lanish o'simta nekrozi omil-alfa (TNF) ning IHC tomonidan aniqlangan [134]; o'simta o'sish omillari TGF [66] va TGF- 1 [135]; serin/treonin kinaz 1 (SGK1) [135]; elektron-transfer flavoprotein, beta-subbirlik (ETF) [136]; Yanus kinaz-2 (JAK2) [137]; signal transduseri va transkripsiya 3 faollashtiruvchisi (STAT3) [137]; faollashtirilgan B hujayralarining (NF-kB) yadro omili kappa-engil zanjir kuchaytirgichi [137] va uning inhibitori proteini IKB [137]. Uchunbuyrakjarohatni baholash, buyrak shikastlanishi molekulasi-1 (KIM-1) [24], aquaporin-1 kanali (AQP-1) [45], gipoksiya qoʻzgʻatuvchi omil {{7} }alfa transkripsiya omili (HIF-1 ) [103], Asc tipidagi aminokislota tashuvchisi-1 (Asc-1) [121], sutemizuvchilar uchun rapamitsin (mTOR) [131] kinaz maqsadi , va transglutaminaz II [89] ishlatilgan. Buyrakning oksidlovchi shikastlanishi 8-gidroksiguanozin (8OHdG) [102], neytrofil jelatinaza bilan bog'langan lipokalin (NGAL) [102], NADga bog'liq deasetilaz sirtuin-1 (SIRT1) [138] kabi markerlar yordamida o'rganildi. , va gem oksigenaza 1 (HO-1) [90]. Kinazalar, jumladan, c-Jun N-terminal kinaz (JNK) yo'li [101], fosfoinositid 3-kinaz/protein kinaz B/yadro omili eritroid 2-bog'liq 2 transkripsiya omili (PI3K/) jadal o'rganildi. Akt/Nrf2) yo'li [46], panneksin -1 (PANX1) plazma membranasi bo'shliq birikmasi oqsili [26] va mitogen bilan faollashtirilgan protein kinaz / hujayradan tashqari signal bilan boshqariladigan kinaz (MAPK / ERK) [26]. Apoptotik endonukleazlar bo'yicha tadqiqotlar kaspaza bilan faollashtirilgan DNase (SAPR) [139], DNase I [108] va EndoG [139] va DNKning shikastlanish belgilariga o'simta oqsili p53 (p53) [99] va dinamin bilan bog'liq protein 1 (PARP1) kiradi. ) [66]. Ba'zi tadkikotlar endoplazmatik retikulum stress vositachiligidagi apoptoz va to'qimalarning shikastlanishini baholashni ham foydali deb topdi [75].

So'ralgan ko'plab mexanik tadqiqotlar va hujayra o'lim mexanizmlarini aniqlash uchun TUNELni IHC markerlari bilan birlashtirishning afzalligi hisobga olinsa, ikkalasi o'rtasida kolokalizatsiyadan foydalangan holda ko'plab tadqiqotlar o'tkazilishi kutiladi. Tahlil TUNEL-musbat hujayralar va IHC belgilari o'rtasida piksel-piksel kolokalizatsiyasi, TUNEL-musbat hududlarda IHC markerining o'rtacha intensivligi yoki IHC belgisi-musbat hududlarda TUNEL-musbat signalning intensivligini bildirish orqali amalga oshirilishi mumkin. Afsuski, TUNELning bu afzalligi faqat bir nechta tadqiqotlarda ishlatilgan. TUNEL-musbat hujayralar yirtilgan kaspaza-3 bilan kolokalizatsiya qilindi.buyrakkalamushlarda asetaminofen toksikligi paytida tubulalar [74]. TUNEL-musbat signal bilan IHC kolokalizatsiyasi Habu nefrit [99] paytida mezangial hujayralarning o'limini aniqlashga imkon berdi. Ott va boshqalar xabar berganidek, yorug'lik mikroskopida, toksiklikning mexanik belgilari bilan kolokalizatsiya ketma-ket bo'limlarda amalga oshirildi. [89].

TUNEL muammolari va cheklovlari

TUNEL bilan ishlashda bir nechta mumkin bo'lgan muammolar yuzaga kelishi mumkin va ularni kutish kerak. Ulardan biri shundaki, 30OH DNK termini nafaqat endonukleaza ta'siri natijasida hujayra o'limida, balki DNK bilan deyarli barcha fermentativ reaktsiyalarda oddiy oraliq metabolit sifatida ham paydo bo'ladi. 30OH terminini ishlab chiqaradigan asosiy hujayra funktsiyasi bu DNK sintezi bo'lib, unda ko'plab Okazaki fragmentlari nazariy jihatdan noto'g'ri-musbat TUNEL signalini ishlab chiqishi mumkin, ayniqsa tahlilning yuqori sezgir modifikatsiyalarida. davomidabuyrak shikastlanishi,DNK ta'mirlanishi, shuningdek, AP endonukleaza ta'siri natijasida noto'g'ri TUNEL-musbat signallarga hissa qo'shishi mumkin. Kimyoviy (vodorod peroksid, bleomitsin) yoki jismoniy (gamma nurlanish) shikastlanishi natijasida kelib chiqqan massiv oksidlovchi buyrak shikastlanishi, endonukleaza vositachiligida DNK parchalanishidan tashqari, noto'g'ri-musbat TUNEL ko'rsatkichlarini oshirishi mumkin.

Ko'pincha va ko'proq ehtimol, TdT reaktsiyasining noto'g'ri o'rnatilgan eksperimental shartlari (vaqt, harorat, fermentativ faollik yoki kofaktorlar) sun'iy ravishda ko'tarilgan TUNEL-musbat signal foniga olib kelishi mumkin. Davolanmagan buyrak to'qimalari namunalari uchun normaning asosiy darajasi nima ekanligi aniqlanmagan bo'lsa-da, umumiy hujayralarning taxminan 1 foizi o'rtacha raqam bo'lishi mumkin. Albatta, 10 foiz yoki undan yuqori fon aniqlanmagan va aniqlanmagan tahlil shartlari yoki namunani saqlash shartlaridan chetga chiqishning aniq dalilidir.

Kutish kerak bo'lgan yana bir muammo - bu ba'zi hujayralar turlarida (masalan, endoteliy) past DNaz I faolligi,buyrakbo'limlar (masalan, glomeruli) yoki patologik to'qimalar (masalan, o'smalar). Bu hujayralar TUNELning past pozitivligini ko'rsatishini kutish kerak, chunki ular jarohatlarga chidamli bo'lganligi uchun emas, balki TUNELda o'lchanadigan signalni ishlab chiqarish uchun etarli endonukleaza faolligi yo'qligi sababli. Bizning tajribamizga ko'ra, hatto TUNEL musbat hujayralarining {0}}.01 foizdan 0,1 foizigacha bo'lgan o'zgarishlar statistik jihatdan ahamiyatli bo'lishi mumkin va buyrak (boshqa to'qimalar) shikastlanishining ishonchli dalili sifatida ishlatilishi mumkin.

Va nihoyat, DNK parchalanishining miqdori juda yuqori bo'lsa, masalan, hujayra o'limining kech bosqichlarida yoki yuqori intensiv jarohatlarda, qolgan DNKni DAPI bilan to'g'ri ravishda bo'yash mumkin bo'lmaganda, TUNEL bo'yashining miqdorini aniqlash bilan bog'liq muammo paydo bo'ladi. ikki tomonlama spiral (3D-rasm). Bunday hollarda TUNEL-musbat signallar "havoda osilgan" va yadro bilan bog'lanmaganga o'xshaydi. Ularni artefakt emas, balki TUNEL-musbat hujayralar sifatida talqin qilish patologning mas'uliyatiga aylanadi. Flüoresan bilan belgilangan TUNEL bilan to'qimalarda fon avtofluoresansini TUNEL-pozitivligi sifatida aniqlash xavfi mavjud [140]. Bunday hollarda qizil spektrli TUNEL [51,54] ga o'tish tavsiya etiladi.

TUNEL naqshlari qo'shimcha ma'lumot manbai sifatida

Potensial mexanizm va shikastlanish darajasini aniqlash uchun bir nechta TUNEL naqshlarini aniq ajratish mumkin (1-jadval, 3-rasm). Odatda, TUNEL naqshining faqat yadroli turi engil shikastlanish natijasida hosil bo'ladi, kuchliroq shikastlanish (ya'ni, yuqori ta'sir qilish) yadrolar yoki hujayralarning kuchliroq bo'yalishiga va parchalanishiga olib keladi. Qat'iy apoptotik TUNEL namunasi apoptotik jismlarning shakllanishi natijasida yadro parchalanishidir (3E-rasm). TUNEL-musbat yadrolarning kichik bo'laklari, ehtimol apoptotik jismlar, kalamush ishemiya-reperfuziyasida 24-72 soatda ko'rilgan [97]. Apoptotik jismlar, shuningdek, kalamushlarda ishemiya-reperfuziya shikastlanishidan 14 kun o'tgach, buyrak tubulali epiteliysida va interstitiumda yadrolarning TUNEL belgisi bilan ko'rilgan [141]. Lavanda yog'ining dozasini oshirish faqat yadroli TUNEL naqshlarini kamaytirdi va ularni sitoplazmatik oqma bilan nekrozga o'xshash TUNELga aylantirdi [94]. Ikkinchisi nekrozda proteinazalar va lipazlarning ta'siri tufayli yadro konvertining buzilishi natijasidir. TUNEL-musbat sitoplazma sifatida ko'rilgan sitoplazmatik TUNEL (3F-rasm) yorug'lik mikroskopida kalamush kanalchalaridagi rabdomiyoliz modelida [142] va yuqori glyukoza borligida yetishtirilgan podotsitlarda va sichqonlarda diabetik nefropatiyada [135] kuzatilgan. Sitoplazmatik TUNEL, shuningdek, FL floresan TUNEL [98] yordamida sichqonlarda buyrak ishemiya-reperfuziyasida va yorug'lik mikroskopi [143] yordamida kalamushlarda ishemiya-reperfuziyada tasvirlangan. Simob xlorid bilan bog'liq chuqur va faqat quvurli shikastlanish, kuchli sitoplazmatik TUNEL bo'yalishi yadro membranasining shikastlanishidan dalolat beradi [60]. Agar shikastlanish davom etsa yoki zarar etkazuvchi vositaning dozasi oshsa, sitoplazmatik TUNEL dispers TUNELning "tartibsiz" rasmiga aylantirilishi mumkin (3G-rasm) hujayra sitoplazmasi va qoldiqlarining nekrozi va to'kilishi natijasida hujayralarni yo'q qilishning kech bosqichlari bilan bog'liq. Masalan, sitoplazmatik va dispers TUNEL sisplatin bilan davolash qilingan sichqonlarda [71,72] va kalamushlarda [144] va streptozototsin qo'zg'atgan diabetik kalamushlarda podotsitlar shikastlanishida [145] kuzatilgan. Tarqalgan nekrotik TUNEL sichqonlarda uranil asetat ta'siridan kelib chiqqan nefrotoksiklik paytida ham kuzatilgan [101]. Va nihoyat, e'tibor berish kerak bo'lgan yana bir TUNEL signali o'zgaruvchisi TUNEL-musbat signallarining intensivligi bo'lib, ba'zi tadqiqotlar tomonidan hujjatlashtirilganidek, har bir hujayra boshdan kechirgan tanaffuslar soniga (shikastlanish darajasi) qarab hujayradan hujayraga og'ishi mumkin [45,96,125] ]. TUNEL signalining o'zgaruvchan intensivligi kuzatiladigan modellar uchun TUNEL-musbat ob'ektlar soni va bo'yashning o'rtacha intensivligi bo'yicha miqdorni aniqlash tavsiya etiladi.

Xulosa

Buyrakdagi apoptotik endonukleazlarning, xususan DNaz I va EndoG ning yuqori faolligi tufayli TUNEL dan foydalanish.buyrak tadqiqotlari va diagnostikasijuda ma'lumotli. Agar TUNEL apoptozni aniqlash usuli sifatida dastlabki foydalanishdan tashqari qo'llanilsa, u yanada foydali bo'lishi mumkin. TUNELni faqat apoptoz tadqiqotlari uchun qo'llash ilm-fanni noto'g'ri qo'llanilgan usul bilan beixtiyor noto'g'ri yo'naltirish mumkinligiga yaxshi misoldir. Ko'pincha o'tkir shikastlanish tahlili sifatida ishlatilishiga qaramay, TUNEL ham AKI, ham CKD baholash uchun muvaffaqiyatli qo'llanilishi mumkin. Biroq, CKDda TUNEL-pozitivlik darajasi o'tkir shikastlanishga qaraganda past bo'lishini kutish kerak. Endonukleazalarning faolligi (asosan, DNase I) boshqa buyrak bo'linmalariga qaraganda quvurli epiteliyda ancha yuqori bo'lganligi sababli, buyrak kanalchalarining shikastlanishi odatda ko'proq namoyon bo'ladi. Shu bilan birga, agar jarohat ushbu bo'limlarda ro'y bergan bo'lsa, glomerulyar yoki qon tomirlari shikastlanishlari ham TUNEL yordamida o'rganilishi mumkin. FL floresan TUNELning IHC belgilari bilan kolokalizatsiyasi hujayra turlarini va hujayra o'lim mexanizmlarini TUNEL signallari bilan aniqlash va bog'lash imkonini beradi. TUNEL miqdorini aniqlash hujayra o'limi darajasi haqida qimmatli ma'lumotlarni taqdim etishi mumkin va tasvirni tahlil qilish dasturini qo'llash bu borada juda foydali bo'lishi mumkin. TUNEL naqshlarining xilma-xilligini hisobga olgan holda, vakillik tasvirlarini yaratish va namoyish qilish tavsiya etiladi

TUNEL signallari ijobiy deb hisoblanadi. Nihoyat, TUNEL naqshlaridan hujayra o'limi mexanizmi va toksiklik darajasi kabi qo'shimcha ma'lumot manbai sifatida foydalanish kerak. Masalan, TUNEL-musbat apoptotik tanalar, sitoplazmatik TUNEL signallarining mavjudligi yoki dispers TUNEL naqshlari o'rtasidagi farq, tadqiqot va diagnostika natijalarini aniqroq talqin qilish uchun apoptotik va nekrotik TUNEL-musbat hujayralarni aniqlashga yordam beradi.

jinsiy qo'zg'alish buyrak buzilishi davolash