Telomerik oqsil TRF2 ifoda regulyatorlari uchun yangi ekran TRF2 ga bog'liq immunosupressiya va o'simta o'sishiga putur etkazadigan kichik molekulalarni aniqladi.

Iltimos, murojaat qilingoscar.xiao@wecistanche.comqo'shimcha ma'lumot uchun

Oddiy xulosa:Telomerik protein TRF2 (Telomerik takroriy bog'lovchi omil 2) inson saratonida yuqori darajada tartibga solinadi va yomon prognoz bilan bog'liq. TRF2 onkogen xususiyatlari uning ichki telomerni himoya qilish roliga, balki immunosupressiv va angiogenik faoliyat orqali hujayra-tashqi ta'sirga ham tayanadi. Shu sababli, TRF2 ni nishonga olish saratonga qarshi istiqbolli terapevtik strategiya sifatida namoyon bo'ladi. Ushbu tadqiqotda biz TRF2 ingibitorlarini skrining uchun hujayra asosidagi usulni ishlab chiqdik, bu bizga in vivo jonli ravishda TRF2 pro-onkogen xususiyatlarini yo'qotadigan ikkita birikmani aniqlash imkonini beradi.

Xulosa: Telomerik takroriy bog'lovchi omil 2 (TRIF2) telomerlarni DNKning kiruvchi reaktsiyasi (DDR) faollashuvi bilan bog'laydigan va himoya qiladigan boshpana oqsili kompleksining bir qismidir. TRF2 ifodasi qarish va saraton kasalligida muhim rol o'ynaydi, hujayra qarishi paytida pastga tartibga solinadi va onkogenez paytida haddan tashqari ifodalanadi. TRF2 ni haddan tashqari ko'rsatadigan saratonlar ko'pincha yomon prognoz ko'rsatadi. Saraton hujayralarida TRF2 neo-angiogenez va immunosupressiyani rag'batlantiradigan telomerlarni himoya qilish va hujayra bo'lmagan avtonom rollarni o'z ichiga olgan bir nechta funktsiyalarni bajaradi.puritans vitamin CBiz bu erda TRF2 ifodasini kamaytiradigan yoki oshiradigan kichik molekulalarni aniqlash imkonini beruvchi original skrining strategiyasini taqdim etamiz. Oziq-ovqat va farmatsevtika agentligi (FDA) tomonidan tasdiqlangan dori vositalarining kichik kutubxonasini skrining qilish orqali biz sichqonchada TRF2 ifodasini pasaytirib, oʻsimta oʻsishi, neo-angiogenez va immunosupressiyani buzadigan ikkita molekulani (AR-A014418 va aleksidin-2HCl) aniqladik. ksenograf modeli. Ushbu natijalar insonning agressiv o'smalarini davolash uchun TRF2 ifodasini pasaytirishning kimyoterapevtik strategiyasini qo'llab-quvvatlaydi va TRF2 ifoda darajasini modulyatsiya qilish orqali potentsial saratonga qarshi va qarishga qarshi molekulalarni skrining qilishga qodir bo'lgan ushbu hujayra asosidagi tahlilni tasdiqlaydi.

Kalit so‘zlar:TRF2; saraton; qarish; hujayra asosidagi skrining tahlili; neo-angiogenez; immunitetni bostirish

Iltimos, ko'proq bilish uchun shu yerni bosing

1.Kirish

Telomerlar chiziqli xromosomalarning uchlarida joylashgan maxsus nukleoprotein tuzilmalari bo'lib, ular telomera bilan bog'liq omillar, masalan, telomeraza, shelterin oqsil komplekslari va kodlanmaydigan telomerik takroriy o'z ichiga olgan RNK [1] bilan tartibga solinadi. To'g'ri tartibga solinsa, telomerlar xromosomalarni beqarorlik va qarishdan himoya qiladi. Telomerik DNKning qisqarishi dasturlashtirilgan fiziologik rivojlanish va qarishning bir qismi sifatida sodir bo'ladi [2]. Biroq, telomer DNKning haddan tashqari qisqarishi kam uchraydigan progeroid sindromlarni, masalan, konjenita diskeratozini keltirib chiqaradi [3]. Bundan tashqari, tartibga solinmagan telomer holatlari aholi orasida keng tarqalgan ko'plab kasalliklarga, shu jumladan saratonning deyarli barcha turlariga va bir qator degenerativ kasalliklarga ta'sir qiladi [4]. Shunday qilib, telomerning o'ziga xos tarkibiy qismlariga mo'ljallangan farmakologik davolash usullarini ishlab chiqish bunday kasalliklarning oldini olish va davolash uchun istiqbollidir.

Telomer va saratonga kelsak, DNKning hayotiy zarariga javob (DDR) nazorat nuqtalari ba'zan muvaffaqiyatsizlikka uchraydi; bu telomerik DNKning haddan tashqari qisqarishiga va aberrant xromosomalarning qayta tuzilishiga olib kelishi mumkin, bu esa o'z navbatida onkogenezga hissa qo'shishi mumkin. Bundan tashqari, telomeraza regulyatsiyasi barcha saraton kasalliklarining taxminan 90 foizi rivojlanishidagi asosiy voqeadir, chunki bu saraton hujayralarining cheksiz o'sishiga olib kelishi mumkin [5]. Shu sababli, telomeraza inhibisyonu saratonni davolash usullarini ishlab chiqishga qaratilgan bir nechta tadqiqotlarning maqsadi bo'ldi [6]. So'nggi yutuqlarga qaramay, telomerazaga qarshi dori-darmonlarni klinik qo'llashda ba'zi cheklovlar mavjud. Masalan, saraton hujayralarining ko'payishini to'xtatish uchun juda qisqa telomerik DNK uzunligiga erishish kerak va p53 o'simtani bostiruvchi geni yo'qligida qisqartirilgan telomerlarning onkogenga qarshi ta'siri yo'qoladi [7,8]. Ushbu kechikish davri terapevtik samaradorlikni pasaytiradi va hujayra yangilanishini cheklash va muqobil rekombinatsiyaga asoslangan telomer cho'zish mexanizmlarini faollashtirish orqali qarishning yon ta'sirini oshiradi [9,10].sistancheShu sababli, antitelomeraza strategiyalari allaqachon qisqa telomerlarni o'z ichiga olgan saraton hujayralarini nishonga olish uchun yaxshiroq mos bo'lishi mumkin [11].

Telomerazadan tashqari, shelterin kompleksi subbirliklarining (TRF1, TRF2, RAP1, TIN2, TPP1 va POT1) ifodasi va faoliyatidagi o'zgarishlar o'simta hosil bo'lishida va ba'zi hollarda telomer uzunligidan [12-16] mustaqil ravishda ishtirok etadi. Shunday qilib, saraton kasalligini davolash uchun shelterinni nishonga olish telomerazaga qarshi aralashuvlarga qiziqarli muqobil bo'lishi mumkin. Shel-terin subunit TRF2 qiziqarli nomzodni ifodalaydi; TRF2 insonning bir qancha malign o'smalarida, ham saraton, ham qon tomir hujayralarida haddan tashqari namoyon bo'ladi va bu odatda yomon prognoz bilan bog'liq [17-20]. Shunisi e'tiborga loyiqki, TRF2 haddan tashqari ekspressiyasi o'simtaning hujayra bo'lmagan rivojlanishini avtonom tarzda rag'batlantirishi mumkin, bu esa immunosupressiya va neo-angiogenezga olib keladi[13,18-20]Xususan, TRF2 regulyatsiyasi kuchli immunosupressiv mikro muhitni yaratadi. Geparan sulfat proteoglikanlarining ifodasini o'zgartirib, TRF2 to'g'ridan-to'g'ri miyeloid kelib chiqadigan bostiruvchi hujayralarni (MDSC) TLR2 yo'li orqali jalb qiladi va faollashtiradi [21]. Saraton hujayralarida TRF2 haddan tashqari ekspressiyasi HSPG sintezini tartibga solish orqali o'simta mikromuhitida NK hujayralarining to'planishini kuchli inhibe qilsa [13], TRF2 ning haddan tashqari ko'payishi natijasida kelib chiqqan MDSC ning TLR2 faollashuvi kuchli pasayish bilan NK hujayra immun nazoratini kuchli inhibe qilishga olib keladi. NK hujayralari degranulyatsiyasi, IFNgamma ishlab chiqarish va o'ldirish [21].cistanche nimaShunday qilib, TRF2 haddan tashqari ekspressiyasi MDSC ga bog'liq bo'lgan immunosupressiv mikro muhitni shakllantirish orqali NK hujayralarining to'planishini va bilvosita NK hujayralarining funksionalligini to'g'ridan-to'g'ri inhibe qilish orqali o'simtaga qarshi immun nazoratining dastlabki bosqichini kuchli tarzda to'xtatadi. Binobarin, saraton kasalliklarida TRF2 ni nishonga olish, qarishni rag'batlantirish, shuningdek, neo-angiogenez va immunitetdan qochish orqali hujayra-avtonom va hujayra-avtonom bo'lmagan jarayonlar orqali qimmatli ko'p zarba strategiyasi bo'lishi mumkin.

cistanche qarishga qarshi bo'lishi mumkin

Bugungi kunga kelib, TRF2 ga yo'naltirilgan barcha aniqlangan kichik birikmalar uning xromosoma uchlarini DDR dan himoya qilish qobiliyatiga putur etkazadi, shuning uchun potentsial qarish yon ta'siri [22]. Oldingi ishimiz shuni ko'rsatdiki, TRF2 ifodasining qisman qisqarishi DDR ni qo'zg'atmasdan, sichqoncha modellarida o'simtani o'z-o'zidan hujayradan tashqari ta'sir qilish orqali o'zgartirishi mumkin [13]. Shuning uchun biz uning haddan tashqari ko'payishi natijasida yuzaga keladigan saraton kasalliklarida ortiqcha TRF2 ni kamaytirishga e'tibor qaratish, saratonni qarishning yon ta'sirisiz davolash uchun qiziqarli strategiya bo'lishi mumkin deb o'yladik. Ushbu tadqiqotda biz TRF2 barqarorligiga qaratilgan kichik birikmalarni aniqlash uchun original skrining platformasini taqdim etamiz. Biz ikkita eng yaxshi xit TRF2 haddan tashqari ekspressiyasining o'simta hosil qiluvchi faolligini inhibe qilganligini ko'rsatamiz. Ushbu tadqiqot TRF2 ifodasini farmakologik modulyatsiya qilish mumkinligini va bizning skrining tahlilimiz TRF2 ifoda darajasini modulyatsiya qilishga qodir bo'lgan, potentsial saratonga qarshi va qarishga qarshi xususiyatlarga ega bo'lgan dorilarni tanlash uchun ishonchli usul ekanligini ko'rsatdi.

2. Materiallar va usullar 2.1.Hujayralar

Inson embrion buyragi (HEK)293-T hujayralari (ATCC CRL-1573) va BJ-HELTRas hujayralari[13] Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) da (Lonza, Levallua Perret, Frantsiya) o'stirildi. 10% homila buzoq zardobi (FCS), 100 IU/ml penitsillin va 100ug/ml streptomitsin (Invitrogen, Cergy Pontoise, Frantsiya).

2.2.SDS-PAGE va Western Blotting

Jami hujayra lizatlari tayyorlandi, elektroforez bilan ajratildi va yuqorida tavsiflanganidek blotlandi [14]. Qisqacha aytganda, hujayralar lizis buferida (8,76 g/L NaCl 10 mM Tris-HCL pH7,2, 0,1 foiz SDS, 0,1 foiz Triton X) yig‘ib olindi va parchalandi. -100,10 g/L natriy deoksixolat, 5 mM etilendiamintetraasetik kislota (EDTA), 1{{50}} ug/ml leupeptin, 1 mM AEBSF va 19 ug/ml aprotinin). Keyin namunalar BCA protein tahlili to'plami (Interchim, Monlucon, Frantsiya) yordamida titrlangan. Namunalar (60 ug/yo'lak) yuklash tamponida (500 mM Tris-HCl, 100 mM DTI, 2 foiz SDS, 0,1 foiz bromofenol ko'k, 10 foiz glitserin pH 6,8) 5 daqiqa davomida 95 daraja qizdirildi. Keyin namunalar 10 foizli poliakrilamid jellarga yuklandi va 160 V da 45 daqiqa davomida ishladi. Keyin oqsillar Trans-Blot SD yarim quruq elektroforetik uzatish xujayrasi (bio-) yordamida Immobilon-FL membranalariga (Millipore, Nyu-York shtati, AQSh) o'tkazildi. Rad, Hercules, CA, AQSH). Membranalar birlamchi antikorlar aralashmasi (mouselgGl anti-TRF2 1 da suyultirilgan) bilan 4 gradusda tungi inkubatsiyadan oldin Intercept Blocking buferida (LI COR, Linkoln, NE, AQSH) 1 soat davomida bloklandi. 250;va quyon IgGanti-Beta-aktin 0,5% Tween20 ni o'z ichiga olgan Intercept Blocking buferida 1:10,000) da suyultiriladi. PBS 0,1% Tween20 da yuvilgandan so'ng, membranalar ikkilamchi antikorlar aralashmasi bilan 0,25% Tween20 ni o'z ichiga olgan Intercept blokirovkalash buferida xona haroratida 1 soat davomida inkubatsiya qilindi: anti-TRF2 antikori uchun echki-sichqoncha IRDye 680 va echki IRDye qarshi. Anti-Beta-aktin antikorlari uchun 800CW (1:15,000 suyultirish).Qarishga qarshi sistancheIshlatilgan birlamchi va IRDye ikkilamchi antikorlari quyida antikorlar jadvalida keltirilgan (1-jadval). Nihoyat, LiCor Odyssey 9120 ko'rish tizimi (LI-COR) yordamida oqsil guruhlari vizualizatsiya qilindi. TRF2 ifodasi TRF2 tarmoqli intensivligini aktin tasmasi va fonning intensivligiga normallashtirish orqali o'lchandi.

2.3.Klonlash strategiyasi

Inson TRF2 cDNK ketma-ketligi OIV-SFFV-GFP-WPRE hosilasi bo'lgan lentiviral SFFV-GPR plazmidining BamHI/BclI cheklash joylari o'rtasida klonlangan [23]. SFFV-GPR plazmidida yashil lyuminestsent oqsil (GFP), puromisinga qarshilik oqsili va Tag-qizil lyuminestsent oqsil (RFP)-T (S158T mutatsiyaga uchragan teg) uchun cDNK ketma-ketligini o'z ichiga olgan GPR polikistronik genini boshqaruvchi taloq fokus hosil qiluvchi virus (SFV) promotori mavjud. -RFP), har biri E2 va T2 Picornaviridae ketma-ketligi bilan ajratilgan. hTRF2 cDNK RFP-TRF2 termoyadroviy oqsilining ifodalanishini ta'minlash uchun RFP-T ning C-terminal mintaqasiga o'rnatildi.

2.4.Lentivirus ishlab chiqarish

Lentivirus ishlab chiqarish uchun 5 × 10* HEK 293-T hujayralari 8,6 ug bo'sh SFFV-GPR yoki RFP-TRF2-SFFV-GPR vektorini ifodalovchi, 8,6 ug Lenti bilan transfektsiya qilindi. -Delta 8,91 va 2,8 ug VSV-g kaltsiy fosfat vositachiligida transfeksiya orqali. Transfektsiyalangan hujayralar DMEMda 10 foizli FCS bilan 37 daraja haroratda 5 foiz CO2 bilan 10- sm idishlarda yetishtirildi. Tarkibida yangi hosil boʻlgan viruslar boʻlgan supernatantlar 48 soatdan soʻng yigʻilib, soʻng 0.{25}}mkm Millipor filtridan oʻtkazildi. Virus titrlashdan so'ng, TRF2 nuqsonlariga chidamliligi uchun tanlangan BJ-HELTRas hujayra chizig'ini yuqtirish uchun 1∶1 （virus∶hujayra） nisbati ishlatilgan [13].cistanche beefíciosGFP va birlashtirilgan RFP-TRF2 oqsilini o'rtacha darajaga ifodalagan klon keyin flüoresans bilan faollashtirilgan hujayralarni saralash (FACS) bilan ajratildi.

2.5.Flow sitometriya skriningi

SFFV-GPR vektorini o'z ichiga olgan va RFP-TRF2 termoyadroviy oqsilini ifodalovchi BJ-HELTRas klonal chiziq hujayralari 10% FCS va 1% penitsillin/streptomitsin bilan to'ldirilgan DMEM muhitida 96-quduq plastinkalarida yetishtirildi. 24 soatlik dori bilan davolashdan so'ng hujayralar tripsinlanadi va 0,5 foizli formaldegid (FA) bilan mahkamlashdan oldin 0,5 mM EDTA va 2 foiz FCS o'z ichiga olgan fosfat-buferli sho'r suvda (PBS) yuviladi. FacsCalibur yuqori o'tkazuvchanlik namunasi (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, AQSh) yordamida oqim sitometriyasini o'tkazish.

2.6.Real vaqtdagi miqdoriy polimeraza zanjiri reaktsiyasi (RT-qPCR)

Jami RNK RNeasy Mini Kit (Qiagen, Venlo, Niderlandiya) yordamida ajratilgan. Teskari transkripsiya Superscript II teskari transkriptaza (Invitrogen) yordamida 1 ug umumiy RNK bilan amalga oshirildi. Har bir genning ifodasi GAPDH ga normallashtirildi. Quyidagi primerlardan foydalanilgan: hTRF2 Fw 5'-GCTGCCTGACTIGAACAGT-3';hTRF2 Rv 5'-CCGTTCCAACCACCCCTC-3';hGAPDHFw5'-AGCCACATCGCTCCAGACAC-3'hGAPDGACCACAC-3'hGAPDGAACCCATGv 14}}. 2.7.AlamarBlue

96-Quduq tekis taglikli plastinkada har bir quduqqa 5 × 103 hujayra 200 uL DMEMsupga ekilgan - 10 foizli FCS bilan to'ldirilgan. Dori bilan davolashdan 24 soat o'tgach, 10 uL AlamarBlue (Bio-Rad) qo'shildi va absorbans Spectrostar Nano plastinka o'quvchi (BMGLabtech, Ortenberg, Germaniya) da 36 soat davomida 570 nm va 600 nm da o'lchandi. AlamarBlue ning oksidlanish-qaytarilish foizi ishlab chiqaruvchi tomonidan ta'riflanganidek aniqlangan.

2.8.Hayvonlar

Tajribalar Janvier Labs (Fransiya) dan 8- - 12- haftalik NMRI yalang'och urg'ochi sichqonlarda o'tkazildi. Barcha sichqoncha tajribalari mahalliy va xalqaro institutsional ko'rsatmalarga muvofiq o'tkazildi va IRCAN hayvonlarni parvarish qilish qo'mitasi va mintaqaviy (CIEPAL Cote d'Azur #187 va #188) va milliy (Frantsiya tadqiqot vazirligi #03482.01/02482.2) tomonidan tasdiqlangan. va № 02973.01/02973.2) vakolatli organlar.

2.9.O'smalarning o'sishi bo'yicha tajribalar

Har bir NMRI yalang'och sichqonchaning orqa qismiga teri ostiga 1 x 106 BJ-HELTRas xujayralari 100 mL PBS (har bir guruh uchun n =8 sichqon)da to'xtatilgan holda AOK qilingan. Sichqonlar 16, 18, 20 va 22-kunlarda 100 uL DMSO (45 foiz), aleksidin-2HCl (1 mg/kg) yoki AR-A014418 (5 mg/kg) intraperitoneal in'ektsiyalari bilan davolandi. keyin 26-kungacha kuzatildi. O'simta ko'rinishi har kuni palpatsiya bilan baholandi. Shish hajmi har 2-3 kunda kaliper yordamida o'lchandi. Keyin o'simta hajmi yarim ellipsoid formulasi yordamida aniqlandi: p × (L × 1 × h)/6, bu erda L mos ravishda o'simta uzunligiga, I kengligiga va h balandligiga mos keladi.

2.10.Matrigel Plug tahlillari

BJ-HELTRas hujayralari 2 kun davomida DMSO (1 foiz), aleksidin-2HCl (1 uM) yoki AR-A014418 （10 mM） bilan ishlov berildi. Keyin, PBSda to'xtatilgan 1 × 10 daraja ishlov berilgan 100 mkL hujayralar va 400 ul o'sish omili kamaytirilgan Matrigel (Korning, Nyu-York, AQSh) izofluranli behushlik ostida NMRI yalang'och sichqonlarning orqa qismiga teri ostiga emlandi. Emlashdan keyingi 5-kuni, Matrigel tiqinlari yig'ib olindi va infiltratsiya qiluvchi hujayralar dispaza (Korning), kollagenaza A (Roche, Beyl, Shveytsariya) va DNKseI (Roche) hazm qilish orqali 30 daqiqa davomida 37 daraja [13] orqali fermentativ dissotsiatsiya yo'li bilan yig'ildi. ]. Birlashtirilgan antikorlar bilan 30 daqiqa davomida 4 gradusda bo'yashdan oldin hujayralar Fe-Block anti-CD16/CD32 antikorlari (klon 2.4G2) bilan muz ustida 15 daqiqa davomida to'yingan. Amaldagi konjugatsiyalangan antikorlar antikorlar jadvalida keltirilgan. Hujayralar PBSda 0,5 mM EDTA, 2 foiz FCS bilan yuvildi va 0,5 foiz FA bilan mahkamlandi. Bo'yalgan hujayralar DIVA6 dasturiy ta'minoti (BD Biosciences) va FlowJo 10 (LLC) bilan ARIA III sitometri yordamida tahlil qilindi.

2.11.Statistika

Barcha grafikalar va statistik tahlillar GraphPad Prism dasturi (San-Diego, CA, AQSH) yordamida ishlab chiqarilgan. Barcha natijalar oʻrtacha ± standart ogʻish (sd) yoki oʻrtacha ± standart xato (SEM) sifatida ifodalanadi. Vositalar orasidagi sezilarli farqlar Mann-Whitney ikki dumli testi yordamida aniqlandi. Log-rank (Mantel-Cox) testi shish paydo bo'lishini aniqlash uchun ishlatilgan. Har bir test uchun, p<0.05 was="" considered="" statistically="">

3.Natijalar

3.1.TRF2 ingibitor molekulalarini aniqlash

TRF2 oqsil darajasini modulyatsiya qilishga qodir dori-darmonlarni skrining qilish uchun biz GFP genini va TRF2 ning N-terminaliga birlashtirilgan RFPni birgalikda transkripsiya qilish uchun lentiviral tizimdan foydalandik. Boshqa joyda tavsiflangan umumiy strategiyadan so'ng [23] biz GRT lentivirusini yaratdik, unda SFFV promouteri GFP, puromisinga qarshilik oqsili va RFP-TRF2 yoki RFP ni kodlovchi poli-tsistronik gen ekspressiyasini faqat nazorat sifatida boshqargan (rasm). 1A). Shunday qilib, barcha transduktsiya qilingan hujayralar ham GFP, ham RFP-TRF2 ni ifodaladi. Ushbu tizim oqim sitometriyasi yordamida RFP intensivligini o'lchash orqali TRF2 ifodasini modulyatsiya qiluvchi dorilarni aniqlash uchun mo'ljallangan, GFP intensivligi esa reportyor konstruktsiyasining transkripsiyasi uchun ichki nazorat bo'lib xizmat qiladi.

Biz GRT lentiviruslarini SV40 va hTERT tomonidan abadiylashtirilgan va Ras v12 [13] tomonidan onkogen holga keltirgan inson BJ-HELTRas fibroblastlariga aylantirdik. TRF2 ning yuqoriga va pastga regulyatsiyasini o'lchashni osonlashtirish uchun GFP va RFP-TRF2 oqsillarini o'rtacha darajada ifodalovchi puromisinga chidamli klon FACS saralash yordamida ajratildi va GRI-BJ-HELTRas deb nomlandi (1A-rasm). Ijobiy nazorat sifatida biz GRT-BJ-HELTRas hujayralarini 24 soat davomida 10 umM gemsitabin, ilgari tasvirlangan TRF2 barqarorligi modulyatori [24] bilan davolashdik. Bo'sh vektor bilan transduktsiya qilingan hujayralarda RFP modulyatsiyasi aniqlanmagan bo'lsa-da, gemsitabin bilan ishlov berilgan GRT-BJ-HELTRas hujayralarida DMSO bilan ishlov berilgan nazoratga (82 foiz) nisbatan RFP/GFP o'rtacha floresans intensivligi (MFI) nisbatida sezilarli pasayish kuzatildi. nazorat qilish; p<0.0001)(figure 1b).moreover,="" gemcitabine="" specifically="" diminished="" rfp-trf2="" protein="" levels="" without="" affecting="" gfp="" levels="" (figure="" s1a).="" of="" note,="" we="" observed="" here="" that="" gemcitabine="" is="" reducing="" trf2="" level="" in="" contrast="" to="" the="" published="" work[24],="" a="" difference="" that="" may="" be="" explained="" by="" cell="" type="" differences="" in="" the="" dna="" damage="" response="" induced="" by="" gemcitabine="" since="" trf2="" stability="" can="" be="" altered="" in="" a="" p53-dependent="" manner="" [25].="" this="" effect="" was="" further="" confirmed="" by="" western="" blotting="" analyses="" where="" we="" observed="" that="" endogenous="" trf2="" levels="" were="" affected="" by="" gemcitabine="" treatment="" on="" untrans-duced="" bj-heltras="" cells="" (figure="" s1b).therefore,="" grt-bj-heltras="" cells="" enabled="" detection="" of="" specific="" variations="" in="" trf2="" protein="" levels="" induced="" by="" drug="" treatment.="" or="" gemcitabine="" (right="" panel)(n=""><0.001;two-tailed student'st="" test).="" (c)representative="" rfp/gfp="" flow="" cytometry="" plots="" of="" trf2="" vector-transduced="" bj-heltras="" cells="" treated="" with="" 10="" um="" of="" alexidine-2hcl,="" ar-a014418="" or="" dmso="" (left="" panel).="" box-plot="" quantification="" of="" rfp-trf2="" fusion="" (trf2="" vector)="" proftein="" levels="" following="" treatment="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418(right="" panel)(n=""><0.05;mann-whitney test).(d)representative="" western="" blotting="" showing="" reduced="" trf2="" protein="" levels="" following="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" in="" untransduced="" bj-heltras="" cells="" (left="" panel;="" full="" western="" lolotting="" image="" is="" presented="" in="" figure="" s2a).="" quantification="" of="" trf2="" protein="" levels="" after="" treatment="" with="" 10="" μm="" alexidine-2hccl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" （right="" panel)(n="2;mean" +="" standard="" error="" of="" the="" mean).(e)quarntification="" of="" trf2="" mrna="" levels="" analyzed="" by="" rt-qpcr="" after="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="">

Oqim sitometriyasidan foydalanib, biz oziq-ovqat va farmatsevtika idorasi (FDA) tomonidan tasdiqlangan 396 ta farmakologik birikmalarni biologik jarayonlarning oltita asosiy toifasiga: ion kanallari, fosfatazalar, kinazlar, epigenetik omillar, yadro retseptorlari ligandlari va Wnt yo'liga yo'naltirishga qodir bo'lgan skriningdan o'tkazdik (S1C-rasm). ).GRT-BJ-HELTRas hujayralari birinchi navbatda oqim sitometriyasini tahlil qilishdan oldin 24 soat davomida 396 birikmaning har biridan 10 uM yoki DMSO bilan ishlov berildi (S1D-rasm). Bunday holda, TRF2 protein darajasini modulyatsiya qilish uchun 84 ta birikma topildi (S1D-rasm, o'ng panel; S1-jadval) va ikkinchi darajali ekran uchun ishlatilgan (S1E-rasm; S1-jadval). Ushbu ikkilamchi ekranda GRT-BJ-HELTRas hujayralarini 10 uM tanlangan birikmalar bilan davolashdan tashqari, transduktsiya qilinmagan BJ-HELTRas hujayralari yoki bo'sh vektor bilan transduktsiya qilingan BJ-HELTRas hujayralari qizil rang chiqaradigan noto'g'ri musbatlarni yo'q qilish uchun xuddi shunday ishlandi. yoki yashil avtofluoresans yoki RFP yoki GFP oqsillariga ta'sir qiladi. Keyin 18 ta eng yaxshi birikma tanlab olindi, ularning transduktsiya qilinmagan BJ-HELTRas hujayralarida endoge nous TRF2 ifodasini modulyatsiya qilish qobiliyatini aniqlash uchun G'arbiy blotga asoslangan (rasm S2A, B Jadval S1). Biz hitlarni TRF2 dozasining kamida 20 foizini (yuqoriga yoki pastga) modulyatsiya qiluvchi birikmalar sifatida aniqladik. Ushbu mezonlardan foydalangan holda, Western blotting tomonidan baholangan 18 ta doridan 9 tasi kamaygan va bitta endogen TRF2 oqsil darajasini oshirgan (S2A-rasm, S1-jadval) Keyin biz ushbu dorilar orasidan in vivo tajribalar uchun ikkita birikmani tanlashga qaror qildik. TRF2 haddan tashqari ekspressiyasining pro-onkogen ta'siriga qarshi turing. O'simta hosil qilmaydigan hujayralarda DDR faollashuvi va nojo'ya ta'sirlarning oldini olish uchun biz TRF2 dozasini na eng yuqori, na eng past darajaga tushirmagan birikmalarni tanladik. Ular orasida AR va AD ushbu mezonlarga mos edi. Ikkala birikma ham oqim sitometriyasi (1C-rasm) bilan tahlil qilingan GRT-BJ-HELTRas hujayralarida RFP-TRF2 ni, Western blotting tahlilida ko'rsatilganidek, endogen TRF2 oqsil darajasini (1D-rasm; S2A,B-rasm) va RT orqali aniqlangan TERF2 mRNK darajasini pasaytirdi. -qPCR (1E-rasm). Bundan tashqari, AR va AD ning tegishli LD50 kontsentratsiyasi bilan davolash BJ-HELTRas hujayralarida va TRF2-ortiqcha ifodalangan BJ-HELTRas hujayralarida TERF2 mRNK ifodasini kamaytirdi (S3A-C-rasm).

3.2.AR-A014418 va Aleksidin-2HCl yuqori TRF2 ifoda darajalari tomonidan berilgan o'simta hosil bo'lishini o'zgartirdi

Keyinchalik AR va AD ning o'simta o'sishiga ta'sirini baholadik. Ularning TRF2-ortiqcha ekspressiv saratonga qarshi kurashish qobiliyatini nazorat qilish uchun biz AR va ADning standart BJ-HELTRas hujayralari va TRF2-ortiqcha ifodalovchi BJ-HELTRas hujayralariga potentsial antitumorogen ta'sirini tahlil qildik. BJ-HELTRas hujayralari TRF2lentiviral vektor yoki bo'sh vektor bilan transduktsiya qilingan, so'ngra teri ostiga yalang'och sichqonlarga AOK qilingan. Keyin sichqonlar DMSO, 1 mg / kg AD yoki 5 mg / kg AR bilan 16, 18, 20 va 22 post-in'ektsiya kunlarida davolandi [26,27] (2A-rasm). Oldin xabar qilinganidek [13,21], TRF2 haddan tashqari ekspressiyasi o'simtani rag'batlantirdi. bog'lanish va o'sish in vivo (2B-D-rasm; p<0.05). treatment="" with="" neither="" ar="" nor="" ad="" impacted="" tumor="" volume="" in="" bj-heltras="" cells="" transduced="" with="" the="" empty="" vector="" (figure="" 2e,="" upper="" panels)="" neither="" tumor="" growth="" rate(figure="" 2f-h).="" by="" contrast,="" both="" drugs="" induced="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" tumor="" volume="" of="" trf2-overexpressing="" xenografted="" tumors,="" leading="" to="" significantly="" smaller="" tumor="" sizes="" at="" day="" 26="" (figure="" 2e,middle=""><001)but also="" of="" the="" tumor="" growth="" rate="" (figure="" 2f-h)="" at="" each="" time-point.="" furthermore,="" the="" vol-ume="" and="" growth="" rates="" of="" trf2-overexpressing="" tumors="" treated="" by="" the="" two="" drugs="" returned="" to="" levels="" similar="" to="" those="" of="" the="" control="" tumors,="" thus="" demonstrating="" the="" trf2-specific="" selectivity="" of="" ar="" and="" ad="" (figure="" 2e,lower="" panels).these="" results="" show="" that="" ar="" and="" ad="" treatment="" reversed="" specifically="" the="" tumorigenicity="" conferred="" by="" trf2="" overexpression.="" or）="" were="" injected="" subcutaneously（1×10°cells/100μl）into="" nmri="" nude="" mice.="" the="" mice="" were="" then="" treated="" with="" dmso,alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)="" or="" ar-a014418(5="" mg/kg)="" at="" days16,18,20="" and="" 22="" post-injection,="" then="" followed="" up="" until="" day="" 26="" (n="8" mice="" per="" group).(b-d)="" the="" percentage="" of="" tumor-free="" mice="" (b)="" and="" tumor="" volumes(c)="" were="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" in="" mice="" injected="" with="" bj-heltras="" cells="" overexpressing="" trf2(trf2="" vector)="" or="" empty="" vector.="" tumor="" take="" based="" on="" palpability="" was="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" and="" is="" represented="" as="" a="" percentage="" of="" tumor-free="" mice.p="" values="" were="" determined="" using="" the="" log-rank="" mantel-cox="" test(*=""><0.05). tumor="" volumes="" were="" assessed="" at="" different="" time-points="" (mean="" ±="" standard="" deviation);="" tumor="" volume="" at="" d.ay="" 15="" is="" represented="" in="" (d).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><0.001). (e)="" tumor="" volumes="" were="" followed="" as="" in="" (c)="" after="" repetitive="" treatments="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg),="" or="" ar-a014418(5mg/kg).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><0.0001;ns: not="" significant).(f-h)="" tumor="" growth="" rate="" of="" ar-a014418(5mg/kg)treated="" mice(f,h)="" or="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)(g,h)="" treated="" mice="" were="" determined="" by="" considering="" the="" last="" day="" before="" treatment="" for="" empty="" vector="" or="" trf2="" vector="" as="" 100%.="" variations="" of="" the="" growth="" rate="" in="" both="" treatments="" over="" the="" time="" are="" represented="" in="" (f,g)="" and="" for="" each="" time-point="" (h).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><>

3.3.AR-A014418 va Aleksidin-2HCI qarshi TRF2-Bogʻliq immunosupressiya va neo-angiogenez

AR va AD ning antitumor ta'siri TRF2 ning hujayra bo'lmagan avtonom onkogen xususiyatlarini maqsad qilib qo'yishi mumkinmi yoki yo'qligini aniqlash uchun biz immunitet hujayralarining infiltratsiyasi va faollashuvini, shuningdek, davolangan o'smalarda angiogenezni tekshirdik. Biz standart va TRF{2}}ortiqcha ifodalangan BJ-HELTRas hujayralarini (S3A-rasm) yalang'och sichqonlarga Matrigel bilan teri ostiga yuborishdan oldin 48 soat davomida 1 uM AD, 10 uM AR yoki DMSO bilan davolashdik. Matrigel tiqinlari in'ektsiyadan 5 kun o'tgach, oqim sitometriyasi yordamida o'simta mikro-muhitini tahlil qilish uchun yig'ildi (3A-rasm). Kutilganidek [13,21], TRF2 haddan tashqari ifodasi global immun hujayra (CD45 plyus hujayra) infiltratsiyasini o'zgartirmadi (3B-rasm; S4A-rasm), lekin tabiiy qotil (NK) hujayralarni jalb qilishni (3C-rasm; S4B-rasm) va NK funktsiyasini inhibe qildi. -ality (3C-E-rasm; S4C-rasm) va MDSC infiltratsiyasini oshiring (3F-rasm). TRF{25}}ayniqsa BJ-HELTRas hujayralarini haddan tashqari ifodalashda, har qanday dori bilan davolash global immun infiltratsiyasini oshirdi (3B-rasm; S4A-rasm), shuningdek, o'simta ichidagi NK hujayralarining miqdori va funksionalligi (3C-E-rasm; rasm) S4B, C). Shunisi e'tiborga loyiqki, ikkala dori ham TRF2 haddan tashqari ekspressiyasi natijasida kelib chiqqan NK hujayra vositachiligidagi immun nazoratini (CD107a plyus va CD69 plyus NK hujayrasi) inhibe qilishni to'liq qutqardi (3C-rasm). Bu MDSC ishga qabul qilinishining keskin kamayishi (3F-rasm; S4D-rasm) va monositlar va makrofaglarning ko'payishi bilan bog'liq edi (3G-rasm).

Avval xabar qilinganidek [14,20], o'simta angiogenezi nazorat o'smalariga nisbatan TRF{2}}ortiqcha ifodalangan o'smalarda yuqori bo'lgan. TRF2 haddan tashqari ekspressiyasi o'simta ichidagi CD31 va CD{5}}endotelial hujayralar miqdorini oshirgan bo'lsada (3H-rasm; S4E-rasm), ikkala dori bilan davolashdan keyin bo'sh vektor yoki TRF{8}}ortiqcha o'smalar o'rtasida farq aniqlanmadi. ing TRF2（TRF2 vektor） yoki bo‘sh vektor NMRI yalang‘och sichqonlarga Matrigel (1 × 10 daraja hujayralar) bilan teri ostiga yuborishdan 2 kun oldin 1uM aleksidin-2HCl yoki 10 mkM AR-A014418 yoki DMSO bilan ishlov berilgan. n=8). Immun va endotelial hujayralar infiltratsiyasi inyeksiyadan keyingi 5 kun ichida oqim sitometriyasi yordamida baholandi. (BH). Matrigel plagining immun infiltratsiyasini oqim sitometriyasi tahlili. Jonli hujayralar orasida Matrigel tiqinlariga infiltratsiya qiluvchi immun hujayralar soni ko'rsatilgan. Jami immun hujayra infiltratsiyasi (CD45 plyus hujayralar) (B); tabiiy qotil (NK) hujayra (NKp46 plyus hujayralar) infiltratsiyasi (C) da ko'rsatilgan; faollashtirilgan NK hujayrasi (CD107a plyus va CD69 plyus NK hujayralari) infiltratsiyasi (D, E) da ko'rsatilgan; miyeloiddan olingan bostiruvchi hujayra (MDSC;CD11b plus GR1 plus ))infiltratsiyasi (F), monosit-makrofag infiltratsiyasi (G) va endotelial hujayra infiltratsiyasi (H)da ko'rsatilgan.p Qiymatlar Mann- yordamida aniqlangan. Uitni testi (* p<><><0.001;n =="" 8="" mice="" per="">

4. Munozara

Bu erda biz telomerik oqsil TRF2 ifodasini modulyatsiya qiluvchi birikmalarni skrining qilish uchun hujayra asosidagi tahlil ishlab chiqilishi haqida xabar beramiz. FDA tomonidan tasdiqlangan molekulalarning kichik kutubxonasini tekshirish orqali biz TRF2 ifoda darajasini oshirishi yoki kamaytirishi mumkin bo'lgan birikmalarni aniqladik. Biz AD va AR TRF2 ni pasaytirganini va TRF2 ni haddan tashqari ifodalovchi o'simta hujayralari uchun xos bo'lgan anti-tumorogenik faollikni ko'rsatganini aniqladik. Ularning TRF{8}}o'ziga xos faolligini yanada ko'rsatish, AR va AD davolash TRF2 haddan tashqari ekspressiyasi tufayli kelib chiqqan immunosupressiya va neo-angiogenezni qutqardi. Ajablanarlisi shundaki, AR yoki AD bilan davolashdan so'ng TRF2 haddan tashqari ekspressiv o'smalari uchun global immun infiltratsiyasining ortishi, TRF2 haddan tashqari ifodalanganda ushbu dorilar immunitetni kuchaytirish uchun kuchliroq ekanligini ko'rsatadi. Ushbu dorilar NK hujayralari (CD107a va CD69 plyus NK hujayralari) faoliyatini tiklash orqali TRF2 haddan tashqari ekspressiyasining immunosupressiv ta'sirini inhibe qiladi va MDSC infiltratsiyasini sezilarli darajada kamaytiradi. Bu shuni ko'rsatadiki, ushbu dorilar TRFga bog'liq bo'lgan maxsus dasturni2-to'xtatib, immunitetdan qochish va immunosupressiyani qo'zg'atadi va TRF2 haddan tashqari ko'p bo'lganda immunitetni kuchaytiradigan Xavfli Molekullar (DAMP) chiqarilishini kuchaytirishi mumkin. Shunisi e'tiborga loyiqki, biz AR va AD TRF2 haddan tashqari ekspressiyasining immunosupressiv va pro-angiogen funktsiyalarini qutqarganini, TRF2 haddan tashqari ekspressiyasining ikkita xususiyatini, biz ilgari DDR mustaqil sifatida ko'rsatganimizni kuzatamiz. Shunday qilib, biz o'simta o'sishiga AR va AD ta'siri DDR-mustaqil ekanligini taxmin qildik, bu mexanizm keyingi tadqiqotlarda to'liq tavsiflanishi kerak. Ushbu kontseptsiyani isbotlovchi tadqiqot TRF2 ifodasini farmakologik jihatdan kamaytirish saratonga qarshi qimmatli strategiya bo'lishi mumkinligini isbotlaydi.

Skrining usuli TRF2 protein darajasini transkript darajasidan mustaqil ravishda hisobga olgan bo'lsa ham, ikkala dori ham endogen TERF2 mRNK darajasini pasaytirdi, bu AR va AD TRF2 regulyatsiyasining bir necha darajalarini maqsad qilganligini anglatadi. Buni qo'llab-quvvatlagan holda, AR TERF2 transkripsiyasining faollashtiruvchisi bo'lgan Wnt signalining [28] inhibitoridir [29]. Umuman olganda, Wnt signalizatsiya yo'liga qaratilgan dorilar skrining bosqichlarida boyitilgan (rasm S1B-D). Mitoxondriyani maqsad qilib qo'yuvchi vosita bo'lgan AD TRF2 ifodasiga qanday ta'sir qilishini aniqlash kerak. Yuqori TRF2 darajasini ko'rsatadigan saratonlar yomon prognozga ega va kimyoterapiyaga qarshilik kuchayganligi sababli [21], AR va AD bunday o'smalar uchun qiziqish uyg'otadigan terapevtik agentlardir. TRF2 [13] ning telomerik va pro-onkogen faolligini ajratish potentsiali TRF2 ni farmakologik jihatdan pasaytirish imkoniyatini oshiradi va shu bilan qarishning zararli yon ta'sirisiz ko'p zarbali saratonga qarshi foyda keltiradi. Shu sababli, klinik tadkikotlarda ushbu dorilarning TRF2 ifoda darajalariga sinergik ta'sirini aniqlash uchun kelajakdagi tadqiqotlar kafolatlanadi.

TRF2 turli xil inson saratonlarida [13,21] ko'tarilgan bo'lsa ham, uning ifodasi ko'plab to'qimalarning normal va patologik qarishi paytida pasaytirilgan [30,31] Bundan tashqari, TRF2 disregulyatsiyasining sichqoncha modellari bilan bog'liq bir nechta hisobotlarda TRF2 ning muhimligini ta'kidlaydi. qarish va saraton o'rtasidagi chorraha [31-35]. Shuning uchun, bu erda tasvirlangan skrining protsedurasi bilan aniqlangan molekulalar ushbu tadqiqotda tasdiqlangan TRF2 regulyatsiyasi uchun saratonga qarshi agentlar sifatida va TRF2 ni tartibga solish orqali qarishga qarshi vositalar sifatida qiziqarli dori nomzodlaridir.

Ushbu maqola Cancers 2021, 13, 2998 dan olingan. https://doi.org/10.3390/cancers13122998 https://www.mdpi.com/journal/cancers