Hayotiy va issiqlik bilan o'ldirilgan probiyotik shtammlar og'iz bo'shlig'i shilliq qavatida IgA kontsentratsiyasini oshirish orqali og'iz immunitetini yaxshilaydi.

Abstrakt

Og'iz-burun shilliq qavatining immuniteti tanani bakterial va virusli hujumlardan himoya qilishda hal qiluvchi rol o'ynaydi. Xavfsiz probiyotik mahsulotlar inson immunitetini va og'iz bo'shlig'ini yaxshilash uchun ishlatilgan. Ushbu tadqiqotda biz Lactobacillus salivarius subsp dan tashkil topgan aralash yashovchan probiyotik tabletkalarning foydali ta'sirini tekshirdik. salicinius AP-32, Bifdobacterium animalis subsp. lactis CP-9 va Lactobacillus paracasei ET-66 va L. salivarius subsp.dan tashkil topgan issiqlik bilan oʻldirilgan probiyotik tabletkalar. salicinius AP-32 va L. paracasei ET-66, 45 nafar sog'lom ishtirokchilar orasida og'iz orqali immunitet bo'yicha. Ishtirokchilar tasodifiy ravishda hayotiy probiyotiklar, issiqlik bilan o'ldirilgan probiyotiklar va platsebo guruhlariga bo'lingan. Davolash kursi 4 hafta davom etdi. Tuprik namunalari 0, 2, 4 va 6-haftalarda olindi va Lactobacillus, Bifidobacterium va Streptococcus mutans populyatsiyalari va IgA kontsentratsiyasi o'lchandi. PBMC hujayralarida IgA kontsentratsiyasi va TGF-beta va IL-10 darajalari Elishay usuli bilan aniqlandi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, so'lakdagi IgA darajasi ikkala yashovchan (119,30 ± 12,63%, *** P) qabul qilinganda sezilarli darajada oshgan.<0.001) and heat-killed (116.78±12.28%, ***P<0.001) probiotics for 4 weeks. Among three probiotic strains, AP-32 would effectively increase the levels of TGF-beta and IL-10 in PBMCs. The oral pathogen Streptococcus mutans was significantly reduced on viable probiotic tablet administration (49.60±31.01%, ***P<0.001). The in vitro antibacterial test confirmed that viable probiotics effectively limited the survival rate of oral pathogens. Thus, this clinical pilot study demonstrated that oral probiotic tablets both in viable form or heat-killed form could exert beneficial effects on oral immunity via IL-10, TGB-beta mediated IgA secretion. The effective dosage of viable probiotic content in the oral tablet was 109 CFUs/g and the heat-killed oral tablet was 1× 1010 cells/g.

cistanche qo'shimchasi foydalari - immunitetni oshiradi

Kirish

Og'iz-burun shilliq qavati, inhalatsiyalangan antijenler bilan aloqa qilish uchun eshik, inson immunitet tizimining oldingi himoyasi hisoblanadi [1, 2]. Odatda patogen viruslar yoki bakteriyalar og'iz-burun bo'shlig'ining shilliq qavatlariga mahalliy immunitet tizimiga va sog'lom mikrobiotaga qarshi kurashadi [3]. Yallig'lanish va simptomlar, shu jumladan yo'tal, tomoq og'rig'i, burun oqishi va isitma, invaziv patogen viruslar va bakteriyalarga qarshi immunitet reaktsiyasi tufayli rivojlanadi [4]. Bundan tashqari, immunoglobulin A (IgA) tupurikning asosiy immun omili bo'lib, og'iz mikrobiotasining gomeostazini tartibga soladi [5]. Bir qator tadqiqotlar sekretor IgA ning organizmni virusli patogenlar, jumladan respirator sinsitial virus [6], rotavirus [7] va gripp virusi [7] infektsiyasidan himoya qilish qobiliyatini bildirgan. Sekretor IgA shilliq qavat epiteliyasini himoya qilish vazifasini bajaradi. Nikolas Millet va boshqalar. shilliq qavat IgA og'iz bo'shlig'ida kommensal Candida albicans disbiyozining oldini olishi mumkinligini aniqladilar [8]. Shuningdek, u tish blyashka paydo bo'lishiga olib keladigan Streptococcus mutans og'iz patogenining to'planishini oldini oladi [9].

Bundan tashqari, tadqiqotchilar og'iz mikrobiotasi va uning metabolitlari og'iz to'sig'idagi immunitetga mahalliy ta'sir ko'rsatishi mumkinligini aniqladilar [10]. Oldingi tadqiqotlar probiyotiklarning og'iz bo'shlig'i shilliq qavatida IgA kontsentratsiyasini oshirishda samaradorligini ko'rsatdi [11]. Erikson va boshqalar. Lactobacillus reuteri o'z ichiga olgan saqich so'lak IgA darajasini oshirish orqali sog'lom sub'ektlarning adaptiv immun javobida ishtirok etishini ko'rsatdi [12]. Odamlarda TGF-beta va IL-10 immun sitokinlari IgA ishlab chiqarish bilan bog'liqdir [13].

Biroq, og'iz mikrobiotasi TGF-beta va IL-10 sitokinlari orqali sekretor IgA darajasini oshirganmi yoki yo'qmi hali ham noma'lum. Bundan tashqari, og'iz patogenlari orasida S. mutans, P. gingivalis va F. nucleatum subsp. polimorfizm va A. actinomycetemcomitans periodontal kasallik va yomon nafas bilan yuqori korrelyatsiya ko'rsatdi [14]. Probiyotik mahsulotlar Fusobacterium nucleatum og'iz patogenlarini inhibe qilish orqali periodontitga potentsial alternativ terapiya bo'lishi mumkin, ammo Porphyromonas gingivalis va Aggregatibacter actinomycetemcomitans sezilarli pasayish ko'rsatmadi [15]. Probiyotik qo'shimchalar patogen infektsiyalarni ham oldini oladi [16]. Mikrobiotaning asosiy turlari patogen Streptococcus pnevmoniya o'sishini cheklaganligi xabar qilingan [17]. Shunday qilib, probiyotik shtammlarni qabul qilish orqali muvozanatli mikrobial ekotizimni saqlash og'iz immunitetini tartibga solish va og'iz bo'shlig'ini yaxshilashning muqobil usuli bo'lishi mumkin. Probiyotik shtammlar tomonidan og'iz patogenlarini inhibe qilish bo'yicha oldingi topilmalar Lactobacillus salivarius subsp. salicinius AP-32, Bifdobacterium animalis subsp. lactis CP-9 va Lactobacillus paracasei ET-66 in vitroda mukammal antibakterial ta'sir ko'rsatadi; ammo H2O2 darajasini oshirish mexanizmi bilan emas [18]. Og'iz orqali patogen o'sishni cheklash uchun probiyotik shtammlarning asosiy strategiyalari patogenlarni og'iz orqali birlashtirish, biosurfaktanlarni ishlab chiqarish, og'iz muhitini o'zgartirish va mikroblarga qarshi moddalarni ishlab chiqarish edi [19]. Bundan tashqari, in vitro tadqiqotida L. salicinius AP{14}} odam epitelial hujayralarida yallig‘lanish sitokinini [interleykin (IL)-8, IL-10] ifodalanishini ko‘rsatdi [20]. Shuning uchun, biz ushbu tadqiqotda L. salivarius subsp. dan iborat bo'lgan yashovchan probiyotik tabletkalarni aralashtiramizmi yoki yo'qligini tekshirdik. salicinius AP-32, B. animalis subsp. lactis CP-9 va L. paracasei ET-66 va L. salivarius subsp.dan tashkil topgan issiqlik bilan oʻldirilgan probiyotik tabletkalar. Salicinius AP-32 va L. paracasei ET-66, TGF-beta, IL-10 orqali immunitet funksiyasini yaxshilagan yoki tuprikdagi IgA kontsentratsiyasini oshirgan. Og'iz bo'shlig'ida probiyotik mahsulotni qabul qilishning antibakterial funktsiyasi sinovdan o'tkazildi.

Cistanche qo'shimchasining foydalari - immunitetni qanday mustahkamlash mumkin

Cistanche Enhance Immunity mahsulotlarini ko'rish uchun shu yerni bosing

【Batafsil ma'lumot so'rang】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Materiallar va usullar

Ishtirokchilar

Hammasi bo'lib, 20-40 yoshdagi 45 nafar sog'lom ishtirokchilar jalb qilindi va tasodifiy uchta kichik guruhga bo'lingan: yashovchan probiyotik og'iz tabletkalari, issiqlik bilan o'ldirilgan probiyotik og'iz tabletkalari va platsebo guruhlari. Har bir guruh 15 nafar ishtirokchidan iborat edi. Chekish va yong'oqni iste'mol qilish odatlari bo'lgan ishtirokchilar chiqarib tashlandi. Ishtirokchilarga og'zaki planshetlar ko'r-ko'rona tayinlangan. Barcha ishtirokchilar 4 hafta davomida kuniga uch marta (ertalab, tushlik va kechqurun) og'iz tabletkalarini qabul qilishdi. 0, 2, 4 va 6-haftalarda IgA kontsentratsiyasi va mikroorganizm populyatsiyasini o'lchash uchun so'lak namunalari (2 ml) to'plangan. Ushbu tadqiqotga kiritilgan barcha ishtirokchilardan xabardor qilingan rozilik olindi. Protokol Chung Shan tibbiyot universiteti, Tayvan (CS19052) institutsional tekshiruv kengashi tomonidan tasdiqlangan.

Hayotiy probiyotik og'iz tabletkalari

Hayotiy probiyotik og'iz tabletkasi (1 g) uchta yashovchan probiyotik shtammni, L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. lactis CP-9 va L. paracasei ET-66. Biz 0.01 g 1011 ta koloniya hosil qiluvchi birlik (CFU) bitta probiyotikni og'iz tabletkasiga aralashtirdik. Har bir probiyotik shtammi 0,33 * 109 CFUs / g atrofida o'lchandi. Og'iz tabletkasidagi probiyotiklarning umumiy miqdori 109 koloniya CFUs / g ni tashkil etdi. Probiyotik og'iz tabletkalarining faol dozasi avvalgi nashr etilgan ishlardan keyin edi [18]. Barcha probiyotik shtammlar Biofag Biotech Co., Ltd (Tainan, Tayvan) laboratoriyasidan olingan. L. salivarius subsp. salicinius AP-32 sog'lom inson ichaklaridan ajratilgan va Oziq-ovqat sanoati tadqiqot va rivojlantirish institutida, Tayvanda (ID: BCRC 910437) va Uxan universitetida, Xitoyda (ID: CCTCC-M2011127) saqlangan; B. animalis subsp. sutli CP-9 sog'lom inson ona sutidan ajratilgan va Tayvanning Oziq-ovqat sanoati tadqiqot va rivojlantirish institutida (ID: BCRC 910645) va Uxan universitetida (ID: CCTCC-M2014588) saqlangan; L. paracasei ET{20}} sog‘lom inson ona sutidan ajratilgan va oziq-ovqat sanoati tadqiqot va rivojlantirish institutida, Tayvanda (ID: BCRC 910753) va Xitoy umumiy mikrobiologik madaniyat yig‘ish markazida, Pekin, Xitoyda (ID: CGMCC{) saqlangan. {22}}). Laktobakteriyalar. salivarius subsp. salicinius AP-32 va L. paracasei ET-66 de Man, Rogosa va Sharpe (MRS) agar plastinkalarida (110,660, Merck, Darmshtadt, Germaniya) yetishtirildi va fakultativ anaerob sharoitda 37 daraja inkubatsiya qilindi. 48 soat davomida. B. animalis subsp. Lactis CP-9 0,05% sistein qo'shilgan MRS agarda ekilgan va 37 darajada 48 soat davomida anaerobik inkubatsiya qilingan. Probiyotik shtammlarni yetishtirgandan keyin bakterial CFU miqdorini aniqlash uchun koloniyalarni hisoblash amalga oshirildi [18].

cistanche o'simlik - immunitet tizimini oshiradi

Issiqlik bilan o'ldirilgan probiyotik og'iz tabletkalari

Issiqlik bilan o'ldirilgan probiyotik og'iz tabletkalari (1 g) faollashtirilgan L. salivarius subsp. salicinius AP-32 va L. paracasei ET-66. Hayotga yaroqli shtammlar yuqorida tavsiflanganidek ekilgan va inkubatsiya qilingan. Keyin, AP-32 va ET-66 yashovchan shtammlarni MRS muhitida 100 daraja 1 soat davomida inkubatsiya qilish orqali faolsizlantirildi. Og'iz tabletkasidagi probiyotik tarkibi 1 × 1010 hujayra / g edi. Issiqlik bilan o'ldirilgan probiyotik og'iz tabletkalarining faol dozasi ilgari e'lon qilingan in vitro sinovlaridan keyin edi [11]. Barcha eksperimental protseduralar Biofag Biotech Co., Ltd (Tainan, Tayvan) laboratoriyasida o'tkazildi.

Tuprik namunalarida laktobakteriyalar va bifidobakteriyalar populyatsiyasini o'lchash

0, 2, 4 va 6-haftalarda har bir ishtirokchidan tupurik namunalari (2 ml) olindi. Tuprik namunalari (100 µL) ketma-ket suyultirildi va MRSga qo‘shildi. plitalar. Lactobacillus populyatsiyalarini o'lchash uchun Lactobacillus ekilgan va MRS agar plastinkalarida fakultativ anaerob sharoitda 37 daraja 48 soat davomida inkubatsiya qilingan. Bifdobacterium populyatsiyasini o'lchash uchun Bifdobacterium ekilgan va 48 soat davomida 0.05% sistein qo'shilgan MRS agarda anaerob usulda 37 daraja haroratda inkubatsiya qilingan. Probiyotik shtammlarni o'stirgandan so'ng bakterial CFU miqdorini aniqlash uchun koloniyalarni hisoblash amalga oshirildi. Lactobacillus va Bifidobacterium populyatsiyasi darajasi 0-haftada probiyotik populyatsiya soniga normallashtirildi. 0-haftada to'plangan Lactobacillus va Bifidobacterium populyatsiyasi darajasi 100% deb hisoblandi. Eksperimental usul ilgari nashr etilgan ishlardan keyin [18].

Og'iz bo'shlig'i shilliq qavatida IgA kontsentratsiyasini o'lchash

0, 2, 4 va 6-haftalarda har bir ishtirokchidan tupurik namunalari (2 ml) olindi va 20 darajada saqlangan. IgA kontsentratsiyasini tahlil qilish uchun IgA Human Qoplanmagan ELISA to'plami (Katalog № 88-50600-88; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, San-Xose, CA, AQSH) ishlatilgan. Birinchidan, biz insonga qarshi IgA antikorlarini 96-quduq plastinkasiga qo'ydik. Namuna yoki standartda mavjud bo'lgan so'lak IgA mikroquyruqga qo'shildi va keyin HRP bilan konjugatsiyalangan insonga qarshi IgA antikorlari xona haroratida 1 soat davomida qo'shildi. TMB Substratini har bir quduqqa 30 daqiqa davomida pipetlash. Nihoyat, IgA kontsentratsiyasi spektrofotometrda 450 nm da o'lchandi. Barcha eksperimental protsedura ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq uch nusxada amalga oshirildi. 0-haftada to'plangan IgA kontsentratsiyasi darajasi 100% deb hisoblanadi. Eksperimental usul ilgari nashr etilgan ishlardan keyin [18].

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

PBMCda TGF-Beta va IL-10 kontsentratsiyasini o'lchash

Oldingi tadqiqotdan so'ng TGF-beta va IL-10 darajalarining probiyotik sabab bo'lgan ko'tarilishi sinovi [20]. Periferik qon mononuklear hujayralari (PBMCs) sog'lom donorlarning qon namunalaridan olingan (Tainan qon markazi, Tayvan qon xizmatlari fondi). Ficoll-Hypaque gradienti (Pharmacia, Shvetsiya) orqali butun qonni santrifüj qilish va 42,5%-50% interfeysdagi yorug'lik zichligi fraktsiyasi elutsiya qilindi. 4 * 105 hujayra ekilganida 100 µl RPMI-1640 da 1% FBS (Sigma Chemical Co., Sent-Luis, MO, AQSH) bilan 96 ta quduq plitasining har bir qudug‘iga PBMC hujayralari ajratildi. Keyin yaxshi urug'langan har bir PBMCga 5 * 105 cfu/20 µl probiyotik davolash qo'shing (hujayralar: probiyotik shtammlar=1:10). Ijobiy nazoratlar mos ravishda TGF-, IL-10 ishlab chiqarish uchun PBMC urug'li quduqlariga 10 mkg/ml Phytoheemagglutinin (PHA) (Sigma-Aldrich, Myunxen, Germaniya) qo'shildi [21]. 48 soat davomida PBMCs bilan probiyotiklarni birgalikda etishtirish. Tarkibida IL{27}} va TGF- sitokinlari boʻlgan supernatantni ferment bilan bogʻlangan immunosorbent tahlili (ELISA) tahlili orqali oʻlchash (Thermo Scientific, Carlsbad, CA, AQSH). Barcha tajribalar o'lchandi va kamida uch nusxada tijorat protokoliga rioya qilindi.

Og'iz bo'shlig'ida antibakterial funktsiyani baholash

Streptococcus mutans og'iz bo'shlig'i sog'lig'iga keng tarqalgan tahdid bo'lib, vabo yoki biofilm hosil qilish orqali tish kariyesini keltirib chiqaradi [22]. Tamponlardan Streptococcus mutans namunalari olindi, ular orqali biz S. mutansni supragingival qism, gingiva va og'iz bo'shlig'i shilliq qavatida 0, 2, 4 va 6-haftalarda to'pladik. S. mutans triptikda saqlangan. 50% glitserin bilan to'ldirilgan soya bulyoni (TSB, 5 ml). S. mutans muhiti ketma-ket suyultirildi va Mitis Salivarius-Bacitracin Agar (MSBA, 0.2 U/mL) plastinkasiga qo'shildi, u 37 daraja haroratda 2 kun davomida inkubatsiya qilindi. Nihoyat, patogen omon qolish darajasini hisoblash uchun har bir ishtirokchi namunasidagi S. mutans koloniyalari soni hisoblandi; 0-haftada to'plangan S. mutansning omon qolish darajasi 100% deb hisoblangan. Eksperimental usul ilgari nashr etilgan ishlardan keyin [18].

Og'iz tabletkalarining in vitro antibakterial faolligi

Oral tablets (1 g) that contained viable (AP-32, CP-9, and ET-66; > 109 CFUs) and heat-killed (AP-32 and ET-66,>0,1 g/ml yakuniy konsentratsiyani olish uchun 1010 CFU) probiyotik shtammlari mos ravishda TSB va miya yurak infuzion muhitida eritildi. Bo'sh guruh uchun faqat vosita ishlatilgan, probiyotik komponentlarsiz planshetlar (1 g) platsebo guruhi uchun tegishli muhitda eritilgan. Keyinchalik, og'iz patogenlari (106 CFU) tabletka eritmalariga kiritildi va 2 (S. mutans) yoki 3 (Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum va Aggregatibacter actinomy cetemcomitans) uchun 37 daraja bilan birgalikda inkubatsiya qilindi. Patogenlar BCRC dan olingan. Og'iz orqali patogen inhibisyon darajasi (%) quyidagicha hisoblangan: (CFUblank nazorati-CFUeksperimental guruhi)/CFUblank nazorati. Eksperimental usul ilgari e'lon qilingan sinovdan so'ng [11].

Statistik tahlil

GraphPad Prism dasturi ikki dumli t-test natijalarini statistik tahlil qilish uchun ishlatilgan. Ma'lumotlar o'rtacha standart og'ish (SD) yoki ikki yoki uchta mustaqil tajriba natijalarining o'rtacha qiymati sifatida taqdim etildi. Statistik farqlar P qiymatida muhim deb hisoblangan<0.05.

Natijalar

Probiyotik tabletkalar og'iz bo'shlig'ida bifidobakteriyalar populyatsiyasini ko'paytirdi

Probiyotik tabletkalarni qabul qilgandan so'ng, Bifidobacterium populyatsiyasi og'iz bo'shlig'ida barqaror ravishda ko'tarildi. Davolanishdan keyingi bakterial populyatsiyalar davolashdan oldin bakterial populyatsiyalar tomonidan normallashtirildi (Populyatsiya darajasi %=davolanishdan keyingi CFU/pre-davolash CFU). Hayotiy probiyotiklar guruhida aholi soni 2-haftada 244,14 ± 164,96% ga sezilarli darajada oshdi (** P<0.01, Fig. 1a) and 438.41±308.58 at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population rate remained high at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 550.16±448.19%, ***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (**P<0.01). In the heat-killed probiotic group, the Bifidobacterium population was increased at Weeks 2 (149.92±60.47%, **P<0.01) and 4 (199.87±148.64%, *P<0.05), but was decreased at Week 6 after administration of the heat-killed probiotic tablets was stopped for 2 weeks (182.98±163.73%, Fig. 1a).

Probiyotik tabletkalar og'iz bo'shlig'ida laktobakteriya populyatsiyasini ko'paytirdi

Probiyotik tabletkalarni yuborish natijasida og'iz orqali Lactobacillus populyatsiyasining o'zgarishi og'iz orqali Bifidobacterium populyatsiyasining o'zgarishiga o'xshash naqshni aniqladi. Davolashdan keyingi bakterial populyatsiyalar davolashdan oldin bakterial populyatsiyalar tomonidan normallashtirildi. Hayotiy probiyotiklar guruhida Lactobacillus populyatsiyasi darajasi 2-haftada 447,74 ± 337,89% gacha ko'tarildi (** P).<0.01, Fig. 1b) and 982.27±726.66% at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Lactobacillus population rate was higher at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 727.57±539.76%, ***P<0.001) than at Week 0. The Lactobacillus population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (***P<0.001). In the heat-killed probiotic group, the Lactobacillus population was increased at Weeks 2 (256.66±183.78%, **P<0.01) and 4 (312.85 ± 279.71%, *P < 0.05). Additionally, the Lactobacillus number remained but showed no significant difference at Week 6 after the administration of heat-killed probiotics was stopped for 2 weeks (208.00±199.50%, Fig. 1b).

1-rasm a Og'iz bo'shlig'i shilliq qavatlarida Bifidobakteriyalar populyatsiyasini o'lchash. V hayotiy probiyotik tabletkalar; H issiqlik bilan o'ldirilgan inaktivlashtirilgan probiyotik tabletkalar; C platsebo tabletkalari (nazorat qilish); va LAB sut kislotasi bakteriyalari. 0, 2, 4 va 6-haftalarda tuprik namunalarini yig'ish va tahlil qilish amalga oshirildi. Ma'lumotlar o'rtacha standart og'ish (SD) sifatida taqdim etildi. Statistik farqlarni tahlil qilish uchun ikki dumli t-testi ishlatilgan. Statistik ahamiyat * P bilan belgilangan<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. b Measurement of Lactobacillus populations on the oral mucosal surfaces. V viable probiotic tablets; H heat-killed inactivated probiotic tablets; C placebo tablets (control); and LAB lactic acid bacteria. Collection and analysis of salivary samples at Weeks 0, 2, 4, and 6 were performed. Data were presented as the mean standard deviation (SD). A two-tailed t-test was used to analyze statistical differences. Statistical significances were marked with *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

AP‑32, ET‑66 va CP‑9 ni o‘z ichiga olgan probiyotik tabletkalar og‘iz shilliq qavatida IgA kontsentratsiyasini sezilarli darajada oshirdi.

Probiyotik tabletkalarni (hayotiy yoki issiqlik bilan o'ldirilgan) iste'mol qilish og'iz bo'shlig'ida Bifidobacterium va Lactobacillus darajasini oshirishi isbotlanganligi sababli, biz probiyotik mahsulotlarni qabul qilish natijasida yuzaga kelgan tuprik IgA kontsentratsiyasining o'zgarishini tahlil qildik. Davolashdan keyingi IgA darajalari davolanishdan oldin IgA darajalari bilan normallashtirildi. Hayotiy probiyotiklar guruhida so'lakdagi IgA konsentratsiyasi 2-haftada 103,24 ± 8,10% gacha (2-rasm) va 4-haftada 104,81 ± 13,26 ga oshdi, ammo statistik jihatdan muhim farqlarsiz. Biroq, 6-haftada yashovchan probiyotiklar guruhidagi IgA kontsentratsiyasi platsebo guruhiga nisbatan sezilarli darajada oshdi (hayotiy probiyotik tabletkalarni 4-haftadan keyin 2 hafta davomida kiritilmagan), 0-haftaga nisbatan 119,30 ± 12,63%. ***P<0.001). Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the salivary IgA concentration was slightly increased at Weeks 2 (102.51± 7.20%) and 4 (104.35 ± 10.27%). The saliva IgA concentration was increased at Week 6 (116.78 ± 12.28%, ***P < 0.001, Fig. 2), compared to Week 0.

Hayotiy shtammlar PBMClarda IL-10 va TGF-Beta darajalarini oshirdi

10 mkg/ml Fitogemagglutinin (PHA) ning ijobiy nazorati IL-10 (58,2 ± 7,9 pg/ml, ***P <0,001, 3a-rasm) va TGF- darajasini muvaffaqiyatli oshirdi. (53,4±8 pg/ml, ***P<0.001, Fig. 3b) in PBMCs by comparing to the negative control (PBMCs treated with medium only). Viable strains of CP-9, AP-32 and ET-66 signifcantly increased the levels of IL-10 in PBMCs to 84.2±9 pg/ml (***P<0.001, ##P<0.01), 303.1±170.9 pg/ml (*P<0.05, ##P<0.01) and 98.2±17.5 pg/ml (***P<0.01, ##P<0.01), respectively. Symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated a significant difference by comparing to the PHA control (Fig. 3a). Besides, viable strains of CP-9, AP-32, and ET-66 significantly increased the levels of TGF-beta in PBMCs to 23.2 ± 4.7 pg/ml (***P < 0.001), 130.9 ± 16 pg/ ml (***P < 0.001, ###P < 0.001) and 31.4 ± 5.5 pg/ml (***P<0.01), respectively (Fig. 3b).

2-rasm Tuprik namunalarida immunoglobulin A (IgA) konsentratsiyasi. V hayotiy probiyotik tabletkalar; H issiqlik bilan o'ldirilgan inaktivlashtirilgan probiyotik tabletkalar; C platsebo tabletkalari (nazorat qilish); va LAB sut kislotasi bakteriyalari. 0, 2, 4 va 6-haftalarda tuprik namunalarini yig'ish va tahlil qilish amalga oshirildi. Ma'lumotlar o'rtacha standart og'ish (SD) sifatida taqdim etildi. Statistik farqlarni tahlil qilish uchun ikki dumli t-testi ishlatilgan. Statistik

Tarkibida AP‑32, ET‑66 va CP‑9 bo‘lgan probiyotik tabletkalar so‘lakda S. mutans populyatsiyasini ta’qiqlagan.

Bifidobakteriyalar va Lactobacillus populyatsiyalarining ko'payishi va tuprikdagi IgA kontsentratsiyasining oshishi og'iz orqali patogen mikroorganizmlarga qarshi kurashga yordam beradi. Keyingi tajribada biz probiyotik aralashuv tufayli og'iz patogen S. mutans populyatsiyasidagi o'zgarishlarni sinab ko'rdik. Davolashdan keyingi bakterial populyatsiyalar davolashdan oldin bakterial populyatsiyalar tomonidan normallashtirildi. Hayotiy probiyotiklar guruhida S. mutans populyatsiyasi 2-haftada sezilarli darajada kamaydi (53,55±31,60%, ***P).<0.001), 4 (49.60±31.01%, ***P<0.001), and 6 (55.19±42.72%, **P<0.01, Fig. 4). At week 6, S. mutans was significantly inhibited in the viable probiotic group (55.19±42.72%, ***P<0.001), compared to in the placebo group. Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the S. mutans population was slightly decreased at Week 2 (85.81±49.87%) and significantly reduced at Week 4 (58.35 ± 33.17%, ***P<0.001). The S. mutans population level in the heat-killed probiotic group (202.81±167.99%) reverted to that in the placebo group (225.05±127.01%) at Week 6 (no administration of heat-killed probiotic tablets for 2 weeks from Week 4) (Fig. 4).

3-rasm yashovchan shtammlar PBMClarda IL-10 va TGF-beta darajasini oshirdi. PBMClarda IL-10 va b TGF-beta darajasi probiyotik shtammlarni davolash orqali sinovdan o'tkazildi. 5 * 105 cfu/20 µl jonli CP-9, AP-32 va ET-66 shtammlarini PMBCga 10 µg/ml qo‘shish. Ijobiy nazorat sifatida fitohemagglutinin (PHA) ishlatilgan. Salbiy nazorat faqat RMPI-1640 muhiti bilan ishlov berilgan PBMClar edi. Uch martalik testlar o'tkazildi. Ma'lumotlar o'rtacha standart og'ish (SD) sifatida taqdim etildi. Statistik farqlarni tahlil qilish uchun ikki dumli t-testi ishlatilgan. Statistik ahamiyat P bilan belgilandi<0.05, P<0.01, P<0.001. The symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated significant difference by comparing to the PHA control

4-rasm Og'iz bo'shlig'i shilliq qavatlarida patogen Streptococcus mutans populyatsiyalarini o'lchash. V hayotiy probiyotik tabletkalar; H issiqlik bilan o'ldirilgan inaktivlashtirilgan probiyotik tabletkalar; C platsebo tabletkalari (nazorat qilish); va LAB sut kislotasi bakteriyalari. 0, 2, 4 va 6-haftalarda tuprik namunalarini yig'ish va tahlil qilish amalga oshirildi. Ma'lumotlar o'rtacha standart og'ish (SD) sifatida taqdim etildi. Statistik farqlarni tahlil qilish uchun ikki dumli t-testi ishlatilgan. Statistik ahamiyat * P bilan belgilangan<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

In vitro testi orqali probiyotik tabletkalarning og'iz bo'shlig'ida patogen o'sishini inhibe qilish qobiliyatini tasdiqlash

In vitro tadqiqoti shuni ko'rsatdiki, yashovchan probiyotik tabletkalar og'iz patogenlarining omon qolish darajasini sezilarli darajada inhibe qilgan (5a-rasm). Davolashdan keyingi bakterial populyatsiyalar davolashdan oldin bakterial populyatsiyalar tomonidan normallashtirildi. S. mutans, P. gingivalis, F. nucleatum va A. actinomy cetemcomitans ning yashovchan probiyotik guruhidagi omon qolish darajasi platsebo guruhiga nisbatan 4,23% gacha kamaydi (***P < 0 .001, platsebo=91%), 8,64% (***P <0,001, platsebo=89%), 5,77% (**P<0.01, placebo=98%), and 6.23% (**P<0.01, placebo=87%), respectively. However, the heat-killed probiotic tablet exerted weaker antibacterial effects than the viable probiotic tablet (Fig. 5b). The survival rate of S. mutans, P. gingivalis, F. nucleatum, and A. antinomy cetemcomitans in the heat-killed probiotic group, compared to in the placebo group, was slightly decreased without statistical significance (82%, placebo=91%), significantly reduced to 53% (*P<0.05, placebo=89%), not inhibited (96.88%, placebo=98%), and significantly reduced to 80% (**P<0.01, placebo=87%), respectively.

Munozara

Platsebo guruhi bilan taqqoslaganda, Lactobacillus va Bifidobacteriumning og'iz orqali populyatsiyasi 4 hafta davomida yashovchan probiyotik tabletkalar yoki issiqlik bilan o'ldirilgan probiyotik tabletkalarni oziqlantirish orqali sezilarli darajada oshadi. Bundan tashqari, Lactobacillus va Bifidobacterium soni hayotiy probiyotiklarni iste'mol qilishni to'xtatgandan keyin 2 hafta davomida sezilarli darajada yuqori darajada qoldi (1a va b-rasm). Xuddi shunday, Camila Casuccio Almeida va boshqalar. Probiyotiklarni to'rt haftalik davolash laktoza intoleransi bo'lgan bemorlarda probiyotiklarni iste'mol qilishni to'xtatgandan keyin kamida 3 oy davomida simptomlarni yaxshilashi mumkinligini ko'rsatdi [23]. Biroq, uzoq muddatli davolanishda probiyotiklarning barqaror ta'siri kelajakda baholanishi kerak. Bundan tashqari, yashovchan va issiqlik bilan o'ldirilgan probiyotik tabletkalarni qabul qilishda tuprikdagi IgA kontsentratsiyasi sezilarli darajada oshdi. Issiqlik bilan o'ldirilgan va yashovchan probiyotik guruhlar 4 hafta davomida og'iz tabletkalarini yuborish orqali so'lak IgA ni oshirdi, ammo platsebo bilan statistik farqni ko'rsatmadi. Issiqlik bilan o'ldirilgan va hayotiy probiyotik guruhlarda IgA kontsentratsiyasi 6-haftada sezilarli o'sishni ko'rsatdi. Biroq, probiyotiklarni qabul qilishni 2 hafta davomida to'xtatgandan so'ng IgA ko'tarilish mexanizmini qo'shimcha tekshirish kerak (2-rasm) Braathen va boshqalar. og'iz bo'shlig'idagi probiyotik shtammlarning immunomodulyatsion roli bo'yicha shunga o'xshash natijalarni xabar qildi [24]. Bundan tashqari, probiyotik shtammlar cho'chqalar va cho'chqa go'shtida fekal IgA kontsentratsiyasini sezilarli darajada oshiradi [25]. Biroq, yuqori nafas yo'llarining infektsiyalarida IgA-ni engillashtiradigan alomatlar bo'yicha tadqiqotlar etarli emas. CP-9, AP-32 va ET-66 probiyotik shtammlari tomonidan yuqori nafas yo'llari infektsiyalarini inhibe qilish va oldini olishning batafsil molekulyar mexanizmi kelgusi tadqiqotlarda o'rganilishi mumkin. Ushbu tadqiqotda CP-9, AP-32 va ET{23}} hayotiy shtammlari PBMC hujayralarida IL-10 va TFG-beta darajasini oshiradi. AP{26}} IL-10 va TFG-beta ni PBMClarda PHA musbat nazorati bilan solishtirish orqali oshirishda samarali qobiliyatni ko'rsatdi (3a va b-rasm). CP-9, AP-32 va ET-66 jonli shtammlari so'lak IgA darajasini oshirish uchun B-hujayralarini IL-10 va TFG-beta sekretsiyasini qo'zg'atishi mumkin deb taxmin qilingan. Biroq, tuprik IL-10, TFG-beta va so'lak IgA o'rtasidagi bog'liqlikni qo'shimcha tekshirish kerak [26]. Bundan tashqari, issiqlik bilan o'ldirilgan probiyotiklar IL-10 va TFG-beta ni qo'zg'atish orqali IgA ni ko'paytiradimi yoki yo'qmi hali ham noma'lum. In vitro sinovi shuni ko'rsatdiki, issiqlik bilan o'ldirilgan AP-32 interferon va IL-12p70 sekretsiyasini kuchaytirgan va IL-13 darajasini pasaytirgan [27]. Shunday qilib, ushbu klinik tadqiqotda probiyotik CP-9, AP-32 va ET-66 shtammlari va issiqlik bilan o'ldirilgan AP-32 va ET-66 og'iz bo'shlig'ida patogen bakteriyalarni inhibe qilish uchun shtammlar yanada tasdiqlangan (4-rasm). Organik kislotalar, mikroblarga qarshi peptidlar [28], ekzopolisakkaridlar (EPS) [29] bakteriotsinlar [30] ajralishi orqali jonli probiyotik pastillar issiqlik bilan o'ldirilgan pastilkalarga qaraganda yaxshiroq anti-patogenlik qobiliyatini taqdim etdi (5a va b-rasm). Hayotiy probiyotik shtammlar tomonidan ishlab chiqarilgan funktsional antimikrobiyal komponentlar kelajakda yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC) va suyuq xromatografiya (LC) - massa spektrometriyasi bilan aniqlanishi kerak [31]. Ma'lum qilinishicha, issiqlik bilan o'ldirilgan probiyotiklar yashovchan probiyotiklarning asosiy afzalliklariga ega edi, ammo yashovchan probiyotik shtammlarning xavfsizligi bilan bog'liq muammolarsiz [32]. Biroq, issiqlik bilan o'ldirilgan probiyotiklarning antimikrobiyal komponentlarini qo'shimcha tekshirish kerak.

5-rasm Probiyotik tabletkalarning og'iz orqali patogen o'sishini inhibe qilish qobiliyatini in vitro sinovi bilan tasdiqlash. Hayotiy va issiqlik bilan o'ldirilgan probiyotik tabletkalarning og'iz bo'shlig'i patogenlarining, jumladan Streptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum va Aggregatibacter actinomycetemcomitansning yashash tezligini inhibe qilish qobiliyati tasdiqlangan. Bo'sh guruh, faqat o'rta; platsebo guruhi, probiyotik komponentlarsiz planshetlar (1 g). Uch martalik testlar o'tkazildi. Ma'lumotlar o'rtacha standart og'ish (SD) sifatida taqdim etildi. Statistik farqlarni tahlil qilish uchun ikki dumli t-testi ishlatilgan. Statistik ahamiyat * P bilan belgilangan<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Xulosa

L. salivarius subsp dan iborat aralash yashovchan probiyotik tabletkalar. salicinius AP-32, B. animalis subsp. sutli CP-9 va L. paracasei ET-66 va issiqlik bilan o'ldirilgan probiyotiklar, shu jumladan L. salivarius subsp. salicinius AP-32 va L. paracasei ET-66, Lactobacillus va Bifdobacteriumning og'iz populyatsiyasini ko'paytirish, og'iz bo'shlig'ida S. mutans miqdorini kamaytirish va sog'lom ishtirokchilarda so'lak IgA kontsentratsiyasini oshirish orqali o'zlarining foydali funktsiyalarini bajardilar. In vitro sinov natijalari hayotiy probiyotiklar og'iz bo'shlig'i patogenlarini, jumladan S. mutans, P. gingivalis va F. nucleatum subsp.larni samarali ravishda inhibe qilganligini tasdiqladi. polimorfizm va A. actinomycetemcomitans. Og'iz-burun shilliq qavatining immuniteti bosqinchi mikroorganizmlardan oldingi himoya hisoblanadi va bu hal qiluvchi masalaga aylandi. Shunday qilib, ushbu tadqiqot og'iz bo'shlig'i immunitetini va og'iz bo'shlig'i salomatligini saqlash uchun muqobil strategiyani (probiyotik qo'shimcha) taklif qiladi.

Cistanche qo'shimchasining foydalari - immunitetni qanday mustahkamlash mumkin

Ma'lumotnomalar

1. Takaki H, Ichimiya S, Matsumoto M, Seya T (2018) Adjuvantlar tomonidan burun ichiga yuborilganda burun bilan bog'langan limfoid to'qimalarda shilliq qavatning immun javobi. J Tug'ma immunitet 10 (5-6): 515-521

2. Wu RQ, Zhang DF, Tu E, Chen QM, Chen WJ (2014) Og'iz bo'shlig'idagi shilliq qavat immun tizimi - T hujayralari xilma-xilligi orkestri. Int J Oral Sci 6(3):125–132

3. Man WH, de Steenhuijsen Piters WAA, Bogaert D (2017) Nafas olish yo'llarining mikrobiotasi: nafas olish salomatligi uchun darvozabon. Nat Rev Microbiol 15(5):259–270

4. Wald ER, Guerra N, Byers C (1991) Yosh bolalarda yuqori nafas yo'llarining infektsiyalari: asoratlarning davomiyligi va chastotasi. Pediatriya 87(2):129–133

5. Marcotte H, Lavoie MC (1998) Og'iz mikrobial ekologiyasi va tuprik immunoglobulinining roli A. Microbiol Mol Biol Rev 62 (1): 71-109

6. Weltzin R, Traina-Dorge V, Soike K, Zhang JY, Mack P, Soman G va boshqalar (1996) Nafas olish sinsitial virusiga intranazal monoklonal IgA antikori rezus maymunlarini yuqori va pastki nafas yo'llari infektsiyasidan himoya qiladi. J Infect Dis 174(2):256–261

7. Ruggeri FM, Johansen K, Basile G, Kraehenbuhl JP, Svensson L (1998) Antirotavirus immunoglobulin A epiteliya hujayralari orqali transsitozdan keyin virusni in vitro neytrallashtiradi va chaqaloq sichqonlarini diareyadan himoya qiladi. J virol 72(4):2708–2714

8. Millet N, Solis NV, Swidergall M (2020) Mukozal IgA og'iz bo'shlig'ida kommensal Candida albicans disbiyozini oldini oladi. Old Immunol 11:2448

9. Katz J, Harmon CC, Buckner GP, Richardson GJ, Russell MW, Michalek SM (1993) S. mutans antijeni I/II bilan intranazal immunizatsiyadan so'ng Streptococcus mutans infektsiyasiga qarshi himoya tupurik immunoglobulin A javoblari vabo toksinining B bo'linmasi bilan bog'langan. . Immun 61 (5): 1964–1971 ni yuqtiring

10. Moutsopoulos NM, Konkel JE (2018) Og'iz bo'shlig'i shilliq qavatida to'qimalarga xos immunitet. Trends Immunol 39(4):276–287

11. Lin CW, Chen YT, Ho HH, Hsieh PS, Kuo YW, Lin JH, Liu CR, Huang YF, Chen CW, Hsu CH, Lin WY, Yang SF (2021) Probiyotik shtammlari bo'lgan lozenginlar og'iz immunitetini va sog'lig'ini yaxshilaydi. . Oral Dis. https://doi.org/10.1111/odi.13854

12. Erikson D, Hamberg K, Brattal G, Sinkiewicz-Enggren G, Ljunggren L (2013) Lactobacillus reuteri o'z ichiga olgan saqichdan foydalangandan so'ng probiyotik bakteriyalar va mutans streptokokklariga so'lak IgA javobi. Pathog Dis 68(3):82–87

13. Defrance T, Vanbervliet B, Briere F, Durand I, Rousset F, Banchereau J (1992) Interleykin 10 va transformatsion o'sish omili beta anti-CD40-faollashtirilgan sodda inson B hujayralarini immunoglobulin A ni chiqarishga undash uchun hamkorlik qiladi. J Exp Med 175 (3): 671-682

14. Papone V, Verolo C, Zafaroni L, Batlle A, Capo C, Bueno L va boshqalar (2015) An'anaviy metodologiya va metagenomika yordamida surunkali periodontitli Urugvay populyatsiyasida periodontal patogenlarni aniqlash va tarqalishi. Odontoestomatologiya 17(25):23-32

15. Butera A, Gallo S, Maiorani C, Molino D, Chiesa A, Preda C, Scribante A (2021) Periodontal terapiyada xlorheksidinga probiyotik alternativ: klinik va mikrobiologik parametrlarni baholash. Mikroorganizmlar 9(1):69

16. Vang Y, Li X, Ge T, Xiao Y, Liao Y, Cui Y va boshqalar (2016) Bolalarda nafas olish yo'llari infektsiyalarining oldini olish va davolash uchun probiyotiklar: randomizatsiyalangan nazorat ostidagi sinovlarni tizimli ko'rib chiqish va meta-tahlil. Tibbiyot 95(31):e4509. https://doi.org/10.1097/ MD.0000000000004509

17. Laufer AS, Metlay JP, Gent JF, Fennie KP, Kong Y, Pettigrew MM (2011) Yuqori nafas yo'llarining mikrobial jamoalari va bolalarda otit ommaviy axborot vositalari. mBio 2(1):e00245-10. https://doi.org/10. 1128/mBio.00245-10

18. Chen YT, Hsieh PS, Xo HH, Hsieh SH, Kuo YW, Yang SF, Lin CW (2020) Og'iz patogenlariga qarshi yashovchan va issiqlik bilan o'ldirilgan probiyotik shtammlarning antibakterial faolligi. Lett Appl Microbiol 70(4):310–317

19. Bonifait L, Chandad F, Grenier D (2009) Og'iz bo'shlig'i salomatligi uchun probiyotiklar: afsona yoki haqiqat? J Can Dent Assoc 75(8):585–90

20. Hsieh PS, An Y, Tsai YC, Chen YC, Chuang CJ, Zeng CT, King AE (2013) In vitroda epiteliya va immun hujayralarining yallig'lanish reaktsiyalarini modulyatsiya qilish uchun probiyotik shtammlarning potentsiali. Yangi mikrobiol 36(2):167–179

21. Elrefaei M, Burke CM, Baker CA, Jones NG, Bousheri S, Bangsberg DR, Cao H (2009) OIVga xos CD8+ T hujayralari tomonidan TGF- va IL{3}} ishlab chiqarilishi CTLA{ tomonidan boshqariladi. {5}} CD{6}} T hujayralarida signal. PloS ONE 4(12):e8194

22. Ranganatan V, Axila CH (2019) Streptococcus mutans: U og'iz orqali namoyon bo'lishning asosiy jinoyatchisiga aylandimi? J Microbiol Exp 7(4):207–213

23. Almeida CC, Lorena SLS, Pavan CR, Akasaka HMI, Mesquita MA (2012) Lactobacillus casei Shirota va Bifidobacterium breve Yakult probiyotik birikmasini uzoq muddatli iste'mol qilishning foydali ta'siri laktozaga chidamli bemorlarda terapiya to'xtatilgandan keyin ham davom etishi mumkin. Nutr Clin Pract 27(2):247–251

24. Braathen G, Ingildsen V, Twetman S, Erikson D, Yorgensen MR (2017) Tuprikda Lactobacillus reuteri mavjudligi probiyotik pastillarni qabul qilgandan keyin yosh kattalardagi yuqori tuprik IgA bilan mos keladi. Foydali mikroblar 8(1):17–22

25. Scharek L, Guth J, Filter M, Schmidt MFG (2007) Probiyotik bakteriyalar Enterococcus faecium NCIMB 10415 (SF68) va Bacillus cereus var. sizga NCIMB 40112 zardobda IgG va najas IgA ni ishlab chiqish bo'yicha cho'chqalar va ularning cho'chqa go'shti. Arch Anim Nutr 61 (4): 223–234

26. Ebrahimpour-Koujan S, Milajerdi A, Larijani B, Esmaillzadeh A (2020) Probiyotiklarning tuprik sitokinlari va immunoglobulinlarga ta'siri: klinik sinovlarda tizimli ko'rib chiqish va meta-tahlil. Ilmiy vakil 10(1):1–11

27. Ou CC, Lin SL, Tsai JJ, Lin MY (2011) Issiqlik bilan o'ldirilgan sut kislotasi bakteriyalari immun javobni Th1 polarizatsiyasiga burish orqali immunomodulator potentsialni oshiradi. J Food Sci 76(5):M260–M267. https://doi.org/10.1111/j.1750-3841.2011. 02161.x

28. Nair MS, Amalaradjou MA, Venkitanarayanan K (2017) Mikrobial patogenezga qarshi kurashda probiyotiklarning antivirulent xususiyatlari. Adv Appl Microbiol 98:1–29

29. Wu MH, Pan TM, Wu YJ, Chang SJ, Chang MS, Hu CY (2010) Probiyotik bifidobakteriyalardan ekzopolisakkaridlar faoliyati: Immunomodulyator ta'siri (J774A. 1 makrofaglarida) va mikroblarga qarshi xususiyatlar. Int J Food Microbiol 144(1):104-110

30. Yalang oyoq SF, Klaenhammer TR (1983) Lactobacillus acidophilus tomonidan ishlab chiqarilgan bakteriotsin bo'lgan laktasin B ning aniqlanishi va faolligi. Appl Environ Microbiol 45(6):1808–1815

31. Kim PI, Sohng JK, Sung C, Joo HS, Kim EM, Yamaguchi T, Kim BG (2010) Staphylococcus hominis MBBL 2-9 tomonidan ishlab chiqarilgan antimikrobiyal peptid, homininning xarakteristikasi va tuzilishini aniqlash. Biochem Biophys Res Commun 399(2):133–138

32. Pike N, Berlanga M, Miñana-Galbis D (2019) Issiqlik bilan o'ldirilgan (Tindallashtirilgan) probiyotiklarning sog'liq uchun foydalari: umumiy ko'rinish. Int J Mol Sci 20(10):2534