Cistanche Tubulosa feniletanoid glikozidlari mitoxondriyaga bog'liq yo'l orqali Eca‑109 hujayralarida apoptozni qo'zg'atadi.

Kirish

Qizilo'ngach saratoni eng ko'p uchraydigan saraton turlaridan biri bo'lib, dunyo miqyosida kasallanish darajasi bo'yicha 11-o'rinda va o'lim darajasi bo'yicha 6-o'rinda turadi va 2015 yilda ~439,{3}} o'limga sabab bo'ldi. Qizilo'ngach saratoni bilan kasallanish turli mintaqalarda, xususan, sharqiy mintaqalarda farq qiladi. 2012-yilda eng yuqori kasallanish darajasi Osiyo va Sharqiy va janubiy Afrikada, eng past ko‘rsatkich esa G‘arbiy Afrikada qayd etilgan. Xitoyda qizilo‘ngach saratoni bilan kasallanish va o‘lim holatlari mos ravishda 477,000 va 375,000 bo‘lgan. , 2015-yilda. Qizilo'ngach saratoni bilan kasallanish darajasi 2005 va 2015 yillar oralig'ida o'rta va yuqori o'rta ijtimoiy-demografik indeksli mamlakatlarda kamaygan bo'lsa-da, yomon prognoz tufayli o'lim darajasi yuqoriligicha qolmoqda. Qizilo'ngach saratonini davolashda xirurgik rezektsiyaning kimyoterapiya yoki radiatsiya terapiyasi kombinatsiyasi qo'llanilgan, ammo 2003 va 2014 yillar oralig'ida 5-yillik omon qolish darajasi saqlanib qolganligi xabar qilingan.<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studybuni ko'rsatdiCistanche tubulosa feniletanoid glikozidlari(CTPG) in vitro va in vivo melanoma B16-F10 hujayralarining o'sishini bostirishi mumkin (24). Biroq, ilgari ishlatilgan CTPG ning suvda yomon eruvchanligi dori rivojlanishini cheklaydi. Shuning uchun suvda eruvchan CTPG (CTPG-W) ishlatilgan va qizilo'ngach saraton hujayralariga (Eca-109) antitumor ta'siri o'rganilgan. CTPG-W dozaga bog'liq ravishda mitoxondrialga bog'liq yo'l orqali apoptozni induktsiya qilish orqali Eca{8}} hujayralarining hayotiyligini inhibe qilishi mumkinligi aniqlandi.

JINSIY FONKSIYONNI YASHLASHTIRISH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiallar va usullar

Hayvonlar.

C57BL/6 urgʻochi sichqonlari (6-8 hafta, ~25 g) Pekin laboratoriya hayvonlarini oʻrganish markazidan (Pekin, Xitoy) sotib olindi va harorat nazorat qilinadigan (25˚C), yorugʻlik aylanishi (12/12) xonalarda saqlanadi. 12) Shinjon universiteti hayvonot muassasasi (Urumchi, Xitoy). Barcha hayvonlar patogensiz suv va oziq-ovqat oldi.

Hujayra chizig'i va kulturasi.

Odamning qiziloʻngach karsinomasi hujayra liniyasi (Eca-109) Sintszyan asosiy biologik resurslar va genetik muhandislik laboratoriyasi (Hayotshunoslik va texnologiya kolleji, Shinjon universiteti, Urumchi, Xitoy) tomonidan saqlangan va RPMIda yetishtirilgan{{1} } o'rta (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, AQSH) 10% issiqlik bilan inaktivlangan homila sigir zardobi bilan to'ldirilgan (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Xitoy), 1% L -glutamin (100 mM), 100 U/ml penitsillin va 100 µg/ml streptomitsin 37˚C da, tarkibida 5% CO2 bo‘lgan namlangan muhitda.

Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC).

CTPG-W (kat. № SGJG20170410) Shanghai Upbio Tech Co., Ltd.dan (Shanxay, Xitoy) xarid qilingan. CTPG ning asosiy birikmalari oldingi tadqiqotimizga ko'ra HPLC tomonidan malakali va miqdoriy jihatdan aniqlangan (24). Qisqacha aytganda, HPLC ZORBAX SB‑C18 ustunida (250x4,6 mm; 5 mkm) 30˚C da o'tkazildi va 0,2% chumoli kislota eritmasi va 23% dan boshlanadigan metanol gradienti bilan elutildi, chunki har daqiqada 1 ml qo'shildi. 31% ga yetguncha 45 daqiqa davomida. Jami 10 µl namuna AOK qilingan va 330 nm da aniqlangan. Ekinakozid standarti Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Shanxay, Xitoy), akteozid standarti esa Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmshtadt, Germaniya) dan sotib olindi. Standartlar CTPG-W komponentlarini tahlil qilish uchun ishlatilgan.

MTT tahlili.

Hujayra proliferatsiyasi MTT tahlili bilan o'lchandi. Eca{0}} hujayralar 96-quduq plastinkalariga 5x103 hujayra zichligidagi 100 µl RPMI{{5}da emlandi. }} o'rta/quduq va 37˚C da 24 soat davomida o'stiriladi, so'ngra turli konsentratsiyalarda (0, 200, 400, 600 va 800 µg/ml) CTPG-W yoki 0,4% dimetil sulfoksid (DMSO) bilan 24 soat davomida ishlov beriladi, 48 va 72 soat. DMSO erituvchi nazorati sifatida ishlatilgan (800 µg/ml CTPG-W tarkibida 0,4% DMSO mavjud). Ijobiy nazorat sifatida sisplatin (20 mkg/ml) ishlatilgan. Keyinchalik, supernatant xona haroratida 5 daqiqa davomida 225 xg santrifüjdan so'ng tashlab yuborildi va har bir quduqqa 100 µl MTT eritmasi (FBSsiz RPMI{29}} muhitida 0,5 mg/ml) qo'shildi va 37˚C da 3 vaqt inkubatsiya qilindi. h. Hosil bo'lgan formazan kristallari 200 µl DMSO da eritildi. Optik zichlik (OD) qiymatlari 490 nm toʻlqin uzunligida 96-quduqli mikroplata oʻquvchi (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, AQSH) tomonidan oʻlchandi. Hujayraning nisbiy hayotiyligi quyidagi formula bo'yicha hisoblab chiqilgan: Hujayra hayotiyligi (%)=(OD-davolangan/ODulovlanmagan)x100%. Eca‑109 hujayralarining morfologiyasi teskari floresan mikroskop (kattalashtirish, x200) bilan kuzatildi (Nikon Eclipse Ti‑E; Nikon korporatsiyasi, Tokio, Yaponiya).

Splenotsitlarning ko'payishi uchun C57BL / 6 sichqonlari bachadon bo'yni dislokatsiyasi bilan evtanizatsiya qilindi va taloqlar ajratildi. Yagona hujayrali suspenziya tayyorlandi va splenotsitlar 100 µl RPMI-1640 muhitida 1x105 hujayra / quduq zichligidagi 96-quduq plastinkalariga ekildi va keyin turli konsentratsiyalar bilan ishlov berildi. (0, 200, 400, 600 va 800 µg/ml) CTPG-W 24, 48 va 72 soat davomida 37˚C da 5% CO2 bilan. Splenotsitlarning proliferatsiyasi yuqorida aytib o'tilgan protokolga muvofiq MTT tahlili bilan o'lchandi. Rag'batlantiruvchi ko'rsatkich=OD bilan ishlov berilgan/ODullanmagan.

Apoptoz va hujayra siklini o'lchash. Eca{0}} hujayralar 2,5x105 hujayra/piyola zichligidagi 60 mm idishlarda 24 soat davomida yetishtirildi va turli konsentratsiyalar bilan ishlov berildi ({{31} }, 200, 400, 600 va 800 mkg/ml) CTPG-W yoki 0,4% DMSO 24 soat davomida 37˚C da 5% CO2 bilan. Hujayralar yig'ildi va ishlab chiqaruvchining protokollariga muvofiq Annexin V-fluoressen izotiyosiyanat (FITC)/Propidium yodid (PI) apoptozni aniqlash to'plami (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanxay, Xitoy) bilan bo'yalgan. Namunalar oqim sitometriyasi (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, AQSH) orqali toʻplangan va FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, AQSh) tomonidan tahlil qilingan. CTPG-W ning hujayra sikliga ta'sirini tahlil qilish uchun 2,5x105 Eca{24}} hujayralar 60 mm madaniyatli idishlarga ekilgan va CTPG-W (0, 100, 200 va 400 mkg/ml) yoki 0,4 bilan ishlov berilgan. % DMSO 24 soat davomida 37˚C da 5% CO2 bilan. Barcha hujayralar yig'ib olindi va ikki marta muzli PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) bilan yuvildi, so'ngra 70% muzli etanolda 4 ° C da 30 daqiqa davomida mahkamlandi. Muzli sovuq PBS bilan ikki marta yuvilgandan so'ng, hujayralar xona haroratida 10 daqiqa davomida 300 µl PI/RNase bo'yash buferida (BD Biosciences, San-Xose, CA, AQSh) qayta suspenziya qilindi. Hujayra siklining taqsimlanishi ModFit LT 3.0 dasturi bilan oqim sitometriyasi (BD FACSCalibur) orqali tahlil qilindi.

TABIY CISTANCHE TUBULOSACharchoqqa qarshiJigarni himoya qilish PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mitoxondriyal membrana potentsialini (Dcm) va reaktiv kislorod turlarini (ROS) tahlil qilish.Dsm ni tahlil qilish uchun Eca{0}} hujayralari CTPG-W (0, 400, 600 va 800 mkg/ml) yoki 0,4% DMSO bilan ishlov berildi. 5% CO2 bilan 37˚C da 24 soat va ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq JC-1 (Beyotime Biotexnologiya instituti, Shanxay, Xitoy) bilan mitoxondrial membrana salohiyatini tahlil qilish to‘plami bilan bo‘yalgan, 37˚ da 20 daqiqa C. JC-1 yuvish buferi (Beyotime Biotexnologiya instituti) bilan ikki marta yuvilgandan so'ng, namunalar 300 µl JC-1 yuvish buferi bilan qayta suspenziya qilindi va oqim sitometriyasi (BD FACSCalibur) bilan tahlil qilindi. Eca‑109 hujayralarida JC‑1 bo‘yog‘ining lyuminestsentligi teskari floresan mikroskopda ham kuzatildi (kattalashtirish, x200; Nikon Eclipse Ti‑E). ROS tahlili uchun Eca{21}} hujayralari CTPG-W (0, 400, 600 va 800 mkg/ml) bilan 2, 4, 6, 12 va 24 soat davomida ishlandi va reaktiv kislorod turlari tahlili bilan boʻyaldi. to'plam (Beyotime Biotexnologiya instituti), ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq, 37˚C da 20 daqiqa. Muzli sovuq PBS bilan uch marta yuvilgandan so'ng, namunalar oqim sitometriyasi (BD FACSCalibur) orqali yig'ildi va FlowJo 7.6 dasturida tahlil qilindi.

1-rasm. CTPG-Wning malakali boshqaruvi. CTPG-W komponentlari yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi orqali sifat va miqdoriy jihatdan tahlil qilindi va echinacoside va acteosid standartlari bilan solishtirildi. CTPG-W, suvda eriydigan feniletanoid glikozidlariC. tubulosa.

2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikallarini tozalash faoliyati. CTPG-W ning erkin radikallarni tozalash faolligi e'lon qilingan protokolga muvofiq DPPH erkin radikal tahlili bilan kichik modifikatsiya bilan aniqlandi, chunki DPPH ni eritish uchun metanol etanol bilan almashtirildi (25,26). Stabil holatdagi o'lchovlar uchun etanoldagi 15{27} µl DPPH (1{29}}0 mmol/l) turli konsentratsiyali CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 va 600 µg/ml) 50 µl PBSda va qorong‘i joyda xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi. 517 nm da absorbans CTPG-W mavjudligida va yo'qligida aniqlandi. Ijobiy nazorat sifatida jami 50 µl vitamin C ishlatilgan. DPPH radikalini tozalash faolligi quyidagi formula bo'yicha hisoblab chiqilgan: Scavenging (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, bu erda Ablank - nazoratning absorbsiyasi (DPPHsiz), Namuna namunaning absorbsiyasi, A0 esa PBS ning DPPH bilan absorbsiyasidir.

Western blot tahlili. Eca{0}} hujayralar CTPG-W (0, 200, 600 mkg/ml) yoki 0,4% DMSO bilan 24 soat davomida 37˚C da 5% CO2 bilan ishlov berildi. PBS, hujayralar bilan ikki marta quyidagi yuvish 

2-rasm. CTPG-W ning Eca-109 hujayralari va splenotsitlar o'sishiga ta'siri. (A) Eca{3}} hujayralari 24, 48 va 72 soat davomida turli konsentratsiyali CTPG-W bilan ishlov berildi, so'ngra hujayra hayotiyligi MTT tahlili bilan aniqlandi. (B) 24 soatda CTPG-W bilan davolashda Eca{8}} hujayralarining morfologik o'zgarishlari. (C) C57BL / 6 sichqonlarining splenotsitlari 24, 48 va 72 soat davomida CTPG-W ning turli konsentratsiyasi bilan davolandi, so'ngra proliferatsiya MTT tahlili bilan tahlil qilindi.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

Radioimmunoprecipitation Assay Lysis buferida (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Pekin, Xitoy) muz ustida 20 daqiqa davomida lizing qilindi. 4˚C da 10 daqiqa davomida 10,000 xg santrifüjlashdan so'ng, supernatantlar yig'ildi va ishlab chiqaruvchining protokollariga muvofiq bicinxonin kislotasi to'plami (Thermo Fisher Scientific, Inc.) yordamida oqsil kontsentratsiyasi aniqlandi. Western blot tahlili avvalgi tavsifimizga muvofiq o'tkazildi (24). Kaspazaga qarshi antikorlar{6}} (kat. № D120077), kaspaza-8 (kat. № D155240), kaspaza-9 (kat. № D220078), B hujayrali limfoma{ {13}} (Bcl-2) bilan bog'liq X (Bax) (kat. № D220073) va Bcl-2 (kat. № D260117) va sichqonchaga qarshi IgG-horseradish peroksidaza (HRP) ) (kat. no. D111050) va quyonlarga qarshi IgG-HRP (kat. no. D110058) BBI Life Sciences (Shanxay, Xitoy) dan sotib olingan. Kaspaza-3 (kat. № E-AB-10050) va faol kaspaza-3 (kat. №. E-AB-22115) ga qarshi antikorlar Elabscience ( Vuxan, Xitoy). Kaspazaga qarshi boshqa antikorlar{31}} (kat. № 9492), poli (ADP-riboza) polimeraza (PARP) (kat. № 9542), sitoxrom c (kat. № AC909), c-Jun NH{ {37}}terminal kinaz (JNK) (kat. № 9252S) va -aktin (kat. № 58169) Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, AQSh) dan olingan. Barcha birlamchi va ikkilamchi antikorlar 1:1,000 nisbatda suyultirildi. Birlamchi antikorlar bir kechada 4˚C da inkubatsiya qilindi va ikkilamchi antikorlar 1 soat davomida 37˚C da inkubatsiya qilindi.

3-rasm. CTPG-W tomonidan qo'zg'atilgan Eca{1}} hujayralarining apoptozi. Hujayralar 24 soat davomida turli konsentratsiyali CTPG-W bilan ishlov berildi. (A) Apoptotik va nekrotik Eca‑109 hujayralari oqim sitometriyasi orqali tahlil qilindi. Yuqori panelda alohida nuqta chizmalari, pastki panelda esa xulosa ma'lumotlari tasvirlangan. * P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

Maqsadli oqsillar ishlab chiqaruvchining protokoliga ko'ra, kengaytirilgan xemiluminesans tahlili to'plami (Beyotime Biotexnologiya instituti) yordamida aniqlandi.

Statistik tahlil. Statistik ahamiyatlilik Tukeyning post hoc testi bilan dispersiyaning bir tomonlama tahlili orqali hisoblab chiqilgan va natijalar davolash va nazorat guruhlari orasida GraphPad Prism 5.0 dasturi (GraphPad Software, La Jolla, CA, AQSH) yordamida tahlil qilingan. Barcha ma'lumotlar o'rtacha ± standart og'ish sifatida taqdim etildi. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

BUYRAK FUNKSIYASINI YASHLASH UCHUN CISTANCHE TUBULOSA EKSTRATI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Natijalar

CTPG‑W Eca‑109 hujayralarining o'sishini bostiradi.

CTPG-W komponentlari HPLC tomonidan malakali va miqdoriy jihatdan aniqlangan (1-rasm), ular echinacoside va acteosid standartlari bilan taqqoslangan. Eng yuqori saqlash vaqtlari va eng yuqori hududlarga ko'ra, CTPG-W tarkibida 39,16% echinacoside va 2,44% akteozid mavjud. Birinchidan, CTPG-W ning Eca{8}} hujayralarining hayotiyligiga ta'siri MTT tahlili bilan aniqlandi. CTPG-W DMSOda 200 mg/ml da eritildi va 10% issiqlik bilan inaktivlangan FBS o'z ichiga olgan RPMI{11}} muhiti bilan belgilangan konsentratsiyalarga suyultirildi. Eca{14}} hujayralari CTPG-W bilan ishlov berildi va hujayra hayotiyligi ko'rsatilgan vaqt nuqtalarida MTT tahlili bilan tahlil qilindi. CTPG-W bilan davolash dozaga va vaqtga bog'liq holda Eca{16}} hujayralarining hayotiyligini sezilarli darajada pasaytirdi (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

4-rasm. CTPG-W ning Eca-109 hujayralarida hujayra siklining taqsimlanishiga ta'siri. 24 soat davomida Eca{4}} hujayralarini davolash uchun CTPG-W ning turli konsentrasiyalari ishlatilgan va hujayra siklining taqsimlanishi oqim sitometriyasi orqali tahlil qilingan. * P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

CTPG‑W Eca‑109 hujayralarida apoptozni keltirib chiqaradi. CTPG-W apoptoz yoki nekroz induktsiyasi orqali Eca{2}} hujayralarining o'sishini bostirganligini tekshirish uchun hujayralar CTPG-W ning turli konsentratsiyasi bilan ishlov berildi. 24 soatdan keyin Eca{5}} hujayralarining apoptozi va nekrozi Annexin V/PI bo'yalishi bilan aniqlandi. 3A-rasmda ko'rsatilganidek, Annexin V- / PI + hujayralari nekrotik hujayralar sifatida, Annexin V + / PI + va Annexin V + / PI- hujayralari apoptotik hujayralar sifatida o'rnatilgan. CTPG-W birinchi navbatda Eca{14}} hujayralarining apoptozini dozaga bogʻliq holda qoʻzgʻatdi, garchi nekrotik Eca{16}} hujayralari ham 600 va 800 mkg/ml CTPG-W (P) bilan davolashda sezilarli darajada oshgan.<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG‑W Eca‑109 hujayralardagi S fazasida hujayra siklini to‘xtatishga olib keladi. Saraton hujayrasi siklining buzilishi hujayra o'sishini bostiradi va apoptozni rag'batlantiradi (27). Hujayra siklining Eca{2}} hujayralarida tarqalishi 24 soat davomida CTPG-W bilan ishlov berishdan keyin PI bo'yash bilan aniqlandi. S fazasidagi hujayralar ko'payganligi va G0/G1 fazalaridagi hujayralar CTPG-W bilan davolashda umumiy sezilarli pasayishni ko'rsatganligi kuzatildi (P).<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG‑W DM ni pasaytiradi va sitoxrom c ning chiqarilishini keltirib chiqaradi. Apoptoz mitoxondriyaga bog'liq yo'l bilan qo'zg'atilishi mumkin (28,29). BCL-2 protein oilasining pro- va antiapoptotik a'zolari mitoxondriyal membrana yaxlitligini tartibga solishda muhim rol o'ynaydi (30,31). 24 soat davomida CTPG-W bilan ishlov berilgandan so'ng, DM JC-1 bo'yash yordamida baholandi. JC‑1 agregati (FL‑2 da aniqlangan qizil lyuminestsent) Dψm pasayganda monomerga (FL-1da aniqlangan yashil floresans) parchalanadi (32). 5A-rasmda tasvirlanganidek, FL-1+ FL-2-/+ hujayralarining chastotalari dozaga bog‘liq holda sezilarli darajada oshdi, bu Eca‑109 hujayralarining Dsm kamayganini ko‘rsatadi. Eca‑109 xujayralaridagi floresans o'zgarishlari teskari floresan mikroskopda ham kuzatildi (5B-rasm). CTPG‑W kontsentratsiyasining ortishi bilan qizil floresans pasaydi va yashil floresans oshdi, bu oqim sitometriyasi ma'lumotlariga mos keladi. Bundan tashqari, sitozoldagi sitoxrom c darajasi sezilarli darajada oshganligi kuzatildi (5C-rasm), bu Dsm ning qisqarishi natijasidir. Bu CTPG-W bilan davolash natijasida FL-1+ FL-2-/+ hujayralar sonining ko'payishidan olingan xulosani mustahkamlaydi, bu haqda Dpsm kamayadi. Xabar qilinishicha, JNK sitoxrom c (33-35) ning chiqarilishiga olib keladigan BCL-2 proteinlar oilasining faollashuvini tartibga solishi mumkin. Shuningdek, CTPG-W bilan davolashdan keyin JNK darajasi sezilarli darajada ko'tarilganligi aniqlandi (5C-rasm). Natijalar shuni ko'rsatdiki, CTPG-W mitoxondrialga bog'liq yo'l orqali Eca{32}} hujayralarining apoptozini qo'zg'atishi mumkin.

Shakl 5. Dsm ning kamayishi va sitoxrom c va JNKning ko'tarilishi. Eca{1}} hujayralar 24 soat davomida turli konsentratsiyali CTPG-W bilan ishlov berildi. (A) DM JC‑1 bo'yash orqali aniqlandi va namunalar oqim sitometriyasi bilan tahlil qilindi. Alohida nuqtali chizmalar JC‑1 floresansidagi o'zgarishlarni tasvirlaydi. FL-1+ FL-2-/+ katakchalarining chastotalari pastki panelda tasvirlangan. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

6-rasm. CTPG-W bilan davolashda Eca{1}} hujayralarida ROS darajasi va CTPG-W ning antioksidant faolligi. (A) Eca{4}} hujayralari turli konsentratsiyali CTPG‑W bilan ishlov berildi va ROS darajalari ko'rsatilgan vaqt nuqtalarida oqim sitometriyasi bilan tahlil qilindi. * P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

CTPG-W ning hujayra ichidagi ROS hosil bo'lishiga ta'siri.ROS apoptozni qo'zg'atish uchun DM ni kamaytirishi mumkin (36). CTPG-W ROS ishlab chiqarishni oshirishi mumkinligini o'rganish uchun Eca{2}} hujayralari turli CTPG-W kontsentratsiyasi bilan ishlov berildi. Hujayralar ko'rsatilgan vaqt nuqtalarida to'plangan va DCFH-DA bilan bo'yalgan. Eca{5}} hujayralarida hujayra ichidagi ROS ishlab chiqarilishi oqim sitometriyasi bilan aniqlandi. 6A-rasmda tasvirlanganidek, 800 µg/ml CTPG-W ROS ishlab chiqarishni 2-6 soatdan sezilarli darajada oshirdi va 12-24 soatdan kamaydi. Bundan tashqari, 400 µg/ml CTPG‑W ROS ishlab chiqarishni 12-24 soatdan sezilarli darajada oshirdi. Bundan tashqari, 200 μg/ml CTPG-W ROS ishlab chiqarishni sezilarli darajada o'zgartirmadi. ROS ishlab chiqarishdagi dinamik o'zgarishlar Eca{15}} hujayra apoptozi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Shuningdek, CTPG-W erkin radikallarni tozalash faolligiga ega ekanligi aniqlandi (6B-rasm), bu 12 soatdan keyin 800 µg/ml CTPG-W bilan ishlov berilgan Eca{18}} hujayralarida ROS ishlab chiqarishning kamayishi bilan bog‘liq bo‘lishi mumkin.

Shakl 7. CTPG-W bilan ishlov berishdan so'ng parchalangan-kaspazalar va parchalangan-PARP darajalari. Proteinlar 24 soat davomida CTPG-W bilan ishlov berilgan Eca{4}} hujayralaridan ajratib olindi va bo'lingan-kaspazalar va parchalangan-PARP darajalari western blot tahlili bilan aniqlandi. DMSO, dimetil sulfoksid; CTPG-W, suvda eriydigan feniletanoid glikozidlariC. tubulosa; PARP, poli (ADP-riboza) polimeraza.

CTPG-W kaspaza-3, kaspaza-7, kaspaza-9 va PARP faolligini oshiradi. Dsm pasayishi tufayli sitoxrom c ning chiqarilishi apoptozni qo'zg'atish uchun kaspaza proteazlarini faollashtirishi mumkin (29,30,37). 24 soat davomida CTPG-W davolashdan so'ng kaspaza -3, 7, 8, 9 va PARP faollashuvi western blot tahlili bilan aniqlandi. Nazorat bilan solishtirganda, yorilish-kaspaza-9, yorilish-kaspaza-7, kliaved-kaspaza-3 va yorilish-PARP darajalari, lekin yorilish-kaspaza{{20 darajalari emas. }}, dozaga bog'liq holda CTPG davolash orqali yuqori tartibga solindi (7-rasm). Bu natijalar shuni ko'rsatdiki, CTPG-W DM ni kamaytirdi va Eca{24}} hujayralarining apoptozini qo'zg'atuvchi kaspazalarni faollashtirish uchun sitoxrom c chiqarilishini kuchaytirdi.

Munozara

An'anaviy CHM qizilo'ngach saraton hujayralarining apoptozini turli yo'llar, shu jumladan tashqi o'lim retseptorlari va ichki mitoxondrial va endoplazmatik retikulum stress yo'llari orqali qo'zg'atishi mumkin (29). Oldingi tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, C. tubulosa ning asosiy komponenti bo'lgan CTPG mitoxondriyaga bog'liq yo'l orqali apoptozni qo'zg'atish orqali B16-F10 melanoma hujayralarining o'sishini inhibe qilgan (24). Ushbu tadqiqotda CTPG-W ning Eca{6}} hujayralariga antitumor ta'siri o'rganildi va CTPG-W Eca-109 hujayralarining o'sishini, apoptozni qo'zg'atganini va hujayra siklini to'xtatishi aniqlandi. DM ni kamaytiradi, sitoxrom c va faollashtirilgan kaspazalarning chiqarilishini oshiradi. CTPG va CTPG-W saraton hujayralarida apoptoz va hujayra siklini to'xtatishga olib kelishi mumkin. Biroq, CTPG (26,64% echinacoside, 10,19% acteosid va 1,71% isoacteosid) va CTPG-W (39,16% echinacoside va 2,44% acteosid) ning turli komponentlari tufayli aniq mexanizmlar farqlanadi. CTPG B16-F10 hujayralarini G0/G1 fazalarida hibsga oldi, ammo CTPG-W S fazasida Eca{26}} hujayralarni hibsga oldi (24). ROS ishlab chiqarish CTPG tomonidan dozaga bog'liq ravishda oshirildi, ammo bu CTPG-W ning yuqori dozasi bilan vaqtga bog'liq o'zgarishlarni ko'rsatdi, bu CTPG-W davolashning boshida sezilarli darajada oshdi (2-6 soat) va nazorat bilan solishtirganda 12 soatdan keyin sezilarli darajada kamaydi. Buning sababi shundaki, CTPG-W ning asosiy komponenti echinacoside hisoblanadi. Bir qator tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, echinacoside o'zining neyroprotektiv va qarishga qarshi ta'sirini ko'rsatish uchun ROS ishlab chiqarishni va ROS-induktsiyali apoptozni inhibe qilishi mumkin (38-40). Xuddi shunday, ushbu tadqiqotda erkin radikallarni tozalash faoliyati kuzatildi. Shu sababli, CTPG-W ning yuqori dozasidagi verbaskozid, izo-verbaskozid va salidrozidni o'z ichiga olgan ba'zi komponentlar darhol Eca{39}} hujayralarining apoptozini (41,42) keltirib chiqarishi uchun ROS hosil bo'lishiga olib kelishi mumkinligi taxmin qilingan. ROS echi tomonidan tozalandinakozid. CTPG va CTPG-W tomonidan ROS ishlab chiqarishdagi farqlarning yana bir mumkin bo'lgan sababi, ushbu tadqiqotda va oldingi tadqiqotda turli xil hujayra liniyalari ishlatilgan (24). Dong va boshqalar (43) echinacoside ROS darajasini oshirmasdan oksidlovchi DNK shikastlanishini yaratish orqali inson SW480 kolorektal saraton hujayralarining apoptozini qo'zg'atishi mumkinligini xabar qildi.

CTPG-W bilan davolash DM ni pasaytirdi va kaspazaning parchalanishiga yordam beruvchi sitoxrom c ning chiqarilishiga olib keldi -9 (28). Doimiy ravishda CTPG-W bilan ishlov berish orqali parchalangan-kaspaza-9 darajalari ko'tarildi. Keyinchalik, faol kaspaza-9 apoptozni qo'zg'atish uchun kaspazani-3 faollashtirishi mumkin (44). Cleaved-caspase-3 darajasi CTPG-W bilan ishlov berish orqali ham ko'tarildi. Biroq, kaspaza{12}} CTPG-W tomonidan faollashtirilmagan, bu tashqi o'lim retseptorlari yo'li CTPG-W tomonidan qo'zg'atilgan apoptozda ishtirok etmaganligini ko'rsatadi. Ushbu kuzatishlar shuni ko'rsatadiki, CTPG-W mitoxondrialga bog'liq yo'lni faollashtirish orqali Eca{16}} hujayralarining apoptozini qo'zg'atadi.

PARP genomik barqarorlikda muhim rol o'ynaydi va faol kaspazlar, xususan, kaspaza-3 va -7 (45) tomonidan parchalanishi mumkin. CTPG-W bilan davolash DNK ta'mirini inhibe qilish va apoptozni keltirib chiqarish uchun PARPni parchalashi mumkin bo'lgan -3 va -7 kaspazalarini faollashtirgani aniqlandi.

CTPG-W, shuningdek, dozaga va vaqtga bog'liq bo'lgan inson gepatotsellyulyar karsinomasi BEL{3}} hujayralarining o'sishini bostiradi (nashr qilinmagan ma'lumotlar). CTPG-W Eca-109 va BEL{6}} hujayralarining oʻsishini inhibe qilsa-da, splenotsitlarning koʻpayishiga yordam beradi, bu CTPG-W tarkibidagi polisaxaridlar (~50%) bilan bogʻliq boʻlishi mumkin (46). ). Xuddi shunday, bir qancha tadqiqotlar polisaxaridlar splenotsitlarning (46-49) ko'payishiga yordam berishi haqida xabar berdi. Sichqoncha modelida CTPG-W nazorat guruhi bilan solishtirganda taloq indeksini sezilarli darajada oshirgani, ammo tana vazniga va boshqa organlar indekslariga, shu jumladan yurak, jigar, buyrak va o'pkaga ta'sir qilmasligi aniqlandi (nashr qilinmagan ma'lumotlar), CTPG-W ning normal hujayralarga sitotoksik ta'siri yo'qligini ko'rsatadi.

Birgalikda ma'lumotlar shuni ko'rsatdiki, CTPG-W mitoxondriyaga bog'liq yo'l orqali apoptozni induktsiya qilish orqali Eca{1}} hujayralarining o'sishini inhibe qiladi.

JINSIY FONKSIYONNI YASHLASHTIRISH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%