Urolitin A ning in vitroda qoramol oositlariga qarishga qarshi ta'siri

Iltimos, murojaat qilingoscar.xiao@wecistanche.comqo'shimcha ma'lumot uchun

Annotatsiya:Oksidlanish stressi va mitoxondriyal disfunktsiya oositlar sifatining yoshga bog'liq pasayishi bilan bog'liq va hozirda ularning oldini olish strategiyalari izlanmoqda. Urolitin A (UA) proapoptotik va antioksidant ta'sirga ega tabiiy metabolit bo'lib, turli yoshdagi hujayralardagi disfunktsional mitoxondriyalarning to'planishini oldini olishga qodir. UA hech qachon qoramol oositlarida sinovdan o'tkazilmagan. Bizning maqsadimiz UA ning reproduktiv kompetentsiya bilan bog'liq muhim genlarning kümülüs-oosit-komplekslari (COCs) va granuloza hujayralari (GCs) ifodalarining rivojlanish salohiyatiga ta'sirini o'rganish edi. Yadro kamolotining rivojlanishi, mitoxondrial membrana potentsiali (MMP) va fiziologik etuk (22 soat) va in vitro yoshdagi oositlarning (30 soat IVM) rivojlanish qobiliyati, UA bilan to'ldirilgan yoki qo'shilmagan holda baholandi. Bundan tashqari, bir nechta genlarning mRNK miqdori (NFE2L2, NQO1 va mt-DN5) va mt-ND5 DNK nusxalari soni prepubertal va kattalar urg'ochilaridan olingan, UA bilan to'ldirilgan yoki qo'shilmagan holda o'stirilgan GKlarda aniqlangan. Bizning tadqiqotimiz oosit qarishining yadro kamolotining rivojlanishiga, MMP, rivojlanish kompetensiyasi va gen ekspresyon darajalariga zararli ta'sirini tasdiqladi. In vitro etuklik davrida UA bilan davolash kuchaytirildi (p<0.05) the="" maturation="" rate="" and="" subsequent="" developmental="" capacity="" of="" aged="" oocytes.="" a="" positive="" effect="">< 0.05)="" of="" ua="" on="" physiological="" maturation,="" mmp,="" and="" embryonic="" development="" was="" also="" identified.="" ua="" also="" interfered="" with="" the="" expression="" profile="" of="" nfe2l2="" and="" nqo1="" genes="" in="" gcs="" cultures.="" our="" findings="" demonstrate="" that="" ua="" supplementation="" is="" an="" effective="" way="" to="" prevent="" oocyte="" aging="" and="" improves="" the="" subsequent="" bovine="" embryonic="">

KSL01

Iltimos, ko'proq bilish uchun shu yerni bosing

Kalit so‘zlar:oosit; qarish; Urolitin A; yordamchi reproduktiv texnologiyalar

1.Kirish

Ayollarning reproduktiv qobiliyatining pasayishi keksalikka salbiy ta'sir ko'rsatadigan birinchi fiziologik funktsiyalardan biridir va shuning uchun butun dunyoda paydo bo'lgan sog'liq muammosi hisoblanadi [1,2]. Ba'zi patologik muammolarga qo'shimcha ravishda, ayollarning tug'ilish qobiliyatining yoshga bog'liq pasayishi, asosan, tuxumdonlar zahirasining pasayishi [1,{4}}] bilan bog'liq bo'lgan tuxum hujayralari sifatining vaqtga bog'liq yomonlashishi bilan bog'liq [2]. Ushbu buzilish jarayoni ovulyatsiyadan oldin oositlarning keksa tuxumdon mikro muhitiga ta'siri tufayli yuzaga kelishi mumkin. Bundan tashqari, ayol jinsiy hujayrasi ko'pincha ovulyatsiyadan keyingi qarishga duchor bo'ladi, agar urug'lantirish jarayoni eng yaxshi optimal vaqt oralig'ida sodir bo'lmasa va urug'lantirilmagan oosit uzoq vaqt davomida urug'lantirish uchun tuxum yo'lida yoki vitropriorda qoladi [6] oosit sifati yordamchi reproduktiv texnologiyalarning (ART) muvaffaqiyatsizligi bilan bog'liq bo'lgan hal qiluvchi omil hisoblanadi, chunki uning sifati urug'lantirilgandan keyin embrionning rivojlanish potentsialini belgilovchi asosiy omil hisoblanadi [7,8]. Ovulyatsiya asinxroniyasi va keksa oositlar ko'pincha toychoq, qoramol va qo'ylarda sun'iy urug'lantirish va embrion ishlab chiqarish dasturlari muvaffaqiyatiga putur etkazadi, bu esa muhim iqtisodiy yo'qotishlarga olib keladi[1,9,10]. Shu sababli, bir nechta turlarda, shu jumladan odamlarda, shuningdek, chorva mollarini genetik jihatdan yaxshilash vositasi sifatida unumdorlikni saqlab qolish uchun yaxshiroq terapevtik yondashuvlarni ishlab chiqish uchun oositlarning qarishi mexanizmlarini o'rganish muhim ahamiyatga ega.cistanche wirkungAlohida e'tibor ko'pincha irsiy o'sishni tezlashtirish va nasl oraliqlarini qisqartirish uchun ishlatiladigan prepubertal qoramollardagi oositlarning rivojlanish qobiliyatini yaxshilashga qaratish kerak.

Keksa oositlarda rivojlanish qobiliyatining buzilishining asosiy sabablaridan biri bu mitoxondriyal disfunktsiyani, DNKning shikastlanishini va shpindel shakllanishidagi xatolarni keltirib chiqaradigan oksidlovchi stressning kuchayishi, oosit sifatiga ta'sir qiladi [1]. Erkin radikallar ishlab chiqarishning ko'payishi ko'plab surunkali kasalliklarda, shuningdek reproduktiv biologiyada hujayra qarishining sababi bo'lib, tug'ilishning yomon natijalariga olib kelishi yaxshi tasdiqlangan [12]. Oositlar va granuloza hujayralarini (GC) o'z ichiga olgan tuxumdon mikro muhiti oksidlanish sharoitlarini tartibga solish va oksidlovchi/antioksidant muvozanatini saqlashga qodir bo'lgan antioksidant himoya mexanizmini ta'minlaydi [13]. Shu bilan birga, qarish jarayonida reaktiv kislorod turlarini (ROS) zararsizlantirish uchun antioksidant mudofaa samaradorligi pasayadi, bu esa oksidlovchi stress darajasini oshiradi. Yadro omili-E2-bog'liq omil2(Nrf2 yoki NFE2L2), shuningdek, Nrf2/Kelchga o'xshash ECH bilan bog'langan protein 1 (Keap1) yo'li sifatida ham tanilgan, oksidlovchi stress bilan faollashtirilgan dominant javob kaskadidir[14]. Bu yo'l hujayralar oksidlovchi stressning zararli ta'sirini engish uchun ishlab chiqilgan hujayra himoya mexanizmidir. Oddiy sharoitlarda Nrf2 Keap1 tomonidan salbiy tartibga solinadi, sitoplazmada saqlanadi va past darajada saqlanadi. Oksidlovchilarga ta'sir qilganda, Nrf2 Keapldan ajralib chiqadi, bu uning yadroda ma'lum DNK ketma-ketliklari bilan bog'lanishiga imkon beradi. Antioksidant javob elementlari (ARE) deb nomlangan ushbu ketma-ketliklar NAD(P)H:xinon-oksidoredüktaza-1 (NQO1), gemoksigenaza-1 (HMOX1) kabi sitoprotektiv genlarning transkripsiyaviy faollashuviga olib keladi. , va glutamat-sistein ligaza katalitik subunit (GCLC) [15,16]. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Nrf{26}}Keapl signalizatsiya yo'lining faollashishi insonning GK va sichqon tuxumdonlarida antioksidant darajasini oshirish orqali oksidlovchi stress zararini kamaytiradi[17,18]. Biroq, uning ayol jinsiy hujayralarining qarishi jarayonida roli aniq bo'lib qolmoqda, garchi bu jarayon davomida mitoxondriyalar ROS uchun asosiy ishlab chiqarish joyi ekanligi aniq belgilangan [9,10].

KSL02

Cistanche qarishga qarshi bo'lishi mumkin

Aksincha, mitoxondriyalar bir nechta muhim hujayra funktsiyalarida ishtirok etadilar va oositlarning kamolotga etishi va keyingi embrion rivojlanishi davrida zarur bo'lgan energiya ishlab chiqarish talabini qondirish uchun asosiy hisoblanadi [19]. Vakolatli mitoxondriyal faollik mitoxondriyal DNK (mt-DNK) va ATP hosil bo'lishi [20], yuqori mitoxondriyal membrana potentsiali [21] va mitofagiya [22] orqali mitoxondriya sifati va miqdorini saqlab turish bilan yuqori darajada bog'langan. Bundan tashqari, mitoxondriyal faollik embrion hayotiyligi va tug'ilishning yaxshi natijalari bilan bevosita bog'liqligi taklif qilingan [23]. Ko'payib borayotgan dalillar yoshga bog'liq mitoxondrial o'zgarishlar tuxumdonlarning qarishiga va keyinchalik embrionning hayotiyligi va implantatsiya potentsialiga olib kelishini tasdiqlaydi. Ushbu o'zgarishlar mt-DNK nusxasi sonining kamayishi, ATP generatsiyasining kamayishi [20], mitoxondrial gen ekspresyonidagi o'zgarishlar [24, mt-DNKning shikastlanishi [25] va mitoxondriyal membrana potentsialining pasayishi [26].

KSL03

Mitoxondriyaga yo'naltirilgan terapevtik yondashuvlar mitoxondriyal funktsiyani kuchaytirishda katta salohiyatga ega bo'lganligi sababli qarish bilan bog'liq bir qancha patologiyalarga katta qiziqish uyg'otdi [27]. Shu nuqtai nazardan, anor kabi oziq-ovqatlarni iste'mol qilgandan so'ng olingan tabiiy metabolit bo'lgan urolitin A (UA) ichak mikrobiotasi tomonidan konvertatsiya qilingan - yoshi bilan disfunktsiyali mitoxondriyalarning to'planishining oldini olish, mitofagiyani qo'zg'atish va shuningdek, mitoxondriyallikni saqlab turishi isbotlangan. biogenez va nafas olish qobiliyati [28,29]. UA kolorektal va prostata saratoni kabi ba'zi saraton kasalliklarining oldini olish uchun istiqbolli terapevtik dori sifatida qo'llanilgan [30,31]. Bundan tashqari, UA yallig'lanishga qarshi [32], semizlikka qarshi [33], antioksidant [34] va qarishga qarshi [35] xususiyatlarga ega.tsitrus bioflavonoidlariYaqinda o'tkazilgan tadqiqot qarigan inson terisi fibroblastlariga UA qo'shimchasining Nrf2-Keapl yo'lining faollashuviga ularning antioksidant qobiliyatini oshirishga ta'sirini ta'kidladi. Nrf2-Keapl yo‘lining bu faollashuvi Nrf2 quyi oqimidagi ARE-javob genlari (SOD, NQO1, GCLC va HMOX1) ifodasini ko‘tarish orqali ROS darajasini samarali tarzda yumshatadi, bu esa qarishga qarshi istiqbolli ta’sirni ko‘rsatadi [ 35].

KSL04

Tuxumdonlarning qarishini kechiktirish, natijada oosit sifati va tug'ilish natijalarini yaxshilash maqsadida bir nechta tadqiqotlar o'tkazildi. Oksidlanish stressining tuxumdonlarning qarishi jarayoniga, shuningdek, mitoxondriyal disfunktsiyaga qo'shgan hissasi tufayli antioksidantlar bilan qo'shimchalar istiqbolli terapiya sifatida paydo bo'ldi [36,37]. Biroq, urolitin A qo'shimchasi tuxumdonlarning qarishi paytida yuzaga keladigan zararni tiklashi mumkinmi yoki yo'qmi, bu bepushtlik muammolarining oldini olishga hissa qo'shishi noma'lum. Shuning uchun, ushbu tadqiqotning maqsadi: (1) qarish kümülüs-oosit komplekslarini (COC) rivojlanish potentsialini va GC'larning Nrf2 signalizatsiya yo'lida ishtirok etadigan muhim genlarning ifodasini o'zgartirishi mumkinligini ko'rsatish; (2) UA qutqara oladimi yoki yo'qligini aniqlash. keksa KOK va GKlarda qarishga qarshi ta'sir ko'rsatadigan ayollarning tug'ilishi; va (3) Nrf2 signalizatsiya yo'lida ishtirok etadigan genlarning ifoda darajasiga, shuningdek, oosit sifatiga UA ta'sirini baholash.

2. Materiallar va usullar

2.1. Eksperimental dizayn

Ushbu tadqiqot Yevropa Ittifoqi koʻrsatmalariga (no.86/609/EEC) rioya qilgan holda, Milliy veterinariya boshqarmasi (N darajasi 08965DGAV) hayvonlarni parvarish qilish qoʻmitasi tomonidan tasdiqlangan. Qarishning oosit sifatining o'zgarishiga ta'sirini va UA ning qarishga qarshi potentsial ta'sirini o'rganish uchun in Vitro qarish (30 soatlik etuklik) yoki fiziologik etuklikka (22) topshirilgan prepubertal va kattalar sigirlaridan to'plangan COClardan foydalangan holda model. h) jarayonlar qo'llanildi.

2.1.1.Oldingi tahlil—doza-javob tadqiqoti

Qoramol COCs pishib etish jarayonida ishlatilishi kerak bo'lgan UA kontsentratsiyasini aniqlash uchun oldingi tahlil to'rtta seansda dozaga javob o'rganish asosida amalga oshirildi. UA hech qachon qoramol oositlarida sinovdan o'tkazilmaganligi sababli, ba'zi saraton kasalliklarining oldini olish va yumshatish va turli hujayra liniyalarida UA ning qarishga qarshi ta'sirini ko'rsatish uchun muvaffaqiyatli qo'llanilgan oldingi dozalar ishlatilgan [28,39]. Prepubertal va etuk sigirlardan (n=978) olingan COClar tanlab olindi va so'ngra UA ning turli dozalarini sinab ko'rish uchun tasodifiy besh guruhga bo'lingan: fiziologik in vitro etuklik davrida nazorat, 1,10,25 va 50 uM. Yetuklik davridan keyin xromosoma konfiguratsiyasi va etilish bosqichlarini aniqlash uchun ba'zi oositlar (n=154) bo'yalgan. Qolgan pishgan oositlar muzlatilgan/eritilgan sperma bilan in vitro urug'lantirishga topshirildi. Taxmin qilingan zigotalar yetishtirildi va ajralish va blastotsistlar darajasi mos ravishda madaniyatning 2 va 7 kunida aniqlandi. Olingan natijalarga, ya'ni zararli ta'sirlarning yo'qligiga va blastotsistlarning kamolotga va rivojlanishiga ko'ra, 1 uM UA kontsentratsiyasi tanlangan.

2.1.2. Tajriba 1

Oltita seansda o'tkazilgan ushbu tajribada, ikkala KOK prepubertal (o'rtacha yosh=9 oy, n=660) va kattalar (o'rtacha yosh =39oy, n=674) Sigirlar oosit sifati va keksa va fiziologik etuk oositlarning rivojlanish potentsialini, shuningdek, ayollarning tug'ilish qobiliyatini saqlab qolish uchun UA ta'sirini baholash uchun to'plangan. COClar tasodifiy 8 guruhga bo'lingan: (1) nazorat qilish prepubertal guruh, 22 soat davomida pishgan prepubertal buzoqlardan olingan COClar (n =148); (2) UA prepubertal guruh, 1 uM bilan qo'shilgan muhitda pishgan prepubertal buzoqlardan olingan COClar. 22 soat davomida UA (n=155);(3) 30 soatlik prepubertal guruhni nazorat qilish, 30 soatlik oitro etuklik davridagi (n=149) prepubertal buzoqlardan COCs;(4) 30 soatlik UA prepubertal guruh, 1 uM UA (n=144) bilan to'ldirilgan etilish muhitida 30 soat davomida in vitro yoshidagi prepubertal buzoqlardan olingan KOKlar;(5) nazorat kattalar guruhi, 22 soat davomida etuk bo'lgan kattalar sigirlaridan COCs (n=155 );(6) UA kattalar guruhi, 22 soat davomida 1 uM UA qo'shilgan muhitda pishgan katta yoshli sigirlarning COClari (n=129);(7) 30 soatlik kattalar guruhi, 30 soatgacha bo'lgan kattalar sigirlarining COClari 30 soat in oitro pishib etish (n=148); va (8) UA 30 soatlik kattalar guruhi, 1 uM UA(n=138) bilan to'ldirilgan pishib etish muhitida 30 soat davomida oitroda qarigan katta yoshli sigirlarning COClari.cynomorium foydalariTegishli in vitro etuklik davrlaridan so'ng, oositlar eritilgan sig'imli buqa urug'i bilan urug'lantirildi. Keyinchalik, embrionning rivojlanishi baholanib, ajralgan va ishlab chiqarilgan embrionlarning tezligini, shuningdek ularning sifatini baholadi.

Bundan tashqari, ushbu eksperimentda ularning yadroviy kamolot bosqichini baholash uchun har bir guruhdan COClar olindi (nazorat prepubertal guruhi, n =7; UA prepubertal guruhi, n =7; nazorat yoshidagi 30 soatlik prepubertal guruh, n { {3}}; UA 30 soatlik pubertal guruh, n=6; nazorat kattalar guruhi, n=16;UA kattalar guruhi, n=21; nazorat 30 soatlik kattalar guruhi, n{ {9}}; UA 30 soatlik kattalar guruhi, n=18).KOKlarning mitoxondrial membrana salohiyati (MP) ham baholandi (nazorat qilish prepubertal guruh, n=10; UA prepubertal guruh, n{ {13}};nazorat yoshi 30 soatlik pubertallikdan oldingi guruh,n=9;UA 30 soatlik prepubertal guruh,n=9;nazorat kattalar guruhi, n=15;UA kattalar guruhi, n{ {19}}; 30 soatlik kattalar guruhini nazorat qilish, n=10;UA, 30 soatlik kattalar guruhi, n=14).

2.1.3.Tajriba 2

GK lar follikulyar o'sish va oosit rivojlanishida muhim rol o'ynaganligi sababli, yosh va UA ning NFE2L2, NQO1 va mt-ND5 ifodasiga ta'sirini yanada o'rganish uchun beshta seansda ikkinchi tajriba o'tkazildi. mt-ND5 genining nusxalari soni ham baholandi. GKlar prepubertal (o'rtacha yoshi=10 oy) va katta yoshli sigirlarning (o'rtacha yoshi =62 oy) tuxumdonlaridan aspiratsiya qilingan follikulyar suyuqlikni santrifüjlashdan so'ng olingan. Ushbu hujayralar quyidagi sharoitlarda ekilgan: (1) pubertal nazorat, prepubertal buzoqlarning GK larini etishtirish; (2) prepubertal UA, 1 uM UA bilan to'ldirilgan prepubertal buzoqlarning GKs madaniyati; (3) kattalar nazorati, katta yoshli sigirlarning GKs madaniyati; va (4) kattalar UA, 1 uM UA bilan to'ldirilgan kattalar sigirlarining GC madaniyati. Madaniyatning 5-kunida GC qo'shilgandan so'ng, ular suyuq azotda muzlatilgan va keyinchalik NFE2L2, NQO1 va mt-ND5 mRNK transkriptlarini, shuningdek, mt-ND5 nusxalari sonini aniqlash imkonini beruvchi DNK va RNK ekstraksiya qilingan.

2.2. Oositlarni yig'ish va in vitro kamolotga etish

Voyaga etgan va balog'atga yetmagan sigirlarning tuxumdonlari (oldingi tahlil, n {0}} va eks. 1, n=1334) mahalliy so'yishxonada yig'ilib, 35-37 darajada saqlangan. 0,05 mg mL-l kanamitsin bilan to'ldirilgan 0.15 foiz sigir zardobidagi albumin (w/v, BSA) bilan to'ldirilgan fosfat-buferli sho'r suv (PBS). Laboratoriyada diametri 2-8 mm bo'lgan tuxumdon follikulalari 19-o'lchovli igna bilan aspiratsiya qilindi. Faqat kamida uchta qatlamli ixcham kümülüs hujayralari va bir hil ooplazmaga ega bo'lgan COClar yuvilgan va eksperimental dizaynga muvofiq pishib etish uchun tanlangan.cho'l sümbülüPishib etish inkubatorda 38,8 daraja, 5% CO2 namlangan havoda 22 yoki 3{8}} soat davomida 10% homila sigir zardobi, 0,2 mM natriy va 199 to‘qima madaniyati muhitidan (TCM) tashkil topgan etilish muhitida amalga oshirildi. piruvat, 10 ng ml-l epidermal o'sish omili va 10 mL-l gentamitsin【40】.

2.3.Granuloza hujayralarining to'planishi va madaniyati

Qayta tiklangan follikulyar suyuqlikdan 200x g[41] da 10 daqiqa santrifüjlashdan keyin granuloza hujayralari olindi. Palaf 1 ml madaniy muhitda (TCM199 plyus 10 foiz zardob) 5 daqiqa davomida boshqa santrifüj qilish uchun to'xtatildi. Yangi pellet 1 mL madaniy muhitda qayta suspenziya qilindi yoki 1 uM UA bilan to'ldiriladi yoki eksperimental dizaynga muvofiq emas va hujayralarni ajratish uchun kamida 30 marta 19G-ignaga biriktirilgan shprits bilan bir hil holga keltirildi. GC yashovchanligi baholangandan so'ng (tripan ko'k bo'yoq, w/v 0,4%) hujayralar 2×105 yashovchi hujayralar mL-1 konsentratsiyasida ekilgan va namlangan suvda 38,8 daraja, 5 foiz CO2 da besh kun davomida ekilgan. qo'shilishgacha atmosfera. Har 48 soatda madaniy muhit chiqariladi va yangisi bilan yangilanadi. DNK va RNK ekstraktsiyasi uchun GClar to'plangan va 200x g da 10 daqiqa davomida santrifüjlash orqali yuvilgan. Hujayra granulalari 1 ml PBSda qayta suspenziya qilindi, darhol suyuq azotda muzlatiladi va -80 darajada saqlanadi.

2.4. Oositlarning yadroviy etukligi

Yadro kamolotining bosqichlari 22 yoki 30 soatlik in vitro kamolot davridan keyin baholandi.Flavonoid olish usuli pdfDenude qilingan oositlar sirka kislotasi/etanol (1:3, v/v) eritmasida fiksatsiya qilindi va 48 soat davomida 4 darajada saqlanadi. Keyin oositlar 1 foizli aseto-lakmoid eritmasi bilan bo'yalgan, Neubauer kamerasiga o'rnatilgan va fazali kontrastli mikroskop (Olympus BX41) ostida kuzatilgan. Oositlar quyidagicha tasniflanadi: germinal vesikul (GV), kondensatsiyalanuvchi xromosomalar I (CCI), kondensatsiyalanuvchi xromosomalar II (CCII), diakinez, anafaza-I/telofaz-I (AI/TI) va MII (metafaza-II) . Faqat ko'rinadigan xromatin bo'yalgan oositlar hisobga olindi [42].

2.5. Mitoxondriyal membrana potentsialini baholash

Mitoxondriyal faollik ko'rsatkichi bo'lgan mitoxondriyal membrana potentsialini (MP) o'lchash uchun mitoxondriyalar 5, 6, 6'-tetraxloro-1, 1', 3, 3'tetraetilbenzimidazolkarbosiyanin yodidi (JC-1) bilan bo'yalgan. , Invitrogen, Waltham, MA, AQSH). Denude qilingan oositlar 5 ug ml-l JC-1 [37] bilan pishib etish muhitida 38,8 daraja va 5 foiz CO2 qorong'ida namlangan havoda 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Oositlar ikki marta PBSda yuvildi va darhol oldindan qizdirilgan slayd oynaga o'tkazildi va ko'k floresan filtri (BP 470-490 ob'ektiv UPlanFI 20 ×/0,50) yordamida floresan mikroskop (Olympus BX51) ostida kuzatildi. Keyin mitoxondriyal membrana potentsiali Image] dasturi (Milliy sog'liqni saqlash instituti, Bethesda, MD, AQSh) yordamida o'lchangan qizil/yashil floresans nisbati sifatida hisoblab chiqilgan. 2.6.In vitro urug'lantirish va embrion madaniyati

In vitro urug'lantirish 2 x 10 gradus spermatozoid mL-4 konsentratsiyasida, ilgari Perkol gradienti (45 va 90) usuli yordamida sig'imga topshirilgan Golshteyn-Friz buqasining muzlatilgan eritilgan sperma bilan amalga oshirildi. sperma 20 soat davomida 38,8 daraja va 5 foiz CO2 namlangan havoda birgalikda inkubatsiya qilindi. Keyinchalik taxminiy zigotalar BME va MEM aminokislotalari, glutamin, glutation va BSA [40] bilan to'ldirilgan sintetik tuxumdon suyuqligi (SOF) muhiti tomchilariga o'tkazildi. Urug'lantirishdan 48 soat o'tgach, ajralish tezligi (umumiy urug'langan oositlar uchun ajratilgan embrionlar) o'tkazildi va ajratilgan embrionlar BSA va homila sigir zardobining (FBS) 10 foizi bilan to'ldirilgan SOFda saqlangan. Embrionlar 12 kun davomida [41,43] blastotsist rivojlanish tezligini (7,9 va 12 kunlarda; har bir parchalangan embrionga D7 embrion) va lyukdan chiqqan embrion tezligini (D7 embrioniga lyukdan chiqqan embrion) va ularning sifatini [43] baholash uchun yetishtirildi. 7-kun embrionlari 1-darajali (yaxshi sifat), 2-sinf (adolatli sifat) va 3-darajali (yomon sifat)[4] deb tasniflangan.

2.7.DNK va RNKni ajratib olish va miqdorini aniqlash

Jami DNK va RNK ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq yuqori sof PCR shablonini tayyorlash to'plami (Roche, Bazel, Shveytsariya) va PureLinkTM RNK mini to'plami (InvitrogenTM, Waltham, MA, AQSH) yordamida GClardan ajratilgan. Ushbu protokollar RNK dan genomik DNKni olib tashlash uchun davolash sifatida yuqori sifatli umumiy DNK va RNK va DNazni ajratish uchun ishlatiladigan spin ustunlaridan foydalanishni o'z ichiga oladi[40]. Ekstraktsiyadan keyin namunalar -80 darajada saqlanadi. DNK va RNK kontsentratsiyasi va sifati NanoDropTM One/OneC Spektrofotometri (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, AQSh) yordamida aniqlangan.

2.7.1. Komplementar DNK sintezi

RNK izolatlaridan komplementar DNK (cDNK) sintezi Xpert cDNA Synthesis Mastermix to'plami (GRiSP, Portu, Portugaliya, ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq) yordamida amalga oshirildi. RNK cDNK sintezini amalga oshirish uchun har bir namunadan 500 ng olingan RNK yordamida teskari transkripsiya qilindi, termosikl (T100 Thermal Cycler, Bio-Rad, Hercules, CA, AQSH) yordamida amalga oshirildi.Olingan cDNKlar keyingi tahlillar uchun foydalanilgunga qadar -20 darajada saqlanadi.2.7.2.Primer dizayni

Ushbu tadqiqot uchun maqsadli (NFE2L2 va NQO1) va endogen nazorat geni (6-aktin) uchun primerlar Milliy Biotexnologiya Axborot Markazining (NCBI) Primer-BLAST dasturi yordamida ishlab chiqilgan (http://www. .ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/, 2020-yil 6-martda kirilgan). Yo'naltiruvchi genlar va maqsadli genlar uchun primerlar ketma-ketligi 1-jadvalda tasvirlangan. Bundan tashqari, ushbu ishda mt-ND5 geni ishlatilgan va mt-ND5 primerlari haqidagi tafsilotlar oldingi tadqiqotdan olingan [45].

2.7.3.Kontitativ teskari transkripsiyali polimeraza zanjiri reaksiyasi

Real vaqtda PCR tahlillari Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X bilan ROX yordamida QuantStudio 3 termosikl qurilmasida (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, AQSH) 25 ng uL-l konsentratsiyasida cDNK yordamida amalga oshirildi. ND5 genining mitoxondrial DNK (mt-DNK) nusxalari sonini baholash genlar miqdorini aniqlash uchun bir xil asbob-uskunalar yordamida oldindan olingan DNK orqali qPCR orqali amalga oshirildi. Har bir optimallashtirilgan reaksiya ROX bilan Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X, har bir maqsadli genning primeri (oldinga va teskari), namuna (cDNK/DNK) va umumiy hajmi 10 mkl ni tashkil etuvchi RNazsiz suvdan iborat boʻlgan. Namunalar ikki nusxada tahlil qilindi va shablon o'rniga suvni o'z ichiga olgan reaktsiyalar salbiy nazorat sifatida kiritildi. Namunalar denatürasyon fazasining 2 daqiqasi uchun 95 daraja boshlang'ich sikldan, so'ngra 55 soniya davomida 95 gradusda 40 denaturatsiya tsiklidan, 60 gradusda 30 soniya davomida 40 tavlanish tsiklidan iborat bo'lgan kuchaytirish protokoliga duchor bo'ldi (eritish haroratiga qarab). primer ketma-ketliklari) va 30 s uchun 72 daraja uzaytirish bosqichi va nihoyat, 10 daqiqaga 72 daraja yakuniy uzaytirish davri.

Gen ifodasini miqdoriy aniqlash uchun nisbiy miqdorni aniqlash usuli ishlatilgan. Gen ifodasini nisbiy miqdoriy aniqlashning ushbu usuli KT qiyosiy usuli bilan uy xo'jaligi genlari bilan normallashtirilgan o'rganilayotgan maqsadli genlarning ifoda darajalari bilan amalga oshirildi. RT-qPCR orqali kuchaytirish ikki nusxada amalga oshirilganligi sababli, har bir gen uchun o'rtacha KT qiymatlari aniqlandi va ifoda darajalari quyidagi formula yordamida hisoblab chiqildi:

bu yerda △Ct=Ct maqsadli geni -Ct endogen nazorat geni.

Nusxalarning mt-DNK sonini aniqlash uchun birlik massa usuliga nisbatan normalangan nisbiy miqdor qo'llanilgan. Ushbu usul nazorat namunalari (hozirda kalibrator sifatida belgilangan) bilan normallashtirilgan UA (sinov deb ataladi) bilan ishlov berilgan GKlarning KT qiymatlari bilan amalga oshirildi. Mt-ND5 nusxasi soni qPCR tomonidan baholangan va ikki nusxada bajarilganligi sababli, sinovlar va kalibratorlar namunalari uchun o'rtacha KT qiymatlari aniqlandi va nisbatlar quyidagi formula yordamida hisoblab chiqildi: