Karnovskiyning fiksatori antisens oligonukleotid bilan davolangan buyraklardagi to'qimalarni qayta ishlash natijasida vakuolatsiya sifatida paydo bo'ladigan artefaktlarning oldini oladi Ⅰ
Apr 03, 2024
Annotatsiya: Antisens oligonukleotid(ASO) terapiyalari yangi davolash usuli sifatida aniqlandidavolab bo'lmaydigan kasalliklar. Inbuyraklar ASO bilan davolanadi, proksimal tubulalarda bazofil granulalardan tashqari vakuolalar tez-tez kuzatiladi. Ba'zi ma'lumotlarga ko'ra, bu vakuolalar ikkinchi darajali hodisa bo'lishi mumkinASOlarni qazib olishto'qimalarni qayta ishlash jarayonida. Ushbu tadqiqotda biz fiksatsiyadan keyin buyrak morfologiyasini Karnovskiyning fiksatori yoki 4% paraformaldegid fosfat buferi (PFA) bilan 10% neytral tamponlangan formaldegid eritmasi (NBF) bilan solishtirdik. 1 yoki 2 hafta davomida antisens oligonükleotidlarni (LNA-ASO) o'z ichiga olgan 50 mg / kg qulflangan nuklein kislota bilan to'rt marta tomir ichiga davolash qilingan urg'ochi Sprague-Dawley kalamushlari tekshirildi. Mikroskopik tarzda, NBF bilan mahkamlangan buyraklarda proksimal kanalchalardagi vakuolalar va bazofil granulalar kuzatilgan. Bazofil granulalar ASO larning to'planishidan dalolat beradi. Bundan tashqari, ba'zi vakuolalarda zaif bazofil granulalar mavjud bo'lib, bu vakuolalar ASO larning to'planishiga tegishli ekanligini ko'rsatadi. Proksimal kanalchalarda mo''tadil vakuolatsiya kuzatilgan bo'lsa-da, vakuollangan epiteliyaning aksariyati immunohistokimyoviy bo'yashda buyrak shikastlanishi molekulasi-1 uchun salbiy edi. Karnovskiy fiksatsiyasiga duchor bo'lgan namunalarda proksimal kanalchalardagi vakuolalar kuzatilmadi, garchi bazofil granulalar kuzatilgan. PFA fiksatsiyasiga duchor bo'lgan namunalarda NBF fiksatsiyasiga duchor bo'lgan namunalardagi kabi proksimal kanalchalarda vakuolalar va bazofil granulalar kuzatildi. Umuman olganda, bizning topilmalarimiz an'anaviy NBF fiksatsiyasidan foydalanganda to'qimalarni qayta ishlash jarayonida artefaktlar tufayli vakuolatsiyani ortiqcha baholash imkoniyatini ko'rsatdi. Karnovskiyning fiksatori sun'iy vakuolalarni haqiqiy nefrotoksiklikdan ajratish uchun foydali alternativ hisoblanadi. (DOI: 10.1293/tox.2021-0007; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)
Kalit so‘zlar:antisens oligonukleotid, artefakt,Karnovskiyning fiksatori, vakuolatsiya, bazofil granula, buyrak
Cistanche Supplement Buyrak funktsiyasini qo'llab-quvvatlovchi qo'shimcha PhGs75% Ech 30% Act 12%
Yaqinda antisens oligonukleotid (ASO) terapiyalari chidab bo'lmaydigan kasalliklarni davolashning yangi usullari sifatida o'rnatildi1, 2. ASO'lar ribonuklein kislotasi bilan bog'langan va gen ekspressiyasini bostiradigan qisqa, sintetik, bir ipli oligodeoksinukleotidlardir3.
Toksikologik nuqtai nazardan, ASO dan kelib chiqadigan zaharlanishlar ASO ketma-ketligiga bog'liq bo'lgan duragaylanishga bog'liq toksikliklarga va kimyoviy modifikatsiyaga bog'liq bo'lgan gibridlanishga bog'liq bo'lmagan toksikliklarga bo'linadi. Gibridlanishga bog'liq bo'lmagan zaharlanishlar uchta asosiy mexanizm bilan qo'zg'atiladi: 1) ASO to'planishi, 2) yallig'lanishga qarshi ta'sirlar va 3) aptamerik bog'lanish effektlari4. ASO larning to'planishi birinchi navbatda jigar va buyraklarda kuzatiladi va ortiqcha to'planishi bu organlarning disfunktsiyasiga olib keladi5. Yallig'lanishga qarshi ta'sir kemiruvchilar va maymunlardagi Tollga o'xshash retseptorlari bilan bog'lanish orqali tug'ma immunitet tizimini rag'batlantirish yoki maymunlarda H omilini ASO tomonidan inhibe qilish orqali alternativ komplement yo'lini faollashtirish orqali yuzaga keladi6. Aptamerik bog'lanish ta'siri trombotsitlarga xos retseptorlarni bog'lash uchun trombotsitlar faollashishi va agregatsiyasi/trombotsitopeniyani keltirib chiqaradi7. Bundan tashqari, gepatotsitlardagi hujayra ichidagi oqsillarga aptamerik bog'lanish gepatotoksisitening sabablaridan biri hisoblanadi8-10. Ushbu toksiklikni aniqlash uchun tadqiqotchilar bir nechta klinik bo'lmagan tahlillarni ishlab chiqdilar; bular orasida gistopatologik tekshirish ASO to'planishini aniqlash uchun eng sezgir testlardan biridir.
Gistopatologik jihatdan ASO larning to'planishi odatda jigardagi Kupfer hujayralari sitoplazmasida yoki buyraklarning proksimal kanalchalarida bazofil granulalar shaklida kuzatiladi. Bazofil granulalarning sezilarli darajada to'planishi degenerativ o'zgarishlarning kuchayishi yoki og'irligi bilan bog'liq bo'lib, odatda buyraklardagi proksimal quvur epiteliyasining vakuolatsiyasi yoki degeneratsiyasi/nekrozi sifatida kuzatiladi4. Faqat bazofil granulalar toksikologik ahamiyatga ega emas11; shuning uchun degenerativ o'zgarishlardan bazofil granulalar to'planishini farqlash ASO bilan bog'liq toksiklikni baholash uchun muhimdir.
ASO bilan davolash qilingan sinomolgus maymunlari buyraklarining proksimal kanalchalarida tez-tez kuzatiladigan vakuolalar bazofil moddasini o'z ichiga oladi va hujayralar ichida bazofil granulalar kabi umumiy taqsimotni namoyon qiladi11, 12. Bir nechta hisobotlarda fiksatsiya jarayoni ta'sir qilishi mumkinligi taxmin qilingan. Fagolizosoma bo'limida ASO to'planishining ko'rinishi5, 11. Bundan tashqari, Genri va boshqalar. va Engelxardt proksimal tubulalardagi vakuolalar qayta ishlash jarayonida ASO larning ekstraktsiyasi natijasida yuzaga keladigan ikkilamchi hodisa bo'lishi mumkinligini ta'riflagan, chunki vakuolalar paraformaldegid/glutaraldegid perfuziyasi bilan fiksatsiyalangan buyraklarda yo'q5, 11. Proksimal tubulalardagi vakuolalar qayta ishlash jarayonida. mipomersen bilan fiksatsiya jarayonida paydo bo'lishi taxmin qilingan13.
Shunday qilib, ASO bilan davolash tufayli vakuolatsiya ba'zi hollarda artefakt bo'lishi mumkin bo'lsa-da, bu gipoteza aniq isbotlanmagan va toksikologik baholash uchun tegishli fiksatsiya usuli aniqlanmagan. Shunga ko'ra, ushbu tadqiqotda biz Karnovskiyning fiksatori yoki 4% paraformaldegid fosfat buferi (PFA) bilan fiksatsiyadan keyin buyrak morfologiyasini 10% neytral tamponlangan formaldegid eritmasi (NBF) bilan taqqosladik. Bundan tashqari, biz Karnovskiy fiksatorining artefaktdan kelib chiqadigan vakuolatsiyani oldini olish uchun muqobil fiksator sifatida foydaliligini ko'rsatdik.
To'rt haftalik urg'ochi Sprague-Dawley kalamushlari Charles River Laboratories Japan Inc. (Kanagava, Yaponiya) dan sotib olindi va laboratoriya sharoitlariga moslashtirildi. Hayvonlar nazorat qilinadigan sharoitlarda (12-soat yorug'lik/qorong'ulik davri, 23 ± 2 daraja harorat, nisbiy namlik 50 ± 25%) bo'lgan va standart tijorat dietasiga (avtoklavlangan CR-LPF; Oriental Yeast Co., Ltd., Tokio, Yaponiya) va musluk suvi. Yigirmata hayvon quyidagi to‘rtta guruhga (har birida beshta hayvondan) ajratildi: 1-hafta sho‘r suv bilan ishlov berilgan guruh (Nazorat- 1V), 2-hafta sho‘r suv bilan ishlov berilgan guruh (Nazorat{ {14}}Vt), 1-haftada antisens oligonukleotid (LNA-ASO) bilan ishlov berilgan guruh (ASO-1W) va 2-hafta LNA ASO bilan ishlov berilgan guruhni o‘z ichiga olgan qulflangan nuklein kislotasi (ASO-2W). 50 mg/kg LNA-ASO yuborish boshlanganda hayvonlar 5 haftalik edi. LNA-ASO vena ichiga jami to'rt marta quyidagi sxema bo'yicha kiritildi: ASO-2W guruhida 1, 4, 8 va 11-kunlar; va ASO-1W guruhidagi 1, 2, 3 va 4-kunlar. Nazorat-1W va ASO-1W guruhlaridagi hayvonlar 7-kuni qurbon qilindi. Nazorat-2W va ASO-2W guruhlaridagi hayvonlar shu kuni qurbon qilindi. 14. Har bir terminal o'limida qorin bo'shlig'i vena kavasidan izofluran bilan chuqur behushlik ostida klinik patologiya uchun qon namunalari yig'ildi. Qon namunasi olingandan so'ng, barcha kalamushlar qorin aortasini darhol kesib tashlash orqali evtanizatsiya qilindi. Tananing tashqi yuzasi, ko'krak va qorin bo'shliqlari, ichki organlar makroskopik tekshirildi va chap buyraklar olib tashlandi va mikroskopik tekshirish uchun qayta ishlandi. Barcha muolajalar Mitsubishi Tanabe Pharma korporatsiyasining Eksperimental hayvonlar va hayvonlar bo‘yicha tajribalarini oziqlantirish va saqlash qoidalariga muvofiq amalga oshirildi.
Sarum namunalari qon namunalarini 4 darajada santrifüj qilish yo'li bilan olingan. Qondagi karbamid azoti (BUN) va kreatinin (CRE) darajasini baholash uchun TBA{1}}FR asbobi (Canon Medical Systems Corporation, Tochigi, Yaponiya) yordamida sarum biokimyoviy tahlili oʻtkazildi.
Buyraklar uchta fiksator eritmasi yordamida quyidagi tarzda fiksatsiya qilindi: Buyrakni ko'ndalang bo'lib uchta bo'lakka bo'lgandan so'ng, buyrak tos suyagini o'z ichiga olgan o'rta qismi 5 kun davomida 10% NBFda fiksatsiya qilindi; bosh suyagi qismi Karnovskiyning fiksatorida o'rnatildi (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Tokio, Yaponiya); va kaudal qismi 4% PFAda 17 soat davomida 4 gradusda o'rnatildi va keyin 24 soat davomida 10% NBFga joylashtirildi. Har bir sobit namuna suvsizlangan va kerosinga solingan. Gematoksilin va eozin (H&E) bo'yash uchun to'qimalarning bo'limlari tayyorlangan. Immunogistokimyoviy bo'yash buyrak shikastlanishi molekulasiga qaratilgan antikorlar yordamida amalga oshirildi-1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, AQSh; 1:300 suyultirish) va lizosomal bilan bog'liq membrana oqsili 2 (LAMP{{) 13}}; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, AQSH; Ikkilamchi antikor sifatida Histofine Simple Stain Rat MAX PO (Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Yaponiya) ishlatilgan.
Wecistanche-ning qo'llab-quvvatlovchi xizmati:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Batafsil texnik xususiyatlar uchun xarid qiling:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
