QPCR va RNK-seq o'rtasidagi taqqoslash HLA ifodasini aniqlashdagi qiyinchiliklarni ochib beradi 2-qism

Normalizatsiya

Biz millionga transkriptda (TPM) ifoda baholaridan foydalandik, bu Salmon tomonidan ishlab chiqarilgan standart normalizatsiya va namunadagi berilgan transkriptning nisbiy miqdoriga mos keladi. Har qanday gen uchun taxmin shunchaki uning transkriptlari uchun TPM yig'indisidir. Ba'zi hollarda standart normal o'zgartirilgan taxminlarni ko'rsatganimizda, odatda, masalan, eQTL xaritalashning chiziqli modellarida qo'llaniladigan GenABEL R paketi (Aulchenko va boshq. 2007) yordamida RNAseq ma'lumotlarini darajali normal o'zgartirishni amalga oshirdik (Delaneau). va boshq. 2017).

QTL xaritalash - bu populyatsiyadagi gen ekspressiyasi va gen polimorfizmi o'rtasidagi bog'lanishni solishtirish orqali genlar ifodasini tartibga solish mexanizmini o'rganish usuli. Chiziqli model keng tarqalgan bo'lib qo'llaniladigan eQTL xaritalash usuli bo'lib, u gen ifodasi va gen polimorfizmi o'rtasidagi korrelyatsiyani baholash uchun chiziqli regressiya modelidan foydalanishi mumkin.

Immunitet tizimi organizmni infektsiyalar va saraton kabi kasalliklardan himoya qiluvchi murakkab biologik tizimdir. Gen ekspressiyasini tartibga solish immunitet tizimida muhim rol o'ynaydi va immunitet hujayralarining rivojlanishi, differentsiatsiyasi va funktsiyasiga ta'sir qilishi mumkin.

Shuning uchun eQTL xaritalashning chiziqli modellari gen ifodasini tartibga solish mexanizmlari va immunitet o'rtasidagi munosabatlarni tahlil qilish uchun ishlatilishi mumkin. Misol uchun, ma'lum bir genotip va populyatsiyadagi asosiy immun gen ekspressiyasi o'rtasidagi bog'liqlikni o'rganish immun gen ekspressiyasini tartibga solishda ushbu genotipning ta'sirini aniqlashi mumkin. Bunday tadqiqotlar immunitet kasalliklarini davolash va oldini olish uchun muhim ma'lumot berishi mumkin. Bu immunitetning muhimligini ko'rsatadi, shuning uchun biz har kuni immunitetimizni yaxshilashimiz kerak. Qiyma shuningdek, virusga qarshi, saratonga qarshi va boshqa ta'sirga ega, bu immunitetni mustahkamlashi mumkin Tizimning qarshilik ko'rsatish qobiliyati va tananing immunitetini yaxshilash.

Cistanchening sog'liq uchun foydalari tugmasini bosing

Malumot genomiga moslashishni o'qing

S7-rasmda keltirilgan HLA genlarida o'qish qamrovini tahlil qilish uchun biz Gencode v37 gen izohlaridan foydalangan holda o'qishlarni STAR v2.7.3a (Dobin va boshq. 2013) bilan GRCh38 mos yozuvlar genomiga moslashtirdik. HLA genlarida xaritalashning noto'g'riligini nazorat qilish uchun biz BAM fayllarini hlamapper v4.3 bilan qayta ishladik (Castelli va boshq. 2018).

Simulyatsiya

Asl haqiqat ma'lumotlari

Simulyatsiya qilingan maʼlumotlarni yaratish uchun Gencode v37 transkriptlarining ifoda darajalarini oʻrganish uchun avval Salmon v1.3.0 (Patro va boshq. 2017) №66K00003 haqiqiy namunada ishga tushirildi. Keyin biz Polyester paketidan (v1.26.0) HLA-A, -B va -C dan tashqari bir xil transkriptomlar bo'ylab ifoda darajalariga ega 50 ta sintetik namunalarni yaratish uchun foydalandik. Ushbu genlar uchun ifoda darajalari bizning haqiqiy ma'lumotlarimizdan tasodifiy tanlangan 50 kishiga asoslangan edi (buning uchun bizda HLA allel ma'lumotlari mavjud). Har bir HLA geni uchun biz haqiqiy ma'lumotlar to'plamida losos balig'ida umumiy protein kodlash transkripsiyasining kamida 90 foizini tashkil etadigan izoformlarni tanladik (bu har bir gen uchun atigi 1 transkriptga olib keldi) va transkript ketma-ketligini mos ravishda moslashtirdik. Har bir shaxs tomonidan olib boriladigan HLA allellari.

Ushbu protsedura bizga bir xil fon ifodasi darajalariga ega, ammo o'zgaruvchan HLA ifodasi va simulyatsiya qilingan o'qishlarga kiritilgan HLA polimorfizmiga ega 50 ta odamni sintetik tarzda yaratishga imkon berdi.

Haqiqiy maʼlumotlarimizni aks ettirish uchun har bir shaxs uchun oʻrtacha fragment oʻlchami 261 bp boʻlgan oʻttiz million 126 bp juft uchli oʻqishlar simulyatsiya qilingan, bunda boshqa polyester parametrlari uchun standart parametrlar (masalan, fragment uzunligining standart ogʻishi=25 bp, xatolik darajasi=0.005, o'qishlarning bir xil taqsimlanishi va tarafkashlik yo'q). Polyester FASTA fayllarini chiqaradi, ulardan biz doimiy sifat ko'rsatkichiga ega FASTQ fayllarini ishlab chiqardik (mos keladigan belgi "F").

Aniqlik uchun ko'rsatkichlar

Transkript uzunligi va fragmentning o'rtacha hajmi 261 bp bo'lgan TPMlar simulyatsiya qilingan hisoblar bo'yicha hisoblab chiqilgan. "Tahmin qilingan TPM/Haqiqiy TPM" nisbati simulyatsiya qilingan ifoda darajalarini tiklashda samaradorlikni baholash uchun ishlatiladi va bizga pastga yoki ortiqcha baholashni kuzatish imkonini beradi.

Grafika

Biz ushbu maqoladagi barcha syujetlarni R.dagi ggplot2 to'plami v3.3.2 (Wickham 2016) yordamida tayyorladik.

Natijalar

RNK-seq HLA miqdorini aniqlashning aniqligi

RNK-seq ma'lumotlaridan HLA ifoda miqdorini aniqlashning eksperimental oltin standarti deb hisoblanishi mumkin bo'lgan usulning yo'qligini hisobga olib, biz dastlab HLA uchun RNK-seq miqdorini aniqlash usullarining aniqligini simulyatsiya qilingan ma'lumotlardan foydalangan holda baholadik, bu erda ular yaratilganligi sababli haqiqiy ifoda darajalari ma'lum. haqiqiy tajribalarni taqlid qilish uchun kompyuterda. Bu RNK-seqga asoslangan usullar orasidan eng yaxshi hisoblash yondashuvini tanlash uchun qilingan, bu esa RNK-seq bo'lmagan yondashuvlar bilan keyingi kontrastni yaratishga imkon beradi.

Biz Polyester paketidan foydalangan holda 50 kishi uchun RNK-seq tajribasini simulyatsiya qildik (Frazee va boshq. 2015). Ushbu sintetik shaxslar genomdagi barcha genlar uchun bir xil ifoda darajalariga ega, HLA-A, -B va -C dan tashqari, biz ifoda darajalarini o'zgartirdik. Shuningdek, biz Gencode v37 dan izohli HLA transkript ketma-ketligini shaxsiylashtirdik, bu 96 kishidan iborat (quyida tasvirlanganidek, Sanger sekvensiyasi boʻyicha HLA genotipi boʻlgan) tasodifiy tanlangan shaxslarda kuzatilgan haqiqiy genetik oʻzgarishlarni joriy qilish uchun. Olingan shaxsiylashtirilgan transkriptlar barcha HLA lokuslari uchun 95 foizdan ortiq mos yozuvlar bilan median ketma-ketlik identifikatoriga ega edi.

Biz ikkita bioinformatik usul bilan olingan HLA ifodasi taxminlarini solishtirdik: (1) “Ref transkriptomi” (Patro va boshq. 2017) o‘qishlarni standart mos yozuvlar transkriptomiga moslashtirish, transkript ko‘pligini aniqlash va (2) “Shaxsiylashtirilgan”. Bu ikra ham ikra ishlatadi, lekin xaritalar individual HLA genotipini aks ettiruvchi shaxsiylashtirilgan HLA transkriptlarini o'qiydi (1-rasm). "Shaxsiylashtirilgan" yondashuv bizning oldingi strategiyamizni (Aguiar va boshq. 2019) shaxs tomonidan olib boriladigan har bir allel uchun bitta kanonik kodlash ketma-ketligidan ko'ra, shaxsiylashtirilgan transkriptdan foydalangan holda kengaytiradi.

"Ref transkriptome" usuli ekspressiya darajalarini, xususan, mos yozuvlar genomiga tegishli ketma-ketlik farqlarining katta qismi bo'lgan allellar uchun kam baholangan (1-rasm). Bu kutilmoqda, chunki o'qish va havola o'rtasidagi mos kelmaslik darajasi moslashishga salbiy ta'sir qiladi (Brandt va boshq. 2015). Ushbu yondashuv, shuningdek, ba'zi shaxslar uchun HLA-C ifodasini haddan tashqari oshirib yubordi, bu HLA-B dan o'qishlar HLA-C mos yozuvlar transkriptlari bilan taqqoslanishi natijasida (S1-rasm). Boshqa tomondan, "Shaxsiylashtirilgan" yondashuv xaritalashning noto'g'riligini nazorat qiladi va optimal aniqlikka erishadi.

Garchi bizning simulyatsiyamiz RNAseq yordamida HLA ifodasini aniqlash bo'yicha dalda beruvchi natijalarni taqdim etsa ham, biz ba'zi ogohlantirishlarni hisobga olishimiz kerak. Biz ma'lum bir HLA genidagi barcha allellar uchun yagona izoformlar to'plamidan foydalangan holda, individual HLA allellariga ko'ra izohlangan izoformlar ketma-ketligini o'zgartirdik. Bu ketma-ketliklar o'qishlarni simulyatsiya qilishda ham, ifoda miqdorini aniqlashda ham ishlatilgan; Shunday qilib, biz optimal aniqlikni kutamiz. Haqiqiy stsenariyda turli HLA allellari turli izoformlar bilan bog'lanishi mumkin. Keyinchalik ushbu maqolada biz HLA-A uchun kuzatilgan aniq misolni muhokama qilamiz, bu ma'lum izoformlar faqat ma'lum allellarga xos degan gipotezaga mos keladi. Shunga qaramay, biz asosan gen darajasidagi va HLA allel darajasidagi ifoda baholariga qiziqqanimizni hisobga olsak, biz shaxsiylashtirilgan ketma-ketliklar xaritalashning noto'g'riligini kamaytirish orqali bitta mos yozuvlar transkriptomiga nisbatan yaxshilanishni anglatadi deb kutamiz.

Haqiqiy RNK-seq ma'lumotlaridan HLA ifodasini baholash

Biz 96 kishi uchun butun transkriptomli RNK-seq ma'lumotlari bo'yicha ifodani baholashni amalga oshirdik, ular uchun HLAA, -B va -C uchun qPCR va HLA-C sirt ifoda darajalari ilgari taxmin qilingan (Kulkarni va boshq. 2013; Ramsuran va boshq. 2015, 2017) va RNAseq natijalari bilan solishtirish uchun ishlatilishi mumkin (RNK-seq ma'lumotlarida QC tahlillari uchun S2-rasmga qarang).

Simulyatsiyada shaxsiylashtirilgan yondashuvning yuqori aniqligini hisobga olgan holda, biz RNK-seq-asosidagi ifodani baholashning ushbu usulini boshqa RNK-seq bo'lmagan yondashuvlar bilan taqqoslaymiz, ammo "Qo'shimcha ma'lumot. " Biz Sanger sekvensiyasi orqali olingan individual HLA genotiplarini hisobga olgan holda transkript ketma-ketligini shaxsiylashtirdik. RNK-seq ma'lumotlaridan to'g'ridan-to'g'ri allellarni aniqlash va Sanger chaqiruvlarini tasdiqlash uchun HLApers (Aguiar va boshq. 2019) va Kourami (Li va Kingsford 2018) ni ishga tushirdik (qarang: "Materiallar va usullar").

Gen darajasidagi ekspressiya hisob-kitoblari shuni ko'rsatadiki, HLA-B bizning ma'lumotlar to'plamimizdagi HLA lokuslari orasida eng yuqori ifodaga ega, undan keyin HLA-C va HLA-A (2A-rasm). Bu tartib GTex toʻliq qon maʼlumotlar toʻplamiga (GTEx Consortium 2020) va PBMCʼlarga qoʻllaniladigan avvalgi HLA-tutib olish RNAseq usuliga mos keladi (Yamamoto va boshq. 2020). Biroq, bu naqsh Boegel va boshq (2018) tomonidan ko'rilganidan farq qiladi, ular genlar bo'ylab o'xshash darajalarni bir nechta lokuslarga o'qish xaritasi bilan ishlashning boshqa strategiyasidan foydalangan holda kuzatgan, bu esa ifoda darajasi bo'yicha lokuslar o'rtasida farq yo'qligiga hissa qo'shishi mumkin. ). Kelajakdagi tadqiqotlar metodologiyalardagi yoki hujayra tipidagi tarkibdagi farqlarning ushbu farqlarga qo'shgan hissasini ajratib ko'rsatishi kerak.

Haqiqiy ma'lumotlarda RNK-seq va qPCR ni solishtirish

Keyinchalik biz RNK-seq ifodasi taxminlarini qPCR bilan olinganlar bilan solishtirdik (2B-rasm). RNK-seq va qPCR ifodasi o'rtasidagi korrelyatsiya barcha genlar uchun statistik ahamiyatga ega bo'lsa-da (p=0.024, 0.002, 0,000000016, HLA-A, -B va -C, mos ravishda; Ijobiy assotsiatsiya uchun Spearman testi), korrelyatsiya kattaligi HLA-A va -B uchun oddiy va -C uchun yuqori edi. RNK-seq uchun moslashtirilgan ma'lumotnomadan foydalanish standart ma'lumotnomaga nisbatan qPCR bilan korrelyatsiyani kamtarona oshirdi (S3-rasm). Bu bizning oldingi kuzatishimizga mos keladi, genlar darajasidagi ekspressiya taxminlari HLA I sinf genlari uchun mos yozuvlar genomiga asoslangan yoki shaxsiylashtirilgan yondashuvlar o'rtasida sezilarli darajada farq qilmaydi (Aguiar va boshq. 2019), shaxsiylashtirilgan yondashuvlarning asosiy foydasi HLA allel darajasi, biz quyida o'rganamiz. Salmonda noto'g'ri chiziqni to'g'irlashdan foydalanish (GC tarafkashligi, ketma-ketlikka xos bo'lgan moyillik va pozitsiyaga xos moyillik) qPCR bilan korrelyatsiyani yaxshilaydi, HLA-B uchun eng yuqori ta'sir ko'rsatadi (tuzatilgan va tuzatilmagan ma'lumotlar uchun 2B va S4-rasmlarni solishtiring, mos ravishda).

mRNK darajasini sirt ifodasi bilan solishtirish

RNK ifodasi hujayra signalizatsiyasining dastlabki bosqichlari va stimullarga javob berish haqida ma'lumotga ega bo'lganligi sababli, uning quyi oqim molekulyar fenotiplari (hujayra yuzasida oqsil ifodasi kabi) bilan aloqasini tahlil qilish bizga transkripsiyadan keyingi va translyatsiyadan keyingi tartibga solishning rolini tushunishga yordam beradi. HLA ifodasi. RNK va oqsil ko'pligi o'rtasidagi farqlar kutilmoqda, chunki ular turli xil tartibga solish usullariga bo'ysunadi. Texnik ta'sirlar ham farqlarni keltirib chiqarishi mumkin, chunki RNK va oqsil texnikasi farqlanadi va bog'liq bo'lmagan xato turlaridan ta'sirlanadi (Li and Biggin 2015; Kaur va boshq. 2017; Carey va boshq. 2019). Bundan tashqari, bizning tadqiqotimizda gen ekspressiyasi umumiy PBMClarda o'lchandi, oqsil ifodasi esa tartiblangan CD3 plyus hujayralarida o'lchandi. Ushbu farqni hisobga olgan holda, biz hujayra yuzasidagi HLA oqsilini mRNK ifodasi bilan bashorat qilish darajasini o'lchadik. Ushbu tahlil faqat HLA-C uchun o'tkazildi, chunki u barcha allellarni teng yaqinlik bilan bog'lay oladigan antikor mavjud bo'lgan yagona joydir. Qizig'i shundaki, HLAC uchun mRNK va protein ifodasi o'rtasida yuqori korrelyatsiya bor edi, RNK-seq uchun biroz yuqori korrelyatsiya (2C-rasm).

HLA allel darajasidagi ifoda

HLA genlari konstitutsiyaviy transkripsiya va dinamik ravishda faollashtirilgan transkripsiya bilan bog'liq tartibga soluvchi elementlarni o'z ichiga oladi (René va boshq. 2016). Natijada, HLA ifodasi to'qimalarda o'zgarib turadi va turli xil stimullar tomonidan qo'zg'atilgan tartibga soluvchi tarmoqlar tomonidan modulyatsiya qilinishi mumkin (Anderson 2018; Carey va boshq. 2019). Turli xil HLA allellari turli bazal ifoda darajalari va tartibga solish dasturlari bilan bog'liq yoki yo'qligini tushunishga qiziqish ortib bormoqda (Aguiar va boshq. 2019; Gutierrez-Arcelus va boshq. 2020) va bu o'zgarish kasallik fenotiplariga yoki transplantatsiya natijalariga hissa qo'shadimi (Petersdorf va boshqalar). 2014, 2015; Rene va boshq. 2016; Bettens va boshq. 2022; Johansson va boshq. 2022). Shuning uchun, qPCR va RNK-seq uchun HLA allel darajasidagi ifoda taxminlari solishtirildi. Ma'lumotlar to'plamida individual allellar ko'pincha juda kam bo'lganligi sababli, biz ularni allel nasl-nasabi bo'yicha guruhladik (ya'ni, filogenetik jihatdan ekzonlar munosabati bilan aniqlangan allellar guruhlari) (Elsner va boshq. 2002).

Biz nasllarni RNK-seq va qPCR ma'lumotlari asosida ularning ifoda darajalariga ko'ra tartibladik va usullar bo'yicha reytinglarning muvofiqligini baholadik (3-rasm). Bizning shaxsiylashtirilgan RNK-seq yondashuvimiz to'g'ridan-to'g'ri allel darajasidagi taxminlarni ta'minlaydi, chunki HLA allel ketma-ketligi hizalanishlarni indekslash uchun ishlatiladi, shuning uchun biz allel nasllarini ularning median ifoda darajalariga ko'ra buyurtma qildik. Bizning qPCR ifodasi taxminlarimiz gen darajasida bo'lgani va allel darajasidagi taxminlarni to'g'ridan-to'g'ri ta'minlamaganligi sababli, biz HLA genotipi bilan izohlangan ifoda darajalarining chiziqli modelida ta'siriga ko'ra allel nasllarini buyurtma qildik (qarang: Ramsuran va boshq. 2015). 3-rasmda ifoda qiymatlari individualning har bir alleli uchun har bir daraja uchun ikki marta chizilgan va qPCR uchun bu shunchaki ikki marta chizilgan gen darajasidagi ifoda bo'lib, ikkita allel mavjudligini aks ettiradi.

Ifodalarni baholash tartibi HLA-C uchun RNK-seq va qPCR o'rtasida -A va -B ga qaraganda ko'proq o'xshashdir (o'rtacha mutlaq tartib farqi, bu erda tartib farqi ifoda qiymatlarining tartiblangan tartibidagi pozitsiyalarda kuzatilgan farqni bildiradi. , RNK-seq va qPCR miqdoriy aniqlash o'rtasida, HLA-C uchun 2,3, -A uchun 3,1 va -B uchun 3,9), gen darajasidagi ekspressiyaga o'xshash kelishuv namunasidan so'ng, biz eng yuqori korrelyatsiyani topdik. HLA-C uchun RNK-seq va qPCR o'rtasida.

RNK-seq va qPCR o'rtasidagi eng katta farqga ega bo'lgan nasllar orasida A * 11 mavjud. Biz A * 03 yoki A * 11 uchun geterozigotalarning pastki to'plamida sirt ifodasini ikkala nasl uchun teng yaqinlikka ega bo'lgan antikor yordamida o'lchadik va qPCR RNK-seqga qaraganda ushbu ikki allotipning hujayra yuzasi ifodasi bilan mustahkamroq bog'liqligini kuzatdik (1-rasm). S5). Keyinchalik, HLA mRNK ifodasini oldingi tadqiqotlar bilan taqqoslash orqali allel tartiblarini yanada kengroq baholashni taqdim etamiz.

HLA allellari o'rtasidagi ifoda farqlarini solishtirishga qiziqish mavjud bo'lsa-da, turli tadqiqotlar allel yoki allel nasl-nasabidagi ekspressiyadagi o'zgarishlar ko'pincha juda yuqori ekanligini va turli darajadagi allellar orasidagi farqlar ko'pincha kichik va ahamiyatsiz ekanligini ko'rsatadi. Natijada, bir nechta allellar bo'yicha darajalarni saqlab qolishni kutish haqiqatga to'g'ri kelmasligi mumkin va ifodaning haddan tashqari nuqtalarida allellar uchun ifoda baholarini solishtirish afzalroq bo'lishi mumkin.

RNK-seq ma'lumotlarimiz uchun biz o'z taxminlarimizni PBMC-larda HLA-moslashtirilgan ikkita oldingi RNK-seq yondashuvlari bilan solishtiramiz. Yamamoto va boshqalar bilan umumiy yaxshi muvofiqlik mavjud. (2020), bu erda A * 24, A * 02, C * 04 va C * 06 yuqori darajada ifodalangan va A * 03, C * 03 va B * 15 past darajada ifodalangan, ammo biz bunday farqlarni ham ko'ramiz. B * 35 ga kelsak, bu bizning qPCR ma'lumotlarimizga ko'proq mos keladi. Biz RNK-seq ma'lumotlarimizni Johansson va boshqalar bilan solishtirganda. (2021), ammo biz ko'plab farqlarni ko'ramiz, garchi ular ko'plab nasl-nasab uchun juda kichik namunalarga ega.

Shuningdek, biz o'z natijalarimizni allelga xos primerlarni qo'llagan oldingi ikkita qPCR tadqiqotlari natijalari bilan taqqoslaymiz. Bettens va boshqalar. (2014) ba'zi HLAC nasl-nasablari uchun allelga xos primerlardan foydalangan va C * 04 va C * 06 yuqori darajada ifodalanganligini ko'rgan, C * 07 va C * 03 esa RNK-seq uchun bizda mavjud bo'lgan narsaga mos ravishda past darajada ifodalangan. va qPCR. Rene va boshqalar. (2015) HLA-A uchun allelga xos primerlarni qo'llagan va ifodaning o'ta chegaralarida A * 02 (yuqori) va A * 29 (past) kuzatilgan, bu bizning qPCRga qaraganda RNAseq natijalariga ko'proq mos keladi; ammo, biz boshqa allel nasllarda ko'p farqlarni ko'ramiz

Ba'zi hollarda biz funktsional tadqiqotlar bilan kelishuvni ham baholashimiz mumkin. Misol uchun, transkripsiya faktorini bog'lash joylari (TFBS) va promotor faolligining oldingi tahlillari (Anderson 2018da ko'rib chiqilgan) va miRNK regulyatsiyasi bo'yicha tadqiqotlar (Kulkarni va boshq. 2011), C * 03 va C * 07 zaif ifodalangan allellar ekanligini ko'rsatadi, bu bizning RNK-seq va qPCR uchun kuzatuvlarimiz bilan mos keladi.

Farqlarning potentsial manbalari

Keyinchalik biz RNK-seq uchun foydalanilgan namunalarni qayta ishlash qPCR va RNK-seq bilan olingan ifoda baholari o'rtasidagi farqlarga hissa qo'shgan bo'lishi mumkinligini tekshirdik.

Namunalarning -80 daraja muzlatgichda saqlanish muddati (qPCR va RNK-seq tahlillari o'rtasida taxminan 4 yil), shuningdek, RNK-seq eksperimentiga xos bo'lgan boshqa bosqichlar, jumladan, namunalarni eritish ham alohida tashvish tug'dirdi. Buni hal qilish uchun biz 11 kishidan olingan yangi qonda ikkinchi RNAseq tajribasini o'tkazdik, ular ushbu tadqiqotda tahlil qilingan 96 ta to'plamidir va biz ikki martalik nuqtalar orasidagi ifoda baholarini solishtirdik. Garchi bu ikkinchi tahlil birinchi RNK-seq eksperimentiga (shakl S6A va B) nisbatan ham texnik, ham biologik farqlarga ega bo'lsa ham, vaqt nuqtalari orasidagi ifoda baholarida transkriptoma bo'ylab korrelyatsiya yuqori (S6C-rasm).

11 kishi bilan korrelyatsiyani baholash shovqinli bo'lishi mumkin bo'lsa-da, HLA genlaridagi korrelyatsiyalar ikkita namuna o'rtasidagi gen bo'yicha eng katta korrelyatsiyalardan biridir (S6D va F-rasm). Shuningdek, biz individual allel nisbatlarini hisoblab chiqdik, bu geterozigotli shaxsning ikkita HLA allellari o'rtasidagi ifoda nisbati va ularni vaqt nuqtalari o'rtasida solishtirdik. HLA-A, -B va -C uchun korrelyatsiya 0.94 dan katta edi (S6E-rasm). Shuning uchun biz asl namunamizdagi RNK-seq va qPCR o'rtasidagi past korrelyatsiyani tushuntirish uchun RNK degradatsiyasining katta hissasi haqida hech qanday dalil ko'rmadik.

RNK-seq va qPCR o'rtasidagi farqlarga yana bir mumkin bo'lgan hissa shundaki, o'ziga xos HLA allellari u yoki bu usulda ko'proq noxolis bo'lishi mumkin, bu holda bunday allellarni tashuvchi shaxslar katta farqlarga hissa qo'shadi. Misol uchun, A * 03 ni tashuvchi shaxslar yoki C * 07 homozigotlari uchun qPCR va RNK-seq o'rtasida salbiy munosabat mavjud (4A-rasm).

Usullar orasidagi farqlarning qo'shimcha manbai RNK-seq yondashuvimizda biz har bir HLA alleli uchun barcha Genkod izohli transkriptlarini shaxsiylashtirganimizdan kelib chiqishi mumkin; ammo, haqiqiy transkript xilma-xilligi va uning o'ziga xos HLA allellari bilan aloqasi yaxshi tushunilmagan. Masalan, Kulkarni va boshqalar. (2017) A * 01 va A * 11 qisqaroq 3′-UTR hosil qilishini ko'rsatdi. Ushbu mablag'ni RNK-seq ma'lumotlarimizda takrorlashimiz mumkinmi yoki yo'qligini tekshirish uchun biz o'qishlarni mos yozuvlar genomiga qo'shdik va hla-mapper yordamida HLA genlarida noto'g'ri xaritalash uchun tuzatdik (Castelli va boshq. 2018). Haqiqatan ham, A * 01 yoki A * 11 ni tashuvchi shaxslar uchun HLA-A ning 3′-UTR da o'qish qamrovi izohlangan gen tugashidan oldin ~ 120 bp da keskin pasayishni ko'rsatadi (S7-rasm).

Bir millionga transkript (TPM) qiymatlari mos yozuvlar uzunligini hisobga olgan holda hisoblanganligi sababli, haqiqiy transkripsiyadan uzunroq bo'lgan havoladan foydalanish ifodaning kam baholanishiga olib keladi. Biz o'qishni moslashtirish uchun indeksimizga qisqartirilgan 3′-UTR bilan har bir HLA-A transkriptining versiyasini kiritish orqali bunday qisqaroq transkriptlarning imkoniyatini nazorat qilishga harakat qildik. Biroq, biz qisqaroq izoformani ifodalashning hech qanday dalilini topmadik (S8-rasm), ehtimol bu qisqaroq izoformlar normal uzunlikdagi izoformalar ichida joylashganligi sababli va Salmonning amalga oshirilishi barcha o'qishlarni kattaroq izoformaga tayinlaydi. Qizig'i shundaki, izoform darajasidagi ifoda A * 11 ga nisbatan uzunroq 5′-UTR bilan izoformani ochib beradi, bu esa ushbu allel uchun umumiy ifodaning katta qismini qo'shadi (S8-rasm).

Shuningdek, biz ifoda baholarini normallashtirishni sinovdan o'tkazdik, unda biz proksimal yoki distal 3'-UTR terminalini qo'llab-quvvatlovchi o'qish qamrovini hisobga olgan holda o'qish uzunligini moslashtirdik (og'irlik sifatida o'qish qamrovidan foydalangan holda transkript uzunligining o'rtacha og'irligi). Garchi biz A*01 va/yoki A*11 ga ega boʻlgan shaxslarda ifoda darajasida 20 foizgacha oʻsish kuzatilayotgan boʻlsa-da, bu sozlashdan soʻng qPCR bilan korrelyatsiyaning ozgina yaxshilanishini koʻramiz (rho=0 dan. 2-rasmdagi 20 dan rho=0.24-rasm 4B).

A * 01 va A * 11 RNK-seq va qPCR o'rtasidagi eng katta darajadagi farqlarga ega allellar qatoriga kiradi (3-rasm) va izohda ular bilan bog'liq bo'lgan transkriptlarning nomukammal ko'rinishi bizning RNK-seq taxminlarimizda noto'g'rilikni keltirib chiqarishi mumkin.

Nihoyat, xom qPCR ma'lumotlaridan yakuniy ifoda baholarini olish uchun ishlatiladigan normalizatsiya usullari ham qPCR va RNK baholari o'rtasidagi farqlar manbai bo'lishi mumkin. HLA I sinf genlari uchun kantitativ PCR tahlillari odatda 1 dan 4 gacha ekzonlar ichidagi hududlarni kuchaytiradi va odatda B2M (2-mikroglobulin) kabi uy xo'jaligi genini ifodalash orqali standartlashtirish amalga oshiriladi (ushbu tadqiqotda bo'lgani kabi) ). Ushbu protseduraning mantiqiy sababi shundaki, agar ifoda darajalari barqaror ifodalangan ma'lumotnoma bilan standartlashtirilgan bo'lsa, turli shaxslar uchun hisob-kitoblar bir xil shkala bo'yicha qo'yiladi, bu esa shaxslar bo'yicha taqqoslash imkonini beradi.

B2M HLA I sinf molekulasidagi engil zanjirni kodlaydi va B2M va HLA I sinf genlari o'xshash promouter arxitekturasiga ega bo'lganligi sababli, ma'lum darajada ifoda koordinatsiyasiga ega bo'lishi mumkin (Kobayashi va van den Elsen 2{{1{{12}) }}}12; Vijayan va boshq. 2019) va umumiy transkripsiya omillari bilan tartibga solinishi mumkin (masalan, NLRC5/CITA Jurkat hujayra liniyalarida HLA I va B2M sinfining ifodasini keltirib chiqaradi (Meissner et al.) boshq. 2{{20}}10). HLA gen ifodasini korrelyatsiya qilingan qiymatlar bilan normallashtirish bizning qPCR taxminlarimizda, ayniqsa HLA-B uchun, biz yuqori ko'rsatkichlarni ko'ramiz. B2M ifodasi bilan korrelyatsiya (4C-rasm).Oʻzgaruvchini boshqa, lekin korrelyatsiya qilingan oʻzgaruvchi bilan masshtablash ekstremal qiymatlarni taqsimotning oʻrtasiga olib kelish va dispersiyani kamaytirish orqali bezovtalanishni keltirib chiqarishi mumkin; bu gipotezaga muvofiq, qPCR maʼlumotlari uchun oʻzgarish koeffitsientlari HLA-A va -C uchun mos ravishda 0,61 va 0,50, lekin HLA-B uchun 0,17 ga tushadi (taqqoslash uchun, RNK-seq ma'lumotlari uchun CV'lar HLA-A, -B va -C uchun 0,20, 0,14 va 0,29 ni tashkil qiladi. , mos ravishda). Biroq, xuddi shu qPCR dizaynidan foydalanib, Ramsuran va boshqalar. (2017) B2M, GAPDH, 18 s va b-Actin geni tomonidan HLA-B ifodasini normallashtirdi va juda izchil natijalarni kuzatdi, bu B2M normalizatsiyasining qPCR hisob-kitoblariga ta'sirini qo'llab-quvvatlamaydi.

Munozara

HLA transkriptini ifodalashning ishonchli baholari turli tadqiqot savollariga hissa qo'shishi mumkin va kasallik natijalari ko'pincha HLA kodlash o'zgaruvchanligi kontekstida o'rganilsa-da, ifoda darajalari klinik natijalardagi o'zgarishlarni ham tushuntirishi mumkin (Dendrou va boshq. 2018 yilda ko'rib chiqilgan; va Johansson va boshq. 2022). Ekspressiya darajalari, shuningdek, gematopoetik ildiz hujayralarini transplantatsiyasini rejalashtirishda qarorlar haqida ma'lumot berish imkoniyatiga ega; masalan, allogen donorlar uchun tanlovda mukammal moslik mavjud bo'lmasa, past ifodalangan allellarda mos kelmaydiganlarni tanlash foydali ko'rinadi (Petersdorf va boshq. 2014, 2015). Transkript ifodasining ishonchli baholari, shuningdek, MHC mintaqasidagi ma'lum xitlar HLA genlari uchun eQTLlarga to'g'ri keladimi yoki yo'qligini so'rash orqali GWAS topilmalari bilan birlashtirilishi mumkin bo'lgan HLA ifodasi nazorati asosidagi eQTLlarni aniqlashda yordam berishi mumkin (masalan, Jadvalga qarang). S6, Aguiar va boshq. 2019). Umuman olganda, HLA transkriptini ifodalashning takomillashtirilgan baholari bizga HLA regulyatsiyasining genetik arxitekturasini tushunishga yordam beradi, cis-ta'sir qiluvchi variantlar (ya'ni, ular tartibga soluvchi HLA geniga yaqin) va transaktsion variantlar (uzoqdagilar) nisbiy hissasini aniqlaydi. genomik joylashuvlar, shu jumladan boshqa xromosomalarda). Bu HLA ifodasidagi o'zgarishlar allelga xos xususiyat va allel identifikatoridan mustaqil bo'lgan individual individual xususiyatga ega bo'lish darajasi haqida ma'lumot beradi (qarang: Bettens va boshq. 2022).

Miqdoriy PCR usullari bizga HLA ifodasi va kasallik fenotiplari o'rtasidagi bog'lanishni aniqlashga imkon berdi. Yaqinda RNK-seq turli xil populyatsiyalarning katta transkriptom ma'lumotlar to'plamida gen ifodasini baholash uchun tanlov usuliga aylandi. Bunday ma'lumotlardan HLA ifodasi uchun to'g'ri ma'lumot olish imkoniyati muhim vazifa bo'lib, bu maqsadga erishish uchun ko'plab usullar taklif qilingan. Biroq, RNK-seq tahlillari natijalari qPCR yordamida to'plangan natijalarga qanchalik mos kelishi hozircha noma'lum. Ushbu usullar bir xil molekulyar fenotipga (RNK ko'pligi) qaratilgan bo'lsa-da, ular qo'llaniladigan eksperimental texnikada, ma'lumotlarni tahlil qilish va normalizatsiya qilish shakllarida, bioinformatika protseduralarida va ularga bog'liq bo'lgan noto'g'ri fikrlarda sezilarli darajada farqlanadi.

Bizning ma'lumotimizga ko'ra, HLA moslashtirilgan RNK-seq yondashuvlarini qPCR bilan solishtirgan oldingi tadqiqotlar kichik namunalarni o'z ichiga olgan. Masalan, Yoxansson va boshqalar. (2021) HLA-C da atigi 5 ta namunada qPCR bilan HLA-maqsadli RNK-seqni tasdiqladi, bu Pearson korrelyatsiya koeffitsientini 0,9 ga moliyalashtirdi, bu muhim emas (p=0,08) .

Ushbu tadqiqotda biz 96 kishidan iborat mos keladigan HLA-A, -B va -C klassik HLA sinf I geni uchun miqdoriy PCR va RNK-seq ifodasi taxminlarini solishtirdik. Biz 96 kishidan iborat namunadagi ifodada kamtarona, ammo muhim korrelyatsiyalarni topdik. Ushbu hisob-kitoblarni solishtirish uchun oltin standarti yo'qligini hisobga olgan holda, har ikkala usul bilan bog'liq baholash xatolari va noto'g'ri fikrlar umumiy natijaga hissa qo'shishi mumkin.

Biz RNK-seq va qPCR baholari o'rtasidagi past korrelyatsiyani tushuntirishi mumkin bo'lgan turli omillarning ta'sirini o'rganib chiqdik, masalan, o'ziga xos HLA allellari uchun ekspressiyani yomon baholash va qPCRda bitta uy xo'jaligi geni tomonidan normalizatsiya. Bizning natijalarimizni har bir qPCR dizayni yoki RNK-seq quvur liniyasi uchun umumlashtirish mumkin emas, ular uchun turli xil yondashuvlar mavjud. Biroq, bizning ma'lumotimizga ko'ra, bu HLA ifodasini baholash uchun qPCR va RNK-seq o'rtasidagi birinchi to'g'ridan-to'g'ri taqqoslashdir.

Bizning tadqiqotimiz HLA transkripti ifodasini aniqlashda takomillashtirishni talab qiladigan sohalarni taklif qiladi. RNK-seq va qPCR o'rtasidagi taqqoslashlar, masalan, ushbu usullar bilan bog'liq artefakt farqlarini cheklash uchun usullar (masalan, bir xil RNK izolyatsiyalash protokoli, saqlash/eritish vaqti, RNK yaxlitligi) bo'yicha namunalarni bir xilda qayta ishlashni qo'llashi kerak. Qisqa o'qishlarni bitta mos yozuvlar genomlari yoki transkriptomlar bilan taqqoslash noto'g'ri fikrlarni keltirib chiqaradi va HLA polimorfizmini hisobga olish uchun xaritani o'qish strategiyalari zarur. Bunga erishish uchun bir nechta strategiyalar mavjudligini hisobga olsak (Boegel va boshq. 2012; Li va boshq. 2018; Aguiar va boshq. 2019; Gutierrez-Arcelus va boshq. 2020; Darby va boshq. 2020), taqqoslash kalit bo'ladi. bu yondashuvlarning nisbiy aniqligi.

Bundan tashqari, izoform o'zgarishini adekvat hisobga oladigan usullarni ishlab chiqish kerak, bu nafaqat ma'lumotning boshqa qatlamini, balki aniqroq ifoda baholarini ham ta'minlash uchun, chunki noto'g'ri transkript uzunligi bilan o'qishlar sonini normallashtirish xatoning potentsial manbai hisoblanadi. Shu nuqtai nazardan, to'liq transkript ma'lumotlarini to'g'ridan-to'g'ri ishlab chiqaradigan uzoq o'qiladigan ma'lumotlar kuchli vosita bo'lishi mumkin (Cornaby et al. 2022). Va nihoyat, ma'lum HLA lokuslari (masalan, DRB) uchun ma'lum xususiyat bo'lgan nusxa ko'chirish sonining o'zgarishi ham ifoda darajasini aniqlashda hisobga olinishi kerak.

Minnatdorchilik

Tatyana Torresga (San-Paulu universiteti), Yang Luoga (Garvard tibbiyot maktabi) va Bostondagi qo'shma biologiya konsorsiumi a'zolariga foydali muhokamalari uchun rahmat.

Muallif hissasi

Diogo Meyer, Meri Karrington, Richard M. Singl va Vitor RC Aguiar tadqiqot kontseptsiyasi va dizayniga hissa qo'shdilar. Materiallarni tayyorlash, ma'lumotlarni to'plash va tajribalar Maureen P. Martin, Veron Ramsuran, Smita Kulkarni, Arman Bashirova, Danillo G. Augusto va Meri Carrington tomonidan amalga oshirildi. Ma'lumotlarni tahlil qilish Vitor RC Aguiar, Erick Castelli, Richard M. Single, Mariya Gutierrez-Arcelus va Diogo Meyer tomonidan amalga oshirildi. Qo'lyozma Vitor RC Aguiar va Diogo Meyer tomonidan yozilgan. Barcha mualliflar yakuniy qo'lyozmani o'qib chiqdilar, o'z hissalarini qo'shdilar va tasdiqladilar.

Moliyalashtirish

San-Paulu moliyalashtirish agentligi (FAPESP, http://www.fapesp. br/en/) DM (2012/18010-0 va 2013/22007-7) va VRCA (2014/{{)ni moliyalashtirdi. 5}} va 2016/24734-1). AQSh Milliy Sog'liqni saqlash instituti VRCA postdocning bir qismini qo'llab-quvvatlagan DM (NIH R01 GM075091) ni moliyalashtirdi. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científco e Tecnológico (CNPq) va Braziliya Sogʻliqni saqlash vazirligi MC va DMga berilgan AQSh-Braziliya qoʻshma taklifi doirasida RNK-seq tajribalari va tadqiqot sayohatlari uchun mablagʻ ajratdi (470043/{{13} }). NIH/NIAID R01AI157850 SKni qo'llab-quvvatlaydi. VR Janubiy Afrika Tibbiy Tadqiqot Kengashi (SAMRC) tomonidan Fan va Texnologiya Departamenti (DST) mablag'lari bilan moliyalashtirildi; Shuningdek, qisman AAS tomonidan DELTAS Afrika tashabbusi (Grant # DEL-15-006) boʻlgan Sil/OIV tadqiqotlari boʻyicha Afrikaning Sahroi Kabir tarmogʻi (SANTHE) orqali qisman qoʻllab-quvvatlanadi.

Ushbu loyiha HHSN261200800001E-sonli shartnoma bo'yicha Frederik Milliy Saraton tadqiqotlari laboratoriyasining federal mablag'lari bilan to'liq yoki qisman moliyalashtirildi. Ushbu nashrning mazmuni Sog'liqni saqlash va aholiga xizmat ko'rsatish departamentining qarashlari yoki siyosatlarini aks ettirmaydi, shuningdek, savdo nomlari, tijorat mahsulotlari yoki tashkilotlarning eslatilishi AQSh hukumati tomonidan ma'qullanishini anglatmaydi. Ushbu tadqiqot qisman NIH, Frederik Milliy Laboratoriyasi, Saraton tadqiqotlari markazining Intramural tadqiqot dasturi tomonidan qo'llab-quvvatlandi.

Ma'lumotlar mavjudligi

Joriy nashrda keltirilgan RNK-seq ma'lumotlari phs003177.v1.p1 dbGaP qo'shilishi ostida dbGaP ma'lumotlar bazasida saqlangan va mavjud.

Ma'lumotnomalar

1. Aguiar VRC, César J, Delaneau O, va boshqalar (2019) Shaxsiylashtirilgan quvur liniyasi bilan HLA genlari uchun ifodani baholash va eQTL xaritalash. PLoS Genet 15: e1008091.

2. Alcina A, Abad-Grau MDM, Fedetz M va boshqalar (2012) Ko'p skleroz xavfi varianti HLA-DRB1 * 1501 turli xil inson populyatsiyalarida DRB1 genining yuqori ifodasi bilan bog'liq. PLoS One 7: e29819.

3. Anderson SK (2018) HLA-C ifodasini nazorat qiluvchi elementlarning molekulyar evolyutsiyasi: tabiiy qotil hujayra funktsiyasini tartibga soluvchi qotil-hujayra immunoglobulinga o'xshash retseptor ligandlari roliga moslashish. HLA 92:271-278.

4. Ilovalar R, Meng Z, Del Prete GQ va boshqalar (2015) Oddiy va OIV bilan kasallangan hujayralardagi HLA-I sinf oqsillarining nisbiy ifoda darajalari. J Immunol 194: 3594–3600.

5. Ilovalar R, Qi Y, Carlson JM, va boshqalar (2013) HLA-C ifoda darajasining OIV nazoratiga ta'siri. Fan 340:87–91.

6. Arshad N, Laurent-Rolle M, Ahmad WS va boshqalar (2023) SARS-CoV-2 qo'shimcha oqsillari ORF7a va ORF3a MHC-I sirt ifodasini kamaytirish uchun alohida mexanizmlardan foydalanadi. Proc Natl Acad Sci USA 120: e2208525120.

7. Aulchenko YS, Ripke S, Isaacs A, van Duijn CM (2007) GenABEL: genom bo'yicha assotsiatsiyani tahlil qilish uchun R kutubxonasi. Bioinformatika 23:1294–1296.

8. Bachtel ND, Umviligihozo G, Pickering S, va boshqalar (2018) OIV tomonidan HLA-C pastga regulyatsiyasi -1 xost HLA genotipiga moslashadi. PLoS Patog 14: e1007257.

9. Bettens F, Brunet L, Tiercy JM (2014) HLA-C mRNK ifodasida yuqori allellik o'zgaruvchanligi: HLA kengaytirilgan haplotiplar bilan bog'lanish. Genlar Immun 15:176–181.

10. Bettens F, Ongen H, Rey G va boshqalar (2022) HLA sinf I ifodasini kodlanmaydigan gen o'zgarishlari bilan tartibga solish. PLoS Genet 18: e1010212

11.Boegel S, Bukur T, Castle JC, Shahin U (2018) In Silico Typing of Classical and Non-klassik HLA alleles from Standard RNK-Seq Reads. Methods Mol Biol 1802: 177–191.

For more information:1950477648nn@gmail.com