Lizosomal lipid peroksidatsiyasi o'simta immunitetini tartibga soladi

DC661 kabi palmitoil-protein tioesteraza 1 (PPT1) inhibitörleri tomonidan qo'zg'atilgan lizosomal inhibisyon hujayra o'limiga olib kelishi mumkin, ammo buning mexanizmi to'liq tushunilmagan. DC661 ning sitotoksik ta'siriga erishish uchun dasturlashtirilgan hujayra o'lim yo'llari (autofagiya, apoptoz, nekroptoz, ferroptoz va piroptoz) talab qilinmagan. Katepsinlarni inhibe qilish yoki temir yoki kaltsiy xelatatsiyasi DC661-sitotoksikligini bartaraf eta olmadi. PPT1 inhibisyonu lizosomal lipid peroksidatsiyasini (LLP) keltirib chiqardi, bu lizosomal membrana o'tkazuvchanligiga va hujayra o'limiga olib keldi, bu antioksidant N-asetilsistein (NAC) tomonidan qaytarilishi mumkin, ammo boshqa lipid peroksidlanish antioksidantlari bilan emas. MFSD12 lizosomal sistein tashuvchisi NACni intralizosomal tashish va LLPni qutqarish uchun zarur edi. PPT1 inhibisyonu faqat NAC bilan qaytarilishi mumkin bo'lgan kalretikulinning sirt ifodasi bilan hujayraning ichki immunogenligini keltirib chiqardi. DC{11}}davolangan hujayralar sodda T-hujayralarni asraydi va T-hujayralari vositachiligida toksiklikni kuchaytirdi. DC bilan davolash qilingan hujayralar bilan emlangan sichqonlar{12}}immunitetga mos immunitet va o'simtani rad etish "immun issiq" o'smalarda paydo bo'ldi, ammo "immun sovuq" o'smalarda emas. Ushbu topilmalar LLP lizosomal hujayralar o'limini, hujayra o'limining noyob immunogen shaklini qo'zg'atayotganini ko'rsatadi, bu klinik sinovlarda sinovdan o'tkazilishi mumkin bo'lgan immunoterapiya va lizosomal inhibisyonning oqilona kombinatsiyasiga yo'l ko'rsatadi.

Cistanche tubulosa-Antitumorning foydalari

Kirish

Lizosomal inhibitor gidroksiklorokin (HCQ) (1) ni o'z ichiga olgan klinik sinovlarda rag'batlantiruvchi faollik bilan, palmitoil-protein tioesteraza 1 (PPT1) xlorokin hosilalarining molekulyar maqsadi sifatida identifikatsiya qilindi (2) va yangi PPT1 ingibitorlarini kliniklarga kiritilishi. sinovlar (3, 4), lizosomal ingibitorlar hujayra o'limiga olib keladigan mexanizmni va lizosomal inhibisyonning o'simta immunitetiga ta'sirini tushunishga ehtiyoj bor. HCQ uchun tavsiflangan lizosomal hujayralar o'limining kanonik mexanizmi lizosomal membrana o'tkazuvchanligini (LMP), katepsinlarning oqishi va kaspaza vositachiligidagi apoptozning faollashuvini o'z ichiga oladi (5, 6). Biz ilgari DC661 lizosomal inhibitori kislotali o'simta mikro muhitidagi hujayralarga kirib borishini va lizosomaga HCQ ga qaraganda samaraliroq joylashishini ko'rsatdik (2, 7). DC661 ko'plab saraton hujayralari qatorlarida kuchli hujayra o'limini keltirib chiqaradi (2). DC661 PPT1 ni bog'laydi va inhibe qiladi, lizosomani kislotasizlantiradi va autofagiyani inhibe qiladi. DC661, shuningdek, LMP ni keltirib chiqaradi va parchalangan kaspaza 3 darajasini oshiradi (2, 7). So'nggi yillarda immunogen oqibatlarga olib keladigan hujayra o'limining yangi mexanizmlari aniqlandi va ular orasida nekroptoz, ferroptoz va piroptoz mavjud (8). Lizosomaga bog'liq avtofagiya MHC I sinfini (9), shuningdek, immunoproteasomaning (10) tarkibiy qismlarini degradatsiyalashi ko'rsatilgan, bu autofagiyaning inhibisyonu antigenni qayta ishlashni kuchaytirishi mumkinligini ko'rsatadi. Biroq, lizosomal inhibisyonning immunogen ta'siri va hujayra o'limi to'liq tavsiflanmagan. Ushbu bilim bo'shlig'ini bartaraf etish uchun biz DC661 ning hujayra o'limining kanonik mexanizmlariga ta'sirini o'rganib chiqdik, bu lizosomal hujayra o'limi uning hujayra o'limi shakli yoki oddiygina boshqa o'rnatilgan mexanizmlardan birining kashshofi ekanligini aniqlash uchun. Biz HCQ va DC661 melanoma proteomasida faqat oz sonli oqsillarning sezilarli o'sishiga sabab bo'lganligini aniqladik va ularning aksariyati autofagiya va apoptoz bilan bog'liq oqsillar edi. Dasturlashtirilgan hujayra o'limining ingibitorlari (apoptoz, nekroptoz, ferroptoz va piroptoz) DC661 tomonidan lizosomal buzilishdan keyin sitotoksik ta'sirni yumshatmadi. Lizosomal lipid peroksidatsiyasi (LLP) hujayra yuzasida kalretikulin (CALR) ifodasi bilan bog'liq bo'lgan LMP tomonidan qo'zg'atilgan hujayra o'limining asosiy omilidir. Hujayra o'limining bu shakli faqat antioksidant N-asetilsistein (NAC) yordamida qaytarilishi mumkin. NAC faoliyati lizosomal sistein importchisi MFSD12 ning inhibisyonu tufayli buzilgan. LLP T-hujayra vositachiligida o'ldirishni rag'batlantiradigan immunogen fenotiplarni keltirib chiqardi. Ushbu topilmalar lizosomal hujayralar o'limi immunogen hujayralar o'limining potentsial noyob shakli ekanligini ko'rsatadi.

cistanche o'simlik - immunitet tizimini oshiradi

Natijalar

Lizosomal inhibisyon proteomada avtofagiya va apoptoz bilan bog'liq sezilarli o'zgarishlarni keltirib chiqaradi. Lizosomal ingibitorlarning sitotoksik ta'sirini aniqlash uchun biz A375P melanomasi, RKO yo'g'on ichak karsinomasi va vakuolyar H+-ATPase inhibitori bafilomisin-A1 bilan davolash qilingan MIA PaCa{1}} oshqozon osti bezi saratoni hujayralarining hayotiyligini baholadik (1). 00 nM); PPT1 inhibitörleri DC661 (3 mkM) yoki HCQ (10 mkM yoki 30 mkM); palmitat mimetik geksadesil sulfonil ftorid (HDSF; 60 mkM); katepsin ingibitorlari pepstatin A (PepA; 10 ug/ml), E64 (PepA; 10 ug/ml) yoki PepA+E64; va lizosomal membranani buzuvchi Leu-Leu metil ester gidrobromidi (20 mkM) 48 soat davomida. Faqat bafilomisin-A1 va DC661 saraton hujayralari liniyalari bo'ylab hujayra hayotiyligini sezilarli darajada pasayishiga olib keldi (1A-rasm va qo'shimcha rasm 1A; ushbu maqolada onlaynda mavjud qo'shimcha material; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), DC661 ishlab chiqaradi bafilomisin-A1 ga qaraganda hujayra hayotiyligining chuqurroq pasayishi. Ushbu ma'lumotlarga va xlorokin hosilalarining farmakologik dori-darmonlarga o'xshash xususiyatlariga asoslanib, biz o'rganishimizni xlorokin hosilalariga lizosomal hujayra o'limini tushunish vositasi sifatida qaratdik. 24 soat davomida DC661 (3 mkM) yoki kamroq kuchli HCQ (10 mkM yoki 30 mkM) bilan davolash qilingan A375P melanoma hujayralariga xolis global proteom tahlili qo'llanildi. 4264 ta yuqori ishonchli miqdoriy oqsillardan faqat 87 va 55 ta oqsillar mos ravishda DC661 (3 mkM) va HCQ (30 mkM) bilan sezilarli darajada oshdi; qo'shimcha ravishda 14 va 15 oqsillar mos ravishda DC661 (3 mkM) va HCQ (30 mkM) bilan sezilarli darajada kamaydi (mutlaq katlama o'zgarishi 2 dan katta; q <0,05) mos ravishda DC661 (3 mkM) yoki HCQ (30 mkM) bilan , avtomobil boshqaruvi bilan solishtirganda. HCQ ning past dozasi (10 mkM) transport vositasini boshqarish bilan solishtirganda muhim protein o'zgarishlarini ko'rsatmadi. DC661 bilan davolashdan so'ng sezilarli darajada ko'paygan eng yaxshi 50 ta oqsil asosan otofagiya va apoptoz bilan bog'liq bo'lib, HCQ ning yuqori dozasi uchun shunga o'xshash o'zgarishlar kuzatildi (1B-rasm). Shu sabablarga ko'ra biz keyingi tadqiqotlarni yanada kuchliroq DC661 ga qaratishni tanladik. Avtofagiya va apoptoz bilan bog'liq bo'lgan eng katta oqsil o'zgarishlariga misollar soliq{62}}bog'lovchi oqsil 1 (TAX1BP1; 15-katta ortdi); BCL2-oʻzaro taʼsir qiluvchi oqsil 3 (BNIP3; 6- barobar ortdi); BRCA1 gen 1 oqsilining qo'shnisi (NBR1; 12- barobar ortdi); sequestosome-1 (SQSTM1/p62; oshdi 5-katta); yadro retseptorlari koaktivatori 4 (NCOA4; 3- barobar ortdi); va LC3B (MAP1LC3B; 3- barobar oshdi). Apolipoprotein B-100 (APOB; 66- barobar ortdi) homilaning buzoq zardobidan olingan va keyinchalik oʻrganilmagan. Immunoblotting DC661 yoki undan yuqori konsentratsiyali HCQ bilan davolash NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 va NCOA4 otofagiya yuk retseptorlari ekspressiyasida doza va vaqtga bog'liq holda sezilarli o'sish hosil qilishini tasdiqladi (Qo'shimcha shakl 1, B va C). A375P hujayralaridagi PPT1 ning CRISPR/Cas9 KO WT hamkasblari bilan solishtirganda DC661 ning ushbu oqsillarga ta'sirini fenokopiya qildi (Qo'shimcha rasm 1D). Shu bilan birga, avtofagiya yuk retseptorlarining ifodasi va DC661 bilan davolash natijasida kelib chiqqan nisbiy o'sish yo'g'on ichak saratoni, oshqozon osti bezi saratoni va DC661 sitotoksisitesini ko'rsatadigan boshqa melanoma hujayrali liniyalarida o'zgaruvchan edi (Qo'shimcha rasm 1E). Bu shuni ko'rsatdiki, avtofagiya yuk retseptorlarining o'zlari, garchi oqsil darajasida ko'paygan bo'lsalar ham, DC661 davolashdan keyin hujayra o'limi uchun javobgar bo'lishlari dargumon. Buni tasdiqlash uchun biz TAX1BP1 va BNIP3 avtofagiya yuk retseptorlariga e'tibor qaratdik, chunki ular saraton hujayralarida ma'lum proapoptotik ta'sirga ega (1C-rasm). TAX1BP1 avtofagiya yuk adapteridir (11) va shuningdek, saraton hujayralarida oqsil sintezi inhibitörleri yoki DNKga zarar etkazuvchi moddalar (12) tomonidan qo'zg'atilgan apoptozni tartibga soladi. TAX1BP1 ning siRNK tomonidan nokdatu (1D-rasm) qisqa muddatli (1E-rasm) va uzoq muddatli hayotiylik tahlillarida DC{119}}sitotoksikligiga ta'sir qilmadi (1F-rasm). Bu natijalar TAX1BP1 DC vositachiligidagi sitotoksiklikda muhim rol o‘ynamasligini ko‘rsatdi. BNIP3 proapoptotik oqsil bo'lib, mitoxondrial bioenergetikani buzadi va mitofagiyani tartibga soladi (13). BNIP3 (1G-rasm) samarali nokdaunti DC{131}}sitotoksikligiga ta'sir qilmadi (1, H va I-rasmlar). Ushbu natijalar DC661 ning sitotoksik ta'siri BNIP3 ifodasidan mustaqil ekanligini ko'rsatdi. Keyinchalik, avtofagiyani faollashtiruvchi kinaz 1 (ULK1) va autofagiya bilan bog'liq gen 7 (ATG7) kabi unc{136}}ni yiqitib, avtofagosoma ishlab chiqarish uchun zarur bo'lgan kanonik autofagiya genlari hujayralarini yo'q qilishning DC661 samaradorligiga ta'sirini o'rgandik. ULK1 yoki ATG7 ning samarali ishdan chiqishi (2-rasm, A va B qo'shimcha) avtofagik oqimni inhibe qildi (qo'shimcha 2C-rasm), lekin DC{146}}sitotoksikligiga ta'sir qilmadi (1-rasm, J–M). Ushbu natijalar shuni ko'rsatdiki, asosiy otofagiya mexanizmlarining yo'qligi DC661 ning sitotoksik ta'sirini bekor qilmaydi. DC661 tomonidan lizosomal inhibisyon bir nechta dasturlashtirilgan hujayra o'lim yo'llarini keltirib chiqaradi. Kanonik nuqtai nazar shundan iboratki, lizosomal hujayralar o'limi apoptoz bilan bog'liq (5). Immunoblotting DC661 bilan davolash kaspaza-3, -7 va -9 faollashuviga va PARP-1 ajralishiga olib kelganligini aniqladi, bu DC661 apoptozni faollashtirganini tasdiqladi (2A-rasm). Pan-kaspaza inhibitori Z-VAD-FMK DC661 tomonidan kaspaza faollashishini oldini oldi, lekin LC3B va p62 to'planishiga to'sqinlik qilmadi, bu apoptoz faollashuvi va autofagiya blokadasi lizosomal inhibisyondan keyin ajralib turishini ko'rsatdi (2B-rasm). ZVAD-FMK bilan apoptozni blokirovka qilish DC661 sitotoksikligini kuchaytirmadi yoki cheklamadi, bu apoptozning lizosomal hujayralar o'limi uchun zarur ekanligini ko'rsatadi (2-rasm, C va D). DC661 ning sitotoksik ta'siri apoptoz va WT hujayralarini boshdan kechirishga qodir bo'lmagan Bax/Bak juft KO asosiy suyak iligi hujayralarida o'xshash edi (2E-rasm). Apoptoz blokadasi yo'g'on ichak saratoni va oshqozon osti bezi saratoni hujayralarida DC tomonidan qo'zg'atilgan sitotoksiklikka ta'sir qilmadi (Qo'shimcha 2-rasm, D-F). Biz apoptozning DC{173}}hujayra o'limi uchun zarur ekanligini aniqlaganimiz sababli, DC661 nekroptozni, ya'ni retseptorlar bilan o'zaro ta'sir qiluvchi protein kinaz (RIPK) va aralash kinaz domeniga o'xshash oqsil bilan tartibga solinadigan dasturlashtirilgan hujayra o'limining boshqa shaklini qo'zg'atadimi yoki yo'qligini tekshirdik. MLKL). RIPK va MLKL ning fosforlangan va faollashtirilgan shakllari darajasi DC661 bilan davolashdan keyin 0,1-1 mkM dan oshdi (2F-rasm). 3 mkM DC661 da fosforlangan RIPK1 yo'qligi, ammo doimiy fosforlangan MLKL mavjud edi, bu yuqori konsentratsiyada hujayra o'limining qo'shimcha shakllari bilan shug'ullanishi mumkinligini ko'rsatadi. RIPK1 ingibitorlari nekrostatin-1 yoki nekrostatin-1s yoki MLKL inhibitori nekrosulfanilamid bilan dastlabki davolash melanoma hujayralarida DC661 (1 mkM) davolashdan so‘ng RIPK1 fosforillanishini oldini oldi (2G-rasm), ammo DC2{192-ni qutqara olmadi. }} melanoma hujayralarida (2H-rasm) yoki yo'g'on ichak saratoni yoki oshqozon osti bezi saratoni hujayralarida (qo'shimcha rasm 2G) sitotoksiklik. Bu topilmalar nekroptozning faollashganini, ammo DC{195}}vositalangan hujayra o‘limi uchun zarur ekanligini ko‘rsatadi.

Shakl 1. Lizosomal avtofagiya inhibisyonu apoptoz va autofagiya oqsillarida sezilarli o'zgarishlarni keltirib chiqaradi. (A)

Lizosomalar temirni saqlashning asosiy joylaridan biridir. Tartibga solinmagan hujayra ichidagi temir metabolizmi va reduktiv qobiliyatning pasayishi ferroptoz deb nomlanuvchi apoptotik bo'lmagan hujayralar o'limiga olib kelishi mumkin. Ferroptozning o'ziga xos xususiyati prostaglandin-endoperoksid sintaza 2 (PTGS2), kation transport regulyatori homologi 1 (CHAC1) va sisteinil-tRNK sintetaza (CARS) (14) ning yuqori regulyatsiyasi hisoblanadi. Ushbu 3 ta ferroptoz markerlarining barchasi DC661 bilan davolash orqali transkripsiyaviy tarzda tartibga solingan (3A-rasm), bu lizosomal inhibisyon ferroptozni keltirib chiqarishini ko'rsatadi. DC661 C11-BODIPY bilan davolash qilingan A375P hujayralarida floresan siljishini keltirib chiqardi, bu ferroptozga xos bo'lgan lipid peroksidatsiyasini ko'rsatadi. Ushbu DC{13}}qo‘zg‘atilgan siljish ferroptoz inhibitörleri ferrostatin-1 yoki labda rokstatin-1 ishtirokida samarali konsentratsiyada (3B-rasm va qo‘shimcha 3A-rasm) sezilarli darajada teskari bo‘lib, bu DC661 qo'zg'atilgan ferroptoz. Biroq, ferroptozni inhibe qilish DC661 bilan bog'liq sitotoksiklikni qutqarmadi (3-rasm, C va D). Saraton hujayralarini temir xelatatori deferoksamin (DFO) va DC661 bilan birgalikda davolash DC661 ning sitotoksikligini qutqara olmadi (3E-rasm). Ferrostatin-1, lab rokstatin-1 yoki DFO bilan davolash melanoma, yo'g'on ichak va oshqozon osti bezi saraton hujayralarida qisqa muddatli yashovchanlikni yoki uzoq muddatli klonogen o'sishni DC661 inhibisyonini qutqarmadi (3-rasm, B qo'shimcha). –E, va 4-rasm, A–D qo‘shimcha). Bu maʼlumotlar ferroptozning faollashganini, ammo DC vositachiligida hujayra oʻlimi uchun zarur ekanligini koʻrsatadi. Piroptoz - bu yallig'lanish reaktsiyasi bilan bog'liq bo'lgan dasturlashtirilgan hujayra o'limining bir shakli bo'lib, u gastrinni (GSDM) qayta ishlovchi kaspazalarning faollashishini o'z ichiga oladi, bu plazma membranasida gözeneklerin shakllanishiga va keyinchalik zarar bilan bog'liq molekulyar naqshlarning chiqishiga imkon beradi, masalan, yuqori harakatchanlik. guruh qutisi 1 (HMGB1). DC661ni bir nechta melanoma hujayralarida davolash (A375P, A375, WM35 va WM793) piroptozga xos bo'lgan initsiator kaspaza-8 va -9 va jallod kaspaza-7 faollashishiga olib keldi va hosil bo'ldi. PLX4720 va PD0325901 piroptoz induktoriga o'xshash to'liq uzunlikdagi GSDME ning bo'linishi (Qo'shimcha rasm 5A). DC661 faollashtirilgan piroptozning funktsional oqibatlarini aks ettiruvchi 1% FBS (15) da ma'lum bo'lgan piroptoz induktori, BRAF va MEK inhibisyoniga qaraganda HMGB1 ning hujayradan tashqari kuchli chiqarilishini ishlab chiqardi. Keyinchalik, biz GSDME KO tomonidan piroptozni inhibe qilish DC661 ning sitotoksik ta'sirini yaxshilaydimi yoki yo'qligini sinab ko'rdik. DC661 bilan davolash LC3II va SQSTM1/p62 to'planishi va kaspaza faollashuviga olib keldi, ammo HMGB1 chiqarilishi GSDME-KO WM35 inson hujayralarida deyarli butunlay bekor qilindi, bu piroptozni inhibe qilishning funktsional natijasiga erishilganligini ko'rsatdi (3F-rasm). Biroq, DC661 bilan davolash YUMM1.7 WT, bo'sh vektor (EV) va Gsdme KO1 va KO2 hujayralarida 10% va 1% FBS sharoitida teng sitotoksiklikni keltirib chiqardi (3G-rasm va qo'shimcha rasm 5B). Hujayra o'limining ko'p shakllarining umumiy natijalaridan biri LDH ning chiqarilishidir. DC661 LDH chiqarilishini sezilarli darajada oshirdi va buni apoptoz, nekroptoz yoki ferroptozni inhibe qilish orqali qaytarib bo'lmaydi (Qo'shimcha rasm 5C). Ushbu natijalar shuni ko'rsatdiki, DC661 hujayra o'limining bir nechta usullarini, jumladan apoptoz va piroptozni, shuningdek, nekroptoz va ferroptozni keltirib chiqaradi, ammo hujayra o'limining ushbu usullarining hech biri DC{73}}hujayra o'limi uchun zarur emas. Katepsin inhibisyonu yoki kaltsiy xelatatsiyasi lizosomal membrana o'tkazuvchanligi natijasida hujayra o'limiga to'sqinlik qilmaydi. Kaspaza faollashuvi (apoptoz va piroptoz uchun zarur bo'lgan) DC{74}}qo'zg'atilgan hujayra o'limi uchun zarur ekanligini ko'rsatib, biz lizosomalardan katepsin chiqishi kaspazaga bog'liq hujayra o'limiga olib kelishi mumkinligini taxmin qildik. PPT1 ning kimyoviy (DC661) yoki genetik (PPT1 siRNA [siPPT1]) inhibisyonu lizosomal membrana o'tkazuvchanligini (LMP) hosil qildi, HDSF esa hujayra madaniyatida tezda yo'q bo'lib ketadigan PPT1 ning kamroq kuchli qaytarilmas inhibitori, o'lchangandek, LMP ni keltirib chiqara olmadi. galektin tomonidan-3–musbat nuqta (4A-rasm). LMP katepsinlar va boshqa lizosomal tarkiblarni sitoplazmaga chiqarishga olib keladi va lizosomaga asoslangan hujayra o'limining asosiy proksimal xususiyati hisoblanadi. DC661 tomonidan qo'zg'atilgan LMP sitoplazmatik katepsin-L faolligining sezilarli darajada oshishi bilan bog'liq bo'lib, u sistein proteaz inhibitori E64 bilan sezilarli darajada bloklangan (4B-rasm). Oldingi ma'lumotlarga ko'ra, singan lizosomalardan katepsin ajralib chiqishi kaspaza faollashuviga yordam beradi va bu apoptotik hujayra o'limiga olib keladi (16-18). Katepsinni to'liq inhibe qilish kaspaza bo'linishining oldini olmadi (4C-rasm) va melanoma (4-rasm, D va E), yo'g'on ichak saratoni va oshqozon osti bezi kasalliklarida qisqa muddatli va uzoq muddatli hayotiylik tahlillarida DC tomonidan qo'zg'atilgan sitotoksiklikni qutqara olmadi. saraton hujayralari (Qo'shimcha rasm 6, A-C). Ushbu natijalar katepsin vositachiligida hujayra o'limiga asoslangan lizosomal hujayralar o'limining kanonik ko'rinishiga qarshi. Sızıntılı lizosomalardan katepsin chiqishi bilan bir qatorda, PPT1 buzilganda lizosomalardan kaltsiyning chiqarilishi hujayra disfunktsiyasiga ta'sir qiladi (19). DC661 bilan davolash natijasida kaltsiyning ko'p ajralib chiqishiga olib keldi, u hujayradagi doimiy kaltsiy (Ca2+) xelatatori BAPTA-AM bilan oldindan ishlov berish orqali bekor qilindi. (4F-rasm). Shunisi e'tiborga loyiqki, BAPTA-AM DC{105}}qo'zg'atuvchi LMP (4G-rasm) yoki kaspaza bo'linishining oldini olmadi (6, D va E qo'shimcha rasm) va eng muhimi, DC{108}}sitotoksikligini ( 4H-rasm). Bu topilmalar RKO va MIA PaCa{110}} hujayra liniyalarida ham kuzatildi, ularda BAPTA-AM va DC661 (Qo'shimcha rasm 6F) bilan IC50 qiymatlarida sezilarli farqlar kuzatilmadi, bu LMP bilan bog'liq hujayra o'limi ekanligini ko'rsatdi. kaltsiy yoki katepsinlarga bog'liq emas.

2-rasm. DC{1}}induktsiya qilingan apoptoz va nekroptoz. (A)

3-rasm. DC{1}}qo‘zg‘atuvchi ferroptoz va piroptoz. (A)

LLP LMP-ni boshqaradi. Hujayra o'limining asosiy yo'llarining ingibitorlari (apoptoz, nekroptoz, ferroptoz va piroptoz), katepsinlar (PepA va E64) va ion xelatatorlari (BAPTA-AM [Ca2+] va DFO [Fe{3}" ekanligini aniqlagan. }]) DC661 tomonidan hujayra o'limini oldini olmadi va C-11-BODIPY tomonidan lipid peroksidatsiyasining dalillarini topdi, biz DC661 bilan davolashdan keyin 2 va 4 soat ichida global lipidom tahlilini o'tkazdik. DC661 lizofosfolipidning har bir sinfida erta va barqaror 3- 10- marta ko'paydi (5A-rasm). Aksincha, fosfolipidlar sinflarida, jumladan, fosfatidilxolin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin, fosfatidilinositol, fosfatidilgliserol va fosfatid kislotada minimal yoki hech qanday o'zgarishlar kuzatilmadi (Qo'shimcha rasm 7A). Lizofosfolipid turlari ROS tomonidan hosil bo'lishi mumkin, bu esa to'yingan yog 'kislotalari zanjirini oksidlaydi, keyinchalik fosfolipazalar tomonidan parchalanadi (20). Antioksidantlar ROS vositachiligida lipid shikastlanishining oldini olishi mumkinligini aniqlash uchun biz pan-ROS tozalovchi N-asetilsistein (NAC) (21, 22) va lipid peroksidlanishining taxminiy inhibitörleri Trolox (23) ishtirokida DC{16}}sitotoksikligini tekshirdik. ) va vitamin C (askorbin kislotasi) (24, 25). Hozirgacha sinovdan o'tgan boshqa agentlardan farqli o'laroq, NAC bilan birgalikda davolash DC{24}}bir nechta hujayra chizig'i bo'ylab sitotoksiklikni saqlab qoldi (5B-rasm va qo'shimcha 7B-rasm). Uzoq muddatli CFU tahlillari shuni ko'rsatdiki, NAC bu erda sinovdan o'tgan barcha hujayra o'limi inhibitörleri, ion chelatatorlari va katepsin inhibitörlerinden farqli o'laroq, DC661 ning A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 va MC38 hujayralarida sitotoksik ta'sirini oldini olgan ( 5C-rasm va qo'shimcha 7C-rasm). Qizig'i shundaki, Trolox va vitamin C DC661 sitotoksikligini inson melanomasi, yo'g'on ichak saratoni, oshqozon osti bezi saratoni hujayralari va murin melanomasi va kolorektal saraton hujayralarida qutqara olmadi (5D-rasm va qo'shimcha rasm 7, D-H). Ushbu nomutanosiblik bizni NAC, Trolox va vitamin C LMPga ta'sir qiladimi yoki yo'qligini tekshirishga undadi. Natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, NAC doimiy ravishda qo'zg'atadigan LMP ni sezilarli darajada kamaytiradigan yagona antioksidantdir (5E-rasm). Biz LLP LMP ishlab chiqarishni DC661 tomonidan boshqaradi, deb faraz qildik, bu NAC tomonidan qaytarilishi mumkin, Trolox va vitamin C tomonidan emas. lipid peroksidlari ta'sirida 586 dan 512 nm gacha (qizildan yashil ranggacha) spektral siljish. Biz DC661 nazorat bilan solishtirganda LLP ni keltirib chiqarganligini aniqladik (5F-rasm). NAC DC{48}}davolangan melanoma hujayralari lizosomalarida lipid peroksidlanishini kamaytirdi, Trolox va vitamin C esa LLPni kamaytira olmadi (5F-rasm). NAC, Trolox va vitamin C o'z-o'zidan lipid peroksidatsiyasiga sezilarli ta'sir ko'rsatmadi. PPT1 ning ishdan chiqishi (Qo'shimcha rasm 8A) yoki yuqori konsentratsiyali HCQ bilan davolash (Qo'shimcha rasm 8B) ham NAC tomonidan qaytarilishi mumkin bo'lgan LMP ni keltirib chiqardi, ULK1 ning kimyoviy inhibisyonu esa LMP ni keltirib chiqarmadi (8C qo'shimcha rasm). Muhimi, siPPT1 ning nokautiga NAC bilan qaytarilishi mumkin bo'lgan LLP ham kiradi (Qo'shimcha rasm 8D) Ushbu natijalar PPT1 inhibisyoni NAC tomonidan qutqarilishi mumkin bo'lgan LLP ni keltirib chiqarishini ko'rsatdi va PPT1- ingibisiyasidan kelib chiqqan LMP sabab bo'lishi mumkin. Bundan tashqari, ushbu topilmalar LLP lizosomal hujayralar o'limi uchun juda muhim ekanligini ko'rsatdi.

Xitoy o'ti cistanche o'simligi - Antitumor

Sisteinning MFSD12 tomonidan lizosomalarga importi lizosomal hujayralar o'limini susaytiradi. 3 ta lipid peroksidlanish ingibitorlaridan faqat NAC LLPni oldini oldi. Yaqinda e'lon qilingan hisobot shuni ko'rsatdiki, 12 (MFSD12) ni o'z ichiga olgan asosiy yordamchi superfamili domen lizosomalar va melanosomalar uchun sistein importchisining muhim tarkibiy qismidir (27). Biz NAC yoki uning metaboliti sistein MFSD12 orqali lizosomaga o'tkaziladi, bu erda sistein o'zining disulfidi sisteinga oksidlanadi, deb o'yladik. Ushbu gipotezani sinab ko'rish uchun biz NACning siNT va siMFSD12 A375P-hGal{10}}EGFP hujayralarida DC661 sitotoksikligini qutqarish qobiliyatini solishtirdik. Natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, NAC DC{11}}siNT hujayralarida LMP ni qutqargan, ammo siMFSD12 hujayralarida LMPni qutqarmagan (6A-rasm). NAC DC{14}}davolangan siNT-A375P hujayralarining LLPsini qisqartirdi, lekin siMFSD12 hujayralarini emas. DMSO yoki NAC bilan davolash qilingan siMFSD12 hujayralari siNT hujayralari bilan solishtirganda bazal LLP (6B-rasm) ko'paygan. NAC siNT hujayralarida DC661 sitotoksikligini qutqargan bo'lsa-da, NACning DC661 sitotoksikligini qutqarish qobiliyati siMSFD12 hujayralarida butunlay bekor qilindi (6C-rasm). Bu shuni ko'rsatdiki, MFSD12 nokdaun DC661 ga qarshi NACning sitoprotektiv ta'sirini bloklaydi. NAC sitozolda asilaz tomonidan deasetillanadi (28). NAC bilan davolash lizosomalar ichida sistein yoki sistin to'planishini aniqlash uchun biz lizosomalarni DMSO va NAC bilan ishlov berilgan A375P hujayralaridan tozalash uchun lizosomal immunopresipitatsiya (Lizo-IP) usulidan (29) foydalandik (6D va qo'shimcha shakl 9A) NAC va tegishli metabolitlarni aniqlash uchun maqsadli metabolomikalar. Kutilganidek, NAC NAC bilan ishlov berilgan butun hujayrali lizatda va bog'lanmagan fraktsiyalarda aniqlandi. NAC bilan davolash qilingan lizosomalarda L-sistein darajasi sezilarli darajada oshdi. L-sistin faqat NAC bilan davolash qilingan lizosomalarda aniqlangan. Ajablanarlisi shundaki, biz NAC bilan davolash qilingan guruhlarda glutationning sezilarli o'sishini (kamaytirilgan) topmadik (6E-rasm); Bu ajablanarli edi, chunki NAC bilan davolash glutation ishlab chiqarishni ko'paytirishga olib keladi, bu esa oksidlanish-qaytarilish muvozanatini to'g'irlaydi. Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, MFSD12 importchisi orqali lizosomalarga import qilingan sistein LLP, LMP va lizosomal hujayra o'limini qutqarish uchun juda muhimdir. LLP immunogen xususiyatga ega. DC661 tomonidan qo'zg'atilgan tartibga solinadigan hujayra o'limining ba'zi shakllari (piroptoz, nekroptoz, ferroptoz) immunogen sifatida aniqlangan. Ilgari immunogen hujayralar o'limi xarakterli xususiyatlarga asoslangan kimyoterapiya preparatlari uchun tavsiflangan bo'lib, ular zarar bilan bog'liq molekulyar naqshlarni ko'rsatishni o'z ichiga oladi, shu jumladan CALR ning hujayra sirtini ifodalash va HMGB1 oqsili va adenozin trifosfat (ATP) (30). CALR hujayra stressi paytida hujayra sirtiga ta'sir qilganda "meni yeyish" signali sifatida ishlaydi. HMGB1 va ATP ning hujayradan tashqari chiqarilishi fagotsitar hujayralar tomonidan tan olingan "meni top" signali sifatida ishlaydi. Biz ikkita modelni solishtirdik: singen o'simta modellarida o'simtani infiltratsiya qiluvchi limfotsitlardan deyarli to'liq mahrum bo'lgan B16F10 hujayralari va singen o'simta modellarida o'simta infiltratsion limfotsitlariga ega bo'lgan MC38 hujayralari. Birinchidan, biz DC661 yoki siPpt1 bilan davolash MC38 hujayralarida NAC bilan davolash bilan butunlay bekor qilinishi mumkin bo'lgan sirt CALR ifodasini sezilarli darajada induktsiya qilishini ko'rsatdik (7, A va B-rasmlar). Shunga o'xshash topilmalar B16F10 hujayralarida kuzatilgan (7C-rasm). Hujayralarning asosiy o'lim yo'llarining ingibitorlari (apoptoz, nekroptoz, ferroptoz va piroptoz) CALR ning sirt ifodasini oldini ololmadi (7D-rasm). DC661 tomonidan qo'zg'atilgan immunogen hujayra o'limi MHC klassi I ko'tarilishi bilan bog'liqligini aniqlash uchun B16F10 va MC38 hujayralari DC661 (3 mkM) yoki DMSO bilan 24 soat davomida davolandi. Biz DC661 bilan davolash MHC klassi I ifodasini va immunoproteazomlarning yuqori regulyatsiyasini oshirmaganligini aniqladik (7E-rasm va qo'shimcha shakl 9, B va C).

4-rasm. Katepsin inhibisyonu yoki kaltsiy xelatatsiyasi DC661-induktsiyasi natijasida hujayra o'limiga to'sqinlik qilmaydi. (A)

Otofagiya inhibisyonining T-hujayra astarlanishiga ta'sirini tushunish uchun biz ilgari tasvirlangan (31) C57BL6/J splenotsitlari yordamida in vitro priming va kokultura tajribasini o'tkazdik. Astarlash uchun biz splenotsitlarni DC661- yoki DMSO bilan ishlov berilgan B16F10 yoki MC38 hujayralariga ta'sir qildik. Keyinchalik, bu astarlangan splenotsitlar jonli B16F10 yoki MC38 hujayralari bilan ekilgan va sitotoksiklik o'lchangan (8A-rasm). DC{12}}davolangan B16F10 hujayralari bilan astarlangan splenotsitlar DMSO bilan ishlov berilgan B16F10 hujayralariga ta'sir qilgan splenotsitlarga nisbatan IFN-ni sezilarli darajada oshirdi. Primerlangan T-hujayralari vositachiligida proliferatsiyalanuvchi B16F10 hujayralarini o'ldirish DC{21}}prizlangan splenotsitlarda DMSO bilan astarlangan splenotsitlar bilan solishtirganda sezilarli darajada oshdi (8-rasm, B va C). DC661 bilan davolash qilingan MC38 hujayralari B16F10 hujayralari bilan solishtirganda yanada ko'proq IFN- va astarlangan T hujayralari sitotoksikligini hosil qildi (8-rasm, D va E). DC661 bilan NAC bilan davolash splenotsitlardan IFN- chiqarilishini va to'mtoq astarlangan T-hujayra sitotoksikligini butunlay bekor qilishga muvaffaq bo'ldi (8-rasm, F va G). MC38 hujayralarida kalretikulinning siCalr tomonidan ishdan chiqishi (Qo'shimcha rasm 9D) DC661 bilan davolashning boshlang'ich samaradorligini bekor qildi va astarlangan T-hujayra sitotoksikligini sezilarli darajada kamaytirdi (8-rasm, H va I). Birgalikda bu ma'lumotlar LLP bilan bog'liq bo'lgan CALR regulyatsiyasining o'smaga qarshi hujayra T hujayralari immunitetini oshirishda mexanik rolini qo'llab-quvvatlaydi. Keyinchalik, biz ushbu in vitro topilmalarini immunokompetent va immunitet tanqisligi bo'lgan sichqonlar modellarida o'simtaga qarshi emlash bo'yicha in vivo tadqiqotga kengaytirdik. Ushbu tahlil uchun in vitro muzlatilgan eritilgan yoki DC{40}}davolangan B16F10 yoki MC38 hujayralari immunokompetent C57BL/6 yoki NOD/SCID sichqonlarini bir xil turdagi jonli o'simta hujayralari bilan qayta tiklanishdan himoya qilish uchun chap qanotga skrining AOK qilingan. 7 kundan keyin o'ng qanotga (9A-rasm). DC661-davolangan B16F10 xujayralari in vitro tahlillariga qaramay, o'simtani rad etishning oldini ololmadi, bu DC661 immunogen hujayra o'limini keltirib chiqarganini ko'rsatadi (9B-rasm va qo'shimcha 9E-rasm). Aksincha, bitta qanotni DC{54}}davolangan MC38 hujayralari bilan emlash qarama-qarshi qanotga implantatsiya qilingan jonli MC38 hujayralarini butunlay rad etishga yordam berdi (9C-rasm va qo'shimcha 9F-rasm). Adaptiv immunitet DC661 vaktsina ta'siri uchun MC38 o'smalari uchun juda muhim ekanligini aniqlash uchun biz NOD/SCID sichqonlarida tajribani takrorladik. Ajablanarlisi shundaki, biz DC{61}}davolangan MC38 hujayralari immunitet tanqisligi bo‘lgan NOD/SCID sichqonlarida qayta tiklanadigan o‘smalarni rad etishga olib kelmasligini aniqladik (9D-rasm va qo‘shimcha 9G-rasm), bu kuzatilgan vaktsina effekti uchun adaptiv immunitet zarurligini ko‘rsatadi. Ushbu topilmaning mustahkamligini sinab ko'rish uchun biz boshqa taniqli immunogen sichqon saratoni hujayra liniyasini, CT26 ni tanladik va yuqoridagi kabi emlash tajribasini o'tkazdik. Kutilganidek, DC{67}}davolangan CT26 xujayralari sichqonchaning bir qanotiga implantatsiyasi vaktsinaga o'xshash ta'sir ko'rsatdi va boshqa qanotga implantatsiya qilingan jonli CT26 hujayralarining ko'payishini oldini oldi (9E-rasm va qo'shimcha rasm 9H). Bizning topilmalarimiz shuni ko'rsatdiki, DC{73}}induktsiyalangan LLP LMP vositachiligidagi immunogen hujayralar o'limi uchun juda muhim, bu lizosomal tashuvchi MFSD12 tomonidan sisteinni lizosomaga import qilish orqali qaytariladi (9F-rasm).

Munozara

Preklinik tadqiqotlarda lizosomal inhibisyon istiqbolli terapevtik yondashuv bo'lib ko'rinadi va HCQ klinik sinovlari dalda beruvchi, ammo aralash natijalar berdi (1, 32). PPT1 HCQ ning molekulyar maqsadi bo'lib, DC661 (2) va GNS561 (3) kabi kuchliroq PPT1 inhibitörleri in vitro LMP vositachiligida hujayra o'limini keltirib chiqaradi. Lizosomal hujayralar o'limining aniq mexanizmi va uning o'simta immunogenligidagi roli to'liq aniqlanmagan. Otofagiya inhibisyoni immunoterapiya bilan birlashtirilganda o'smaga qarshi immunitet kuchayadi (9, 10, 31). Avtofagiyani inhibe qilishdan keyin hujayraning ichki immunogenligi uchun tavsiya etilgan mexanizmlar MHC klassi I va immunoproteazomlarning ko'tarilishini o'z ichiga oladi, bu ikkalasi ham antigenni qayta ishlash va taqdim etishni yaxshilaydi. Bundan tashqari, dendritik hujayralardagi MHC I sinfining sirt darajasini oshirish orqali xlorokin bilan otofagiya oqsillarini yo'qotish yoki otofagiyani inhibe qilish CD8+ T hujayralari javobini kuchaytiradi (33). Biz ilgari tizimli PPT1 inhibisyoni makrofaglarni M2 dan M1 fenotipiga repolyarizatsiya qilishi mumkinligini ko'rsatdik. PPT1 ingibitorlari STING darajasini oshirishi mumkin, bu melanoma modellarida IFN chiqarilishiga va T-hujayralari vositasida o'ldirishning kuchayishiga olib keladi (31). Bu erda biz LLP ning o'zi o'simta hujayralarini ishlab chiqarishini ko'rsatdik - hujayra o'limining ichki immunogen shakli. Biz lizosomal inhibisyon saraton hujayralarida juda kam protein o'zgarishlarini keltirib chiqarganini aniqladik va eng sezilarli darajada ko'tarilgan oqsillar otofagiya yuk retseptorlari va apoptoz regulyatorlarini o'z ichiga oladi. Funktsiyalar bo'yicha ushbu genlarning ba'zilariga qaratilgan bizning yondashuvimiz shuni ko'rsatdiki, giyohvand moddalar bilan bog'liq oqsillar hujayra o'limining asosiy regulyatorlari emas. ULK1 yoki ATG7 ning genetik inhibisyonu DC661 sitotoksikligini ham qutqarmadi. Biz lizosomal inhibisyon apoptoz, nekroptoz, ferroptoz va piroptozni o'z ichiga olgan dasturlashtirilgan hujayra o'limining ko'p shakllarini faollashtirishini ko'rsatdik, ammo ularning har biri dori-darmonli sitotoksiklik uchun zarur edi. Shunisi e'tiborga loyiqki, dasturlashtirilgan hujayra o'lim mexanizmlari bir-biriga mos kelishi mumkin va bir nechta hujayra o'lim mexanizmlarining kotargetatsiyasi lizosomal membrana o'tkazuvchanligidan keyin hujayra o'limiga qarshi sitoproteksiyani ta'minlashi mumkin. Bizning ishimiz lizosomal hujayralar o'limining katepsin va kaltsiyga bog'liq mexanizmlarini istisno qildi va hujayra o'limining hal qiluvchi omili sifatida LLP ning ahamiyatini ta'kidladi. Biz lizosomaga, NACga o'tkaziladigan va lizosomal membrana o'tkazuvchanligi va sitotoksiklik uchun juda muhim bo'lgan antioksidant tomonidan qaytariladigan LLP dalillarini topdik. NAC DC{27}}qo'zg'atilgan hujayra o'limini yumshata oladigan yoki qaytara oladigan yagona agent edi va bu quvvat lizosomal sistein tashuvchisi MFSD12 mavjudligiga bog'liq edi. Lizosomal penetratsiyaning etishmasligi, ehtimol, boshqa taxminiy lipid peroksidlanish inhibitörleri, Trolox va vitamin C DC661 sitotoksikligini oldini ololmaganligi. NAK sisteinga aylanadi, u lizosomalarga import qilinadi va disulfid shakli sistinga oksidlanadi. Sistin sitozolga boshqa lizosomal tashuvchi - sistinoz orqali eksport qilinadi, u erda u ichki ozuqa manbalarini qayta harakatga keltiradigan, rapamisin kompleksi 1 maqsadini qayta faollashtiradigan va autofagiyani rag'batlantiradigan sisteinga kamayadi (34). Sisteinning sistinga (lizosomalar) va yana sisteinga (sitozol) oksidlanish-qaytarilish aylanishi NACni DC661 sitotoksikligiga yoki boshqa kasallik kontekstlarida umumiy lizosomal shikastlanishga qarshi qutqarish mexanizmi bo'lishi mumkin, bunda NAC terapevtik jihatdan foydali ekanligi isbotlangan (35) . NAC nafaqat DC{35}}induktsiyali LLP va LMP ni o'zgartirdi, balki immunogen hujayra o'limi belgisi kalretikulinning sirt ifodasini ham qildi. CALR oqsilining hujayra sirti ekspressiyasi DC{36}}prizlangan splenotsitlar tomonidan qo'zg'atilgan T-hujayra vositachiligidagi sitotoksiklikning kuchayishi uchun zarur bo'lib, bu lizosomal inhibisyon hujayraning o'ziga xos immunogenligining o'ziga xos shaklini hosil qilishini ko'rsatdi.

Oldingi tadqiqotlar lizosomal inhibisyon o'rnatilgan yonbosh o'smalarida immun nazorat nuqtasi inhibisyonining o'smaga qarshi faolligini oshirishi mumkinligini ko'rsatgan bo'lsa-da (9, 31), bizning tadqiqotimiz MC38 o'smalari uchun vaktsinaga o'xshash ta'sir ko'rsatadigan birinchi bo'lib, B16 o'smalarida emas. implantatsiyadan oldin DC661 bilan davolash qilingan o'simta hujayralari. Bu shuni ko'rsatadiki, lizosomal hujayralar o'limi hujayraning ichki immunogenligini keltirib chiqarishi mumkin, ammo bu o'zgarishlar o'z-o'zidan "immun sovuq" o'sma mikro muhitini "immun issiq" o'simta mikromuhitiga aylantirish uchun etarli emas. B16 va BRafCA PtenloxP Tyr: CreERT2 genetik jihatdan ishlab chiqilgan sichqoncha modellari (31) "immun sovuq" o'simta mikromuhiti modellari bo'yicha oldingi tadqiqotlarimiz shuni ko'rsatdiki, tizimli lizosomal inhibisyon o'simta bilan bog'liq makrofaglarga va miyeloid hujayradan kelib chiqadigan hujayralarni bostirish uchun etarli bo'lgan ta'sir ko'rsatadi. immunoterapiya samaradorligi. Lizosomal inhibisyondan keyin ICDga ko'proq javob beradigan bu immunitet sovuq o'smalarida hujayraning ichki immunogenligi ham rol o'ynashi mumkin. Nazorat qilinadigan laboratoriya muhitida kuzatilgan lizosomal inhibisyonning vaktsinaga o'xshash ta'siri klinikaga o'tishi mumkin yoki bo'lmasligi mumkin, ammo bu nima uchun ilgari davolangan BRAF mutant melanomasida dabrafenib, trametinib va ​​HCQ bilan davolangan ba'zi bemorlarda bunday chuqur va bardoshli bo'lganligini tushuntirishi mumkin. bu rejimga javob bering (32). PPT1 inhibisyoni lizosomal ROS va lipid peroksidatsiyasini qanday hosil qilishini tushunish uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab etiladi. V-ATPaza va lizosomal kislotalanishning PPT{15}}bog'liq regulyatsiyasi etarli tushuntirish emas, chunki bafilomisin lizosomal kislotalanishni inhibe qiladi, lekin LMP hosil qilmaydi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Ushbu topilmalar natijalari shuni ko'rsatadiki, o'simta hujayralarining ichki immunogenligini kuchaytiruvchi lizosomal ingibitorlar T-hujayralarining faollashuvini yoki o'simta mikro muhitiga infiltratsiyani kuchaytiradigan terapiya bilan oqilona birlashtirilishi mumkin, bu potentsial sinergik ta'sir ko'rsatadi.

5-rasm. N-asetilsistein DC661-hujayralarining o'limini oldini oladi. (A)

Usullari

Hujayra madaniyati. Inson A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL{6}} ), A549 (CRM-CCL-185) va sichqonchaning B16F10 (CRL-6475) hujayra liniyalari ATCC'dan sotib olindi. Insonning A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 va sichqoncha YUMM1.7 (WT, Gsdme EV va Gsdme KO1 va KO2) liniyalari uyda olingan. Sichqoncha MC38 va CT26 hujayralari Pensilvaniya universiteti Endi Minn tomonidan taqdim etilgan. FL5.12 va IL -3 ga bog'liq Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) asosiy suyak iligi hujayralari Pensilvaniya universiteti Kathryn E. Wellendan olingan. Inson Panc{27}} (CRL-1469, ATCC) hujayra liniyasi Pensilvaniya universiteti Ben Z. Stanger tomonidan taqdim etilgan. Sichqoncha YUMMER 1.7 hujayra liniyasi Pensilvaniya universiteti Xiaowei (Jorj) Xudan olingan. Barcha hujayra liniyalari Pensilvaniya universitetining yadroviy muassasalari tomonidan yiliga ikki marta Mycoplasma uchun sinovdan o'tkazildi va Wistar instituti Genomics yadrosi tomonidan qisqa tandemli takroriy barmoq izlari yordamida autentifikatsiya qilindi. A375P, RKO, DLD{33}}, A549, CT26, FL5.12 va Bax/ Bak DKO hujayra liniyalari RPMI 1640 (Invitrogen, 11875) da yetishtirildi; A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10 va MC38 hujayra liniyalari DMEMda yetishtirildi (Invitrogen, 11995); va YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV va Gsdme KO1 va KO2) hujayralari (15) DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV) da ekilgan. Madaniyat muhiti 10% homila sigir zardobi (12306C, MilliporeSigma) va 1x antibiotik antimikotik eritmasi (Gibco, 15140-122) bilan to'ldirildi. FL5.12 va Bax/Bak DKO hujayra liniyalari 50 mkM -merkaptoetanol (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, MilliporeSigma) va 0,35 ng/mLng va /ml IL-3, mos ravishda. YUMMER1.7 va YUMM1.7 (WT, Gsdme EV va Gsdme KO) hujayra chiziqlari 1 × MEM NEAA (Gibco, 11140-050) bilan to'ldirilgan to'liq muhitda saqlangan. WM35 va WM793 hujayralari 1x Leibovitz L-15 muhitida 10% FBS (Corning, 10-045-CV), 7,5% w/v natriy bikarbonat () o'z ichiga olgan MCDB muhitida 153 (MilliporeSigma, M7403) ekilgan. Corning, 25-035-CI), 1x antibiotik antimikotik eritmasi (Gibco, 15140-122) va 5 ug/ml insulin (MilliporeSigma, I0516). Hujayralar 5% CO2 mavjudligida 37 darajada o'stirildi. Kimyoviy moddalar va reagentlar. Sotib olingan kimyoviy moddalar qatoriga HCQ sulfat (Spectrum Chemicals, 747-36-4) va DC661 (Selleckchem, S8808) kiradi. Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) ishlab chiqaruvchi ko'rsatmalariga muvofiq hujayralarni kaltsiyga bo'yash uchun ishlatilgan. Antikorlar va ingibitorlar ro'yxati qo'shimcha 1-jadvalda va 2-jadvalda keltirilgan.

6-rasm. NAC LLPni MFSD12-bog'liq holda qaytaradi. (A–C)

Proteomika uchun suyuqlik xromatografiyasi-tandem massa spektrometriyasi tahlili uchun oqsillarni olish va hazm qilish. {0}},7 × 106 A375P melanoma hujayralari 60 mm kulturali idishlarda ekilgan. Hujayralar DMSO (nazorat), DC661 (3 mkM), HCQ (10 mkM) yoki HCQ (3{{70}} mkM) bilan 24 soat davomida taxminan 5{{ 112}}% qo'shilish. Muzlatilgan hujayra granulalari 5 0 mM Tris pH 7,4, 1% SDS, 15 0 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0, 15 mM PMSF, 1 ug/ml pepstatin, va 1 ug/ml leypeptin. Aniqlangan lizatlar (har biri 1{185}} ug) bis-tris jelga 0,5 sm elektroforezlangan, so'ngra kolloid Coomassie bilan mahkamlangan va bo'yalgan. Har bir 0,5 sm gel chizig'i kesilgan, ajratilgan, tris (2-karboksietil) fosfin bilan qisqartirilgan, yodoasetamid bilan alkillangan va yuqorida aytib o'tilganidek (36) tripsin bilan hazm qilingan. Dijestlar (1 ug) nanoAQUITY UPLC (Waters) ga muvofiq Q-Exactive Plus massa spektrometrida (Thermo Fisher Scientific) suyuq xromatografiya-tandem massa spektrometriyasi (LC-MS/MS) orqali tahlil qilindi. Analitik ajratish suvda 0,1% chumoli kislotasi (mobil faza A) va asetonitril (mobil faza B) bilan 245-daqiqalik gradient yordamida 1,7 mkm × 250 mm Peptid BEH C18 ustunida (Suvlar, 186003546) quyidagi tarzda amalga oshirildi. : 225 daqiqada 5%–30% B, 5 daqiqada 30%–80% B, 15-daqiqa 80% B da ushlab turing va dastlabki sharoitga qayting. Toʻliq MS spektrlari 70,{49}} oʻlchamda, skanerlash diapazoni 400–2,{000 m/z, daromadni avtomatik boshqarish maqsadi 3 × 106 ion va maksimal inyeksiya vaqti bilan olingan. 50 millisekund. Maʼlumotlarga bogʻliq boʻlgan MS2 spektrlari eng koʻp tarqalgan 20 ta eng koʻp boʻlgan ionlar uchun 17500 ruxsatda, izolyatsiyalash kengligi 1,5 m/z, avtomatik daromadni boshqarish maqsadi 5 × 104 ion va maksimal inyeksiya vaqti 50 millisekundda olingan. Peptid mosligi afzal ko'rildi va tayinlanmagan va yakka zaryadlangan ionlar rad etildi (37). Xom MS ma'lumotlari MaxQuant 1.6.5.0 (https:// maxquant.net/perseus/) yordamida Uniprot inson ketma-ketligi ma'lumotlar bazasi (2019-yil 10-oktabrda kirish) va umumiy ifloslantiruvchi moddalar, jumladan tripsin, keratinlar, sigir oqsillari, va mikoplazma (38). Qidiruvda ko'pi bilan 2 ta o'tkazib yuborilgan bo'linish, sistein bo'yicha sobit modifikatsiya (karbamidometilatsiya) va o'zgaruvchan metionin oksidlanishi yoki N-terminal atsetilatsiyasi bilan triptik peptid o'ziga xosligi ishlatilgan (39). Peptidlar va oqsillar uchun 1% FDR chegarasi ishlatilgan. Yugurishlar orasidagi moslik yoqilgan; oqsillar yorliqsiz miqdorni aniqlash (40) yordamida aniqlangan. Statistik tahlil Perseus 1.6.2.3 (https:// maxquant.net/perseus/) yordamida amalga oshirildi (41, 42). Proteinlar kamida 3 ta noyob peptid bilan aniqlanishi va namunalar guruhida 3 ta haqiqiy qiymatga (nol bo'lmagan miqdorga) ega bo'lishi kerak edi va ifloslantiruvchi moddalar va teskari oqsillar ma'lumotlar to'plamidan filtrlangan. Yo'qolgan qiymatlar oddiy taqsimotdan hisoblangan. Shartlar o'rtasidagi juftlik taqqoslashlari oqsil darajasida 2-quyruqli Student's t-testidan foydalanib, s0=0.1 va 250 randomizatsiya bilan permutatsiyaga asoslangan FDR bilan amalga oshirildi. Muhim o'zgarishlar FDR 5% dan kam va mutlaq o'zgarishlar 1,5 yoki 2,0 dan yuqori bo'lgan holda aniqlandi. Lizo-IP. A375P hujayralari pLJC5-Tmem192-3xHA lentivirusi bilan zararlangan va 1 mg/ml puromisin (MilliporeSigma, P4512) yordamida tanlangan. Taxminan 3 × 106 HA-belgilangan A375P xujayralari 24 soat davomida 10 mM NAC yoki suv transporti nazorati bilan yuqorida tavsiflangan madaniyat sharoitida davolandi. Davolanishdan so'ng hujayralar PBSda yuvildi, 0,5 ml sovuq KPBSda yig'ildi va 2 ml Dounce gomogenizatorida 20 zarba yordamida yumshoq homogenlashtirildi. Gomogenatning taxminan 2,5% butun hujayra lizatini tahlil qilish uchun ajratilgan va qolgan qismi hujayra membranasi qoldiqlarini olib tashlash uchun 3000g 4 gradusda 2 daqiqa davomida santrifüj qilingan. Keyin gomogenat supernatanti toza 1,5 ml trubkaga o'tkazildi va 50 mL anti-HA boncuklar (Pierce, 88836) yoki anti-DDK/Flag boncuklar (OriGene, TA150042) bilan 15 daqiqa davomida 4 daraja haroratda inkubatsiya qilindi. Keyin namunalar DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) ga qo'yish orqali cho'ktirildi va xona haroratida 2 daqiqa davomida muloyimlik bilan silkitildi. Supernatant bog'lanmagan fraktsiya tahlili uchun ajratilgan. IP 8 mM CaCl2 o'z ichiga olgan KPBS bilan 3 marta yuvilgan. Lizo-IP metabolomikani tahlil qilish uchun 80% MeOH da ekstrakte qilingan. Global lipidom uchun LC-MS/MS yordamida lipidlarni olish va tahlil qilish. Melanoma A375P hujayralari har bir idish uchun 0,7 × 106 hujayrada 60 mm idishlarga ekilgan. Hujayralar taxminan 50% qo'shilishda bo'lganida, ular 24 soat davomida DMSO (nazorat), DC661 (3 mkM) yoki HCQ (30 mkM) bilan ishlov berildi. Hujayralar HBSS bilan 2 marta yuvilgan, muzli sovuq metanolga qirib tashlangan va EquiSPLASH ichki lipid standarti (Avanti Polar Lipidlari) o'z ichiga olgan xloroform/metanol/0,88% NaCl (2:1:1) bilan lipid ekstraktsiyasi uchun shisha naychalarga o'tkazilgan. Namunalar vortekslangan va keyin muz ustida 5 daqiqa davomida suv hammomida sonikatsiya qilingan. 500 g da 15 daqiqa davomida 40 gradusda santrifüj qilingandan so'ng, pastki faza boshqa shisha naychaga o'tkazildi. Yuqori faza sintetik pastki faza yordamida qayta chiqarilgan. Sonikatsiya va santrifüjdan so'ng, pastki faza birinchi pastki faza yig'ish bilan birlashtirildi. Namunalar azot ostida quritildi, 10% xloroform/90% metanolda qayta suspenziya qilindi va shisha LTQ flakonlariga o'tkazildi. Lipid namunalari Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X massa spektrometrida va Vanquish Horizon UHPLC tizimida tahlil qilindi. Analitik ajratishda 50:50 asetonitril/suv va 88:10:2 izopropanol/asetonitril/suvga ega bo'lgan Accucore C30 ustuni (2,1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) ishlatilgan, har birida 5 mM ammoniy formati va 0,1% formik kislota mavjud. LC-MS/MS maʼlumotlari quyidagi asbob parametrlari bilan ijobiy va salbiy qutblarda alohida olingan: MS1 skanerlash 120, 000 oʻlcham; maʼlumotlarga bogʻliq MS2 15,000 oʻlchamdagi eng koʻp tarqalgan 20 ta ionda; 0,4 m/z izolyatsiyalash kengligi; va bosqichli normallashtirilgan to'qnashuv energiyasi 20:30:40 (43).

7-rasm. N-asetil sistein DC{2}}induktsiyali kalretikulin sirt ifodasini oldini oladi. (A–D)

Lipidlar aniqlandi va miqdori LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific) yordamida aniqlandi. Aniqlangan lipid turlari kutilgan qo'shimchalar va sinfga asoslangan identifikatsiya darajasi bo'yicha filtrlangan. Tepalik zonalari qo'llab-quvvatlanadigan sinflar uchun EquiSPLASH standartlariga normallashtirildi va hujayralar sonidagi o'zgarishlarni tuzatish uchun har bir namuna uchun umumiy maydon asosida normallashtirildi. Statistik tahlil Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42) yordamida jurnalga aylantirilgan ma'lumotlar bo'yicha amalga oshirildi. Metabalon uchun LC-MS/MS yordamida metabolitlarni ekstraksiya qilish va tahlil qilish. Polar metabolitlar butun hujayralardan, Lizo-IP bilan bog‘lanmagan fraksiyalardan va Lizo-IP bilan bog‘langan namunalardan 8{28}}% metanol yordamida ajratildi va suyuq xromatografiyadan oldin -8{{30}} darajada saqlangan. -mass-spektrometriya (LC-MS) tahlili. Ekstraktlar Thermo Vanquish Horizon UHPLC tizimiga mos ravishda HESI II zondli Thermo Scientific Q-Exactive HF-X massa spektrometri yordamida LC-MS tomonidan tahlil qilindi. LCni ajratish ZIC-HILIC ustuni (2,1 mm × 150 mm, zarrachalar hajmi 5 mkm, EMD Millipore) yordamida ZIC-HILIC himoya ustuni (2,1 mm × 20 mm, EMD Millipore) oqim tezligi bilan 45 gradusda ushlab turildi. 0,2 ml/min. Tiol guruhlarining reaktivligini kamaytirish uchun xromatografiya kislotali sharoitda o'tkazildi. Mobil faza A suv va B asetonitril bo'lib, ikkalasida 0,1% chumoli kislotasi mavjud. LC gradienti 2 daqiqa davomida 85% B, 15 daqiqada 85% B dan 20% B gacha, 0,1 daqiqada 20% B dan 85% B gacha va 8,9 daqiqada 85% B ni tashkil etdi. Avtonamuna oluvchi 4 darajada ushlab turildi va har bir tahlil uchun har bir namunadan 4 mkl AOK qilindi. Quyidagi MS parametrlari qo'llanilgan: qobiq gaz oqimi tezligi, 40 AU; yordamchi gaz oqimi tezligi, 10 AU; gaz oqimi tezligi, 2 AU; yordamchi gaz isitgichining harorati, 350 daraja; purkash kuchlanishi, ijobiy rejim uchun 3,75 kV va salbiy rejim uchun 3,5 kV; kapillyar harorat, 375 daraja; va huni RF darajasi, 40%. Barcha namunalar polaritni almashtirish bilan to'liq MS tomonidan tahlil qilindi. Toʻliq MS skanerlari 65 dan 975 m/z gacha tezlikda 120,000 oʻlchamlari 1 × 106 iondan iborat avtomatik daromadni boshqarish maqsadi va 100 millisekundlik maksimal inyeksiya vaqti bilan olingan. Xom ma'lumotlar TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific) yordamida tahlil qilindi. Maqsadli metabolitlar aniq massa va saqlash vaqti bilan analitik standartlarga asoslangan afzal polariteda aniqlandi. Tepalikni aniqlashda ICIS algoritmi tekislash bilan 1 ishlatildi. Nisbiy miqdoriy aniqlash integratsiyalashgan tepalik maydoni yordamida amalga oshirildi va bu qiymatlar namunadagi umumiy miqdorga (umumiy tepalik maydoni sifatida belgilangan) tuzatildi. PPT1-CRISPR/Cas9 tahrirlash. A375P PPT{69}}maqsadli bo'lmagan va KO hujayralari yuqorida tavsiflanganidek tayyorlangan (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) Feng Zhang (Addgene plazmid, 48139) sovg‘asi edi. Qo'llanma RNK oligoslari (IDT) tavlangan, fosforlangan va keyin Addgene orqali mavjud bo'lgan Zhang laboratoriya protokollari bo'yicha BbsI hazm qilingan va fosforillangan pX459 plazmidiga bog'langan. Bog'langan plazmidlar Stbl3 hujayralariga (Invitrogen) aylantirildi. Plazmid preplarining ketma-ketligi kerakli hidoyat RNK ketma-ketliklarining mavjudligini tasdiqladi. A375P xujayralari Lipofektamin 3000 (Invitrogen, L3000015) yordamida transfektsiya qilindi, so'ngra puromisin tanlandi. Surveyor tahlillari PPT1 genini CRISPR/Cas9 tomonidan tahrirlanganligini tasdiqladi va PPT1ning nokdatu PPT1 antikori (Origene) bilan Western blotting tomonidan tasdiqlandi. Yo‘naltiruvchi RNK oligoslari uchun ketma-ketliklar quyidagilardan iborat: oldinga maqsadli bo‘lmagan qo‘llanma RNK (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), maqsadsiz yo‘naltiruvchi RNK teskari (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), inson PPT1 qo‘llanma RNK 1 oldinga (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), inson PPT1 teskari yo‘riqnomasi RNK RNK RNK teskari PTTCAGAGAG1 3 oldinga (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC) va inson PPT1 hidoyat RNK 3 teskari (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Ushbu maqolada foydalanilgan bitta hujayradan o'stirilgan klonlar quyidagilarni o'z ichiga oladi: C8 klon - inson uchun qo'llanma 1 va B5 klon - inson uchun qo'llanma 3. Immunoblotting. Bir million hujayra 10 sm idishga solingan va ertasi kuni muolajalar qilingan; hujayralar qirib tashlash orqali yig'ilgan. Butun hujayrali lizatlar SDS lizis buferi yordamida tayyorlangan. Protein konsentratsiyasi Pirs BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, 23225) yordamida o'lchandi. SDS-PAGE uchun 30-50 ug protein ishlatilgan va PVDF membranasiga o'tkazilgan (Bio-Rad, 1620177). Optimallashtirilgan sharoitlarga ko'ra, membrana 5% BSA yoki 5% yog'siz sut yordamida bloklandi va bir kechada 4 daraja haroratda asosiy antikor bilan inkubatsiya qilindi. PVDF membranalari 1× TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) bilan yuvildi va turga xos HRP-konjugatsiyalangan ikkilamchi antikor bilan xona haroratida 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Membranalar keyinchalik yuvildi va Pierce ECL Western Blotting substrati (Thermo Fisher Scientific, 32106) va avtoradiografiya filmlari (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318) yordamida ishlab chiqildi. Piroptoz tadqiqotlari uchun protein lizatlari SDS-PAGE tomonidan ajratilgan va PVDF membranalariga o'tkazilgan. 5% BSAda blokirovka qilingandan so'ng, PVDF membranalari ko'rsatilgan asosiy antikorlar bilan bir kechada 4 darajada inkubatsiya qilindi, PBS/Tweenda yuvildi va peroksidaza bilan bog'langan ikkilamchi antikorlar bilan inkubatsiya qilindi. Immunoreaktivlik HRP-konjugatsiyalangan ikkilamchi antikorlar (CalBioTech), kimilyuminesans substrati (Thermo Fisher Scientific) va ChemicDoc MP tasvirlash tizimi (Bio-Rad) yordamida aniqlandi. Supernatantni o'z ichiga olgan tajribalar uchun hujayralar SDS-PAGE ning buzilishini oldini olish uchun FBSsiz muhitda o'stirildi. Hujayra supernatantlari yig'ildi va hujayra qoldiqlarini olib tashlash uchun 4 darajada 500 g da 10 daqiqa davomida santrifüj qilindi. Olingan supernatantlar Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) yordamida 4 gradusda 4500 g 30 daqiqa davomida santrifüjlash orqali 10 marta konsentratsiya qilindi. Konsentratlar namuna buferi bilan aralashtirildi va yuqorida aytib o'tilganidek, Western blot orqali tahlil qilindi. Proteinli jelni bo'yash Ponso qizil bo'yash yordamida amalga oshirildi. LMP va katepsin L faolligini tahlil qilish. Inson pEGFP-hGal3 plazmidi Tamotsu Yoshimori (Addgene plazmid, 73080) sovg'asi bo'lib, A375P-Galectin-3 liniyasini yaratish uchun ishlatilgan. pEGFP-C1 nazorat plazmid vektor magistral sotib olindi (novo prolabs, V012024). Plazmidlar ishlab chiqaruvchining protokoli bo'yicha Lipofektamin 2000 (Invitrogen, 11668019) yordamida A375P hujayralariga transfektsiya qilindi (1 ug/ml); transfektsion hujayralar G418 (Gibco, 10131035) yordamida barqaror tanlangan. LMP uchun bir nechta tasvir maydonlarida jami 25 ta A375P-galektin-3 punkta-musbat hujayralar hisoblangan. Punkta-musbat hujayralar foizi har bir sohada alohida hisoblab chiqilgan va har bir guruh uchun o'rtacha foiz hisoblangan. Magic Red Cathepsin L tahlil to'plami (Abcam, ab270774) ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq ishlatilgan. Hujayralar Zeiss Axio Observer 7 teskari mikroskop ostida tasvirlangan. Magic Red xom integratsiya intensivligi Fiji - ImageJ dasturi (NIH) yordamida hisoblangan. MTT (3-[4, 5-dimetiltiazol-2-il]-2, 5 difenil tetrazolium bromid) hujayra hayotiyligi tahlili. 2000 ta hujayralar 96-quduq plitasining har bir qudug'iga uch nusxada qo'yildi va ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq, hujayra hayotiyligi to'plami (Roche, 11465007001) yordamida 3-kunlik MTT tahlillari o'tkazildi. Inhibitorni oldindan davolash 1 soat davomida o'tkazildi, so'ngra DC661 bilan yoki bo'lmagan inhibitorlar bilan hujayralarni birgalikda davolash. IC50 ni hisoblash uchun chiziqli bo'lmagan regressiya (egri chiziq) usuli ishlatilgan.

cistanche tubulosa - immunitet tizimini yaxshilaydi

Cistanche Enhance Immunity mahsulotlarini ko'rish uchun shu yerni bosing

【Batafsil ma'lumot so'rang】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Koloniyaning shakllanishi tahlili. Har bir quduqqa 2,000 hujayra 6-quduq plastinkasiga ekilgan va ertasi kuni ishlov berilgan; hujayralar jami 8 kun davomida davolash ostida qoldi. Har bir quduqda hosil bo'lgan koloniyalar PBS bilan yuvilib, sovuq metanol bilan -2{6}} darajada 20 daqiqa davomida mahkamlangan va Crystal violet 0,5% suvli eritmasi (V5265; MilliporeSigma) bilan bo'yalgan.

Tripan ko'k bo'yoqni istisno qilish tahlili. Tripan koʻk tahlili uchun reaksiya aralashmasi 0,4% Tripan koʻk (25- 900-CI, Corning) ning 1 qismi va suyultirilgan hujayra namunalarining 1 qismini aralashtirish orqali tayyorlangan. Aralash 1 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va hujayralar Cellometer Vision (Nexcelom, Vision -310-0208) da hisoblandi.

8-rasm. DC661-induktsiyali kalretikulin sirt ifodasi T hujayralarini o'simta hujayralariga qarshi boshlaydi. (A)

9-rasm. DC{1}}davolangan hujayralarni emlash muayyan kontekstlarda o'simtani rad etishga olib keladi. (A)

KO'PIK-LPO. LLP floresan zond, FOAMLPO yordamida o'rganildi. FOAM-LPO ilgari tasvirlanganidek sintez qilingan (26). Hujayralar 8-quduqli mSlide (o'sha yerda, 80807)da ekilgan va DC661 bilan yoki bo'lmagan inhibitorlar bilan ishlov berilgan. Hujayralar 5% CO2 va 95% havo atmosferasida FOAM-LPO (1 M) o'z ichiga olgan muhit bilan 37 daraja haroratda 5 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Hujayralar ikki marta ommaviy axborot vositalari bilan yuvildi, keyin hujayralar mikroskop ostida (Zeiss Axio Observer 7 teskari mikroskop) LLP ga javoban 586 dan 512 nm gacha bo'lgan floresansni aniqlash uchun kuzatildi. qRT-PCR va primerlar. A375P (3 × 105) hujayralari 60 mm idishlarda ekilgan va 24 soat davomida DMSO yoki DC661 (3 mkM) bilan ishlov berilgan. Jami RNK ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq RNK izolyatsiyasi to'plami (QIAGEN, 74134) bilan ajratilgan. cDNK ishlab chiqaruvchining protokoliga (Thermo Scientific, K1642) muvofiq 500 ng tozalangan RNKga ega iScript teskari transkriptaza to'plami yordamida sintez qilindi. qPCR reaktsiyasi 1 mL cDNK o'z ichiga olgan SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) yordamida o'rnatildi. Barcha o'lchovlar uch nusxada amalga oshirildi va BACTIN DCT hisob-kitoblari uchun ichki standart sifatida ishlatilgan. Gen ekspressiyasi tahlili quyidagi primerlar yordamida amalga oshirildi: PTGS2/COX-2 oldinga (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 teskari (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS oldinga (CTGGACTCCAGCAACACCA), CARS teskari (GGACGACGACGACAG1), (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 teskari (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN oldinga (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) va BACTIN teskari (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).

siRNK transfeksiyasi. Inson ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 va MFSD12 uchun genetik nokdaun tadqiqotlari A375P hujayra liniyalarida o'tkazildi. Sichqoncha Ppt1 va Kalretikulin uchun genetik inhibisyon tadqiqotlari MC38 hujayralarida o'tkazildi. Maqsadsiz siRNK (sc{{10}}), inson ULK1 (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), sichqoncha Ppt1/Cln1 (sc-142398) va Kalretikulin /Calregulin (sc-29895) siRNKlar Santa Cruz Biotechnology kompaniyasidan sotib olingan. Ushbu siRNKlar 3-5 maqsadli maxsus siRNKlar to'plamidan iborat. Oqim sitometriyasi. Ferroptoz induksiyasi C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861) yordamida o'lchandi. A375P xujayralari 6-quduq plastinkasiga ekilgan va DMSO, ferrostatin{{4{177}}}} (10 mkM), labda rokstatin-1 (2 mkM), elastin (5 mkM) bilan ishlov berilgan. ), DC661 (3 mkM) yoki 24 soat davomida kombinatsiya. Hujayralar 300 g da 5 daqiqa davomida santrifüj qilish orqali yig'ib olindi. Hujayralar 1 mkM C11-BODIPY o'z ichiga olgan 500 mkl 1X HBSS (Corning, 21-023-CV) da qayta suspenziya qilindi va 37 daraja haroratda 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Hujayralar pelletlangan va 500 mkL 1X HBSS da qayta suspenziya qilingan va floresans intensivligi BD LSRII sitometrida 530/30 Blue (Pensilvaniya universiteti Flow Core Facility) yordamida o'lchangan. Immunogen hujayra o'limi uchun kalretikulinning hujayra yuzasi ifodasini miqdori, oqim sitometriyasi orqali ilgari tasvirlanganidek (45) amalga oshirildi. B16F10 yoki MC38 hujayralari ekilgan va 24 soat davomida NAC (10 mM) yoki DC661 (3 mM) bilan ishlov berilgan. MC38 hujayralari 24 soat davomida 10 mM NAC mavjudligi yoki yo'qligida 48 soat davomida siPpt1 yoki siNT bilan ishlov berildi. Hujayralar CALR antikori (Cell Signaling Technology, 12238), Alexa Fluor 647 echkiga qarshi quyonga qarshi ikkinchi antikor (Invitrogen) va propidium yodid (PI) (Biolegend, 421301) bilan bo'yalgan. Bo'yalgan namunalar PI va CALR floresansini olish uchun mos ravishda 710/50 Blue va 670/30 Red yordamida BD LSRII oqim sitometrida olingan (Pensilvaniya universiteti Flow Core ob'ekti) va tahlil CALR-musbat va PI-manfiy hujayralar bilan cheklangan. noto'g'ri ijobiy hodisalardan qochish uchun. T-hujayrasini tayyorlash va foiz sitotoksikligi. B16 yoki MC38 o'simta hujayralari (5 × 104) o'stirildi va 24 soat davomida mos ravishda NAC (10 mM) yoki DC661 (1 mkM yoki 3 mM) bilan davolandi. Calr genetik inhibisyonu uchun MC38 hujayralari Calr siRNA yoki maqsadsiz siRNA (siNT) bilan 48 soat davomida, so'ngra 24 soat davomida DMSO yoki 3 mkM DC661 bilan davolash qilindi. Keyin splenotsitlar DC661 bilan B16 yoki MC38 xujayralari bilan yoki ularsiz IL-2 (5 IU/ml) ishtirokida ekilgan va 72 soat davomida kokulturatsiya qilingan. Astarlanish supernatantning IFN-ELISA (Biolegend, 430815) tomonidan tasdiqlangan. Keyin astarlangan splenotsitlar B16 va MC38 hujayralari uchun mos ravishda 1:20 va 1:50 bo'lgan maqsad-effektor (B16 yoki MC38 dan splenotsitlarga) nisbati bo'lgan yangi ekilgan B16 yoki MC38 hujayralari bilan kokulturatsiya qilindi. B16 yoki MC38 hujayralarining o'limi bilan bog'liq bo'lgan LDH chiqishi va keyin foiz sitotoksikligi ishlab chiqaruvchining protokoliga (MilliporeSigma, 4744926001) (31) muvofiq o'lchandi. O'rnatilgan saraton modellari bilan o'smaga qarshi emlash tahlillari va kimyoterapiya tadqiqotlari. Olti-sakkiz haftalik ayol WT C57BL/6 sichqonlari, NOD/SCID va BALB/c sichqonlari Jekson laboratoriyasidan olingan. Antitumorli emlash tajribalari uchun WT B16F10, MC38 va CT26 hujayralari 175 sm2 flakonlarda 36 soat davomida DC661 (3 mkM) bilan ishlov berildi. Keyin supernatantlar va ajratilgan hujayralar 50 ml lochin naychasida to'plangan. Hujayralar santrifüj qilindi va muzli PBS bilan yuvildi. Emlash uchun immunokompetent C57BL/6 sichqonlari, immunitet tanqisligi bo'lgan NOD/SCID sichqonlarining (1,8 × 104 B16F10 hujayralari, 1,5 × 106 MC38 hujayralar) yoki singenik sichqonlarning chap qanotiga 150 mkL hujayra suspenziyasi yuborildi. × sichqoncha uchun 106 CT26 hujayra). PBSda qayta suspenziyalangan muzlatilgan eritilgan hujayralar salbiy nazorat sifatida AOK qilingan. Bir hafta o'tgach, bir xil turdagi jonli saraton hujayralari (3 × 104 B16F10 hujayralar, 2 × 105 MC38 hujayralar yoki sichqoncha uchun 5 × 105 CT26 hujayralar) Matrigel (Corning, 354248) teng hajmdagi o'ng qanotga AOK qilindi. emlangan sichqonlar. O'smalar elektron kalibrlar yordamida o'lchandi va hajm L × W2 × 0,5 sifatida hisoblandi. Keyingi kunlarda o'smalarning o'sishi muntazam ravishda kuzatildi va o'smalarning yo'qligi samarali antitumor emlashning ko'rsatkichi sifatida qabul qilindi. DC661-MC38 emlash bo‘yicha tadqiqotlar NOD/SCID sichqonlarida takrorlandi. Statistika. Statistik ahamiyatlilik ikki guruhni solishtirganda Studentning juftlashtirilmagan, 2-quyruqli t-testi yordamida aniqlandi. 1-Usul ANOVA testi 2 dan ortiq guruhlar solishtirilganda ishlatilgan. Agar P qiymati 0,05 dan kam bo'lsa, nol gipoteza sezilarli darajada rad etildi. Ma'lumotlar o'rtacha ± SEM sifatida ko'rsatilgan. O'qishni tasdiqlash. Hayvonlar ustida o'tkazilgan barcha tajribalar Pensilvaniya Universitetining Hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish institutsional qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan protokollarga muvofiq amalga oshirildi.

Xitoy o'ti cistanche o'simligi - Antitumor

Ma'lumotnomalar

1. Zeh HJ va boshqalar. Oshqozon osti bezi saratoni bilan og'rigan bemorlarda yuqori dozali gidroksiklorokin va gemsitabin / Nab-paklitaksel bilan avtofagiyani inhibe qilishning operatsiyadan oldingi randomize bosqichi II. Clin Cancer Res. 2020;26(13):3126–3134.

2. Rebecca VW va boshqalar. PPT1 o'simta o'sishiga yordam beradi va saraton kasalligida xlorokin hosilalarining molekulyar maqsadi hisoblanadi. Saraton Discov. 2019;9(2):220–229.

3. Brun S va boshqalar. GNS561, gepatotsellyulyar karsinomada saraton ildiz hujayralariga va yo'g'on ichak saratonining jigar metastaziga qarshi faol yangi autofagiya inhibitori. J Saraton. 2021;12(18):5432–5438.

4. Brun S va boshqalar. GNS561, klinik bosqichli PPT1 inhibitori, lizosomal funktsiyalarni modulyatsiya qilish orqali gepatotsellyulyar karsinomaga qarshi samarali. Avtofagiya. 2022;18(3):678–694.

5. Oberle C va boshqalar. Lizosomal membrananing o'tkazuvchanligi va katepsinning ajralib chiqishi Bax/Bakga bog'liq bo'lib, fibroblastlar va monositlarda apoptozni kuchaytiruvchi hodisadir. Hujayra o'limi farq qiladi. 2010;17(7):1167–1178.

6. Boya P, Kroemer G. Hujayra o'limida lizosomal membrananing o'tkazuvchanligi. Onkogen. 2008;27(50):6434–6451.

7. Rebecca VW, va boshqalar. Lizosomaning degradativ va o'sish signalizatsiya rollarini nishonga olish uchun yagona yondashuv. Saraton Discov. 2017;7(11):1266–1283.

8. Tang R va boshqalar. Antikanser immunitetida ferroptoz, nekroptoz va piroptoz. J Gematol Onkol. 2020;13(1):110.

9. Yamamoto K va boshqalar. Otofagiya MHCI ni pasaytirish orqali oshqozon osti bezi saratonidan immunitetdan qochishga yordam beradi. Tabiat. 2020;581(7806):100–105.

10. Deng J va boshqalar. ULK1 inhibisyonu buzilgan antigen taqdimotini yengib chiqadi va LKB1 mutant o'pka saratonida antitumor immunitetni tiklaydi. Nat saraton. 2021;2(5):503–514.

11. Lazarou M va boshqalar. Ubiquitin kinaz PINK1 mitofagiyani qo'zg'atish uchun otofagiya retseptorlarini jalb qiladi. Tabiat. 2015;524(7565):309–314.

12. Choi YB va boshqalar. TAX1BP1 mitoxondrial adapter MAVS ning qichishish vositasida degradatsiyasini osonlashtirish orqali virus keltirib chiqaradigan apoptozni ushlab turadi. Mol hujayra Biol. 2017;37(1):e00422-16.

13. Rikka S va boshqalar. Bnip3 mitoxondrial bioenergetikani buzadi va mitoxondriyal aylanishni rag'batlantiradi. Hujayra o'limi farq qiladi. 2011;18(4):721–731.

14. Leu JI va boshqalar. p53 ning Afrika-markazli S47 variantini ifodalovchi hujayralardagi buzilgan ferroptoz uchun mexanik asos. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.

15. Erkes DA va boshqalar. Mutant BRAF va MEK ingibitorlari piroptoz orqali o'smaning immun mikro muhitini tartibga soladi. Saraton Discov. 2020;10(2):254–269.

16. Serrano-Puebla A, Boya P. Hujayra o'limida lizosomal membrana o'tkazuvchanligi: salomatlik va kasallik uchun yangi dalillar va ta'sirlar. Ann NY akad Sci. 2016;1371(1):30–44.

17. Thirusangu P va boshqalar. Tuxumdon saratonida xinakrin tomonidan qo'zg'atilgan autofagiya katepsin-L vositachiligida lizosomal/mitoxondriyal membrana o'tkazuvchanligi va hujayra o'limiga olib keladi. Saraton (Bazel). 2021;13(9):2004.

18. Mishallet MC va boshqalar. T-limfotsitlarning supraoptimal faollashuvi bilan qo'zg'atilgan katepsinga bog'liq apoptoz: yuqori dozaga chidamlilikning mumkin bo'lgan mexanizmi. J Immunol. 2004;172(9):5405–5414.

19. Mondal A va boshqalar. Ppt1-etishmovchiligi lizosomal Ca++ gomeostazini buzadi, bu esa CLN1 kasalligining sichqon modelida patogenezga yordam beradi. J Inherit Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM va boshqalar. Fosfolipazalar va reaktiv kislorod turlari sog'lom va kasal odamlar va hayvonlarda lipid biomarkerlarini keltirib chiqaradi - lizofosfatidilxolinga e'tibor. Old fiziol. 2021;12:732319.

21. Fu R va boshqalar. Niemann-Pick kasalligi, C1 tipidagi sichqon modellarini fenotipik bostirishda N-asetilsisteinning samaradorligi. Hum Mol Genet. 2013;22(17):3508–3523.

22. Boz Z va boshqalar. N-asetilsistein mHypoA-59 gipotalamus neyronlarida olanzapin keltirib chiqaradigan oksidlovchi stressni oldini oladi. Sci Rep. 2020;10(1):19185.

23. Khare S va boshqalar. ASS1 va ASL o'zgargan azot almashinuvi orqali aniq hujayrali buyrak hujayrali karsinomaning o'sishini bostiradi. Saraton Metab. 2021;9(1):40.

24. Gęgotek A va boshqalar. Askorbin kislotaning oksidlanish-qaytarilish va endokannabinoid tizimlarining o'zaro ta'sirida ultrabinafsha nurlanishi va vodorod peroksid ta'siriga duchor bo'lgan in vitro madaniyatli inson teri fibroblastlarining himoya ta'sirini taqqoslash. Arch Dermatol Res. 2017;309(4):285–303.

25. De Raedt T va boshqalar. Rasga asoslangan o'smalar uchun kombinatsiyalangan terapiyani ishlab chiqish uchun saraton hujayralarining zaifliklaridan foydalanish. Saraton hujayrasi. 2011;20(3):400–413.

26. Chjan X va boshqalar. Lizosoma-maqsadli va nisbatimetrik prob yordamida ko'pik hujayralari ichida lipid peroksidatsiyasini kuzatish. Anal kimyo. 2015;87(16):8292–8300.

27. Wei CY va boshqalar. Bioinformatikaga asoslangan tahlil MFSD12 ning hujayra proliferatsiyasining asosiy targ'ibotchisi va melanomada potentsial terapevtik maqsad sifatida yuqori ekanligini ko'rsatadi. Onkogen. 2019;38(11):1876–1891.

28. Aldini G va boshqalar. N-asetilsistein antioksidant va disulfidni buzuvchi vosita sifatida: sabablari. Erkin Radic Res. 2018;52(7):751–762. 29. Abu-Remaileh M va boshqalar. Lizosomal metabolomikalar lizosomalardan aminokislotalar oqimining V-ATPase va mTORga bog'liq regulyatsiyasini ochib beradi. Fan. 2017;358(6364):807–813.

30. Chjou J va boshqalar. Saraton terapiyasida immunogen hujayralar o'limi: hozirgi va paydo bo'lgan induktorlar. J Cell Mol Med. 2019;23(8):4854–4865. 31. Sharma G va boshqalar. PPT1 inhibisyonu melanomada anti-PD-1 antikorining antitumor faolligini oshiradi. JCI Insight. 2020;5(17):e133225.

32. Mehnert JM va boshqalar. BAMM (melanomada BRAF autofagiyasi va MEK inhibisyonu): rivojlangan BRAFV600-mutant melanomasida dabrafenib, trametinib va ​​gidroksiklorokinning I/II fazasi sinovi. Clin Cancer Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Loi M va boshqalar. Makroautofagiya oqsillari dendritik hujayralardagi MHC I sinf darajasini nazorat qiladi va virusga qarshi CD8 (+) T hujayralari javoblarini shakllantiradi. Hujayra vakili 2016;15(5):1076–1087.

34. Jouandin P va boshqalar. Lizosomal sisteinning mobilizatsiyasi TORC1 va to'qimalarning o'sishining ro'za tutishga javobini shakllantiradi. Fan. 2022;375(6582):eabc4203.

35. Shvalfenberg G.K. N-asetilsistein: klinik foydani ko'rib chiqish (yangi fokuslar bilan eski dori). J Nutr Metab. 2021;2021:9949453.

36. Beer LA va boshqalar. Ektopik homiladorlik sarum biomarkerlarini 3-D protein profilini aniqlash va yorliqsiz miqdorni aniqlash yordamida tizimli ravishda kashf qilish. J Proteome Res. 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR va boshqalar. ARID1A mutatsiyaga uchragan tuxumdonning shaffof hujayrali karsinomasining proteomasiga asosiy ta'sir post-transkripsiya darajasida mevalonat yo'lining pastga regulyatsiyasi hisoblanadi. Mol hujayra proteomikasi. 2016;15(11):3348–3360.

38. Cox J, Mann M. MaxQuant yuqori peptid identifikatsiya stavkalari, individuallashtirilgan ppb diapazoni massasi aniqligi va proteom bo'ylab oqsil miqdorini aniqlash imkonini beradi. Nat Biotexnol. 2008;26(12):1367–1372.

39. Cox J va boshqalar. Andromeda: MaxQuant muhitiga integratsiyalangan peptid qidiruvi. J Proteome Res. 2011;10(4):1794–1805.

40. Cox J va boshqalar. Kechiktirilgan normalizatsiya va MaxLFQ deb ataladigan maksimal peptid nisbati ekstraktsiyasi orqali proteom bo'ylab yorliqsiz aniq miqdorni aniqlash. Mol hujayra proteomikasi. 2014;13(9):2513–2526.

41. Tyanova S va boshqalar. (prote)omika ma'lumotlarini har tomonlama tahlil qilish uchun Perseus hisoblash platformasi. Nat usullari. 2016;13(9):731–740.

42. Tyanova S, Koks J. Perseus: saraton tadqiqotlarida proteomik ma'lumotlarni integratsiyalashgan tahlil qilish uchun bioinformatika platformasi. Usullari Mol Biol. 2018;1711:133–148.

43. Alicea GM va boshqalar. Keksa fibroblast lipid metabolizmidagi o'zgarishlar yog' kislotasi tashuvchisi FATP2 orqali maqsadli terapiyaga yoshga bog'liq melanoma hujayralarining qarshiligini keltirib chiqaradi. Saraton Discov. 2020;10(9):1282–1295.

44. Ran FA va boshqalar. CRISPR-Cas9 tizimidan foydalangan holda genom muhandisligi. Nat Protoc. 2013;8(11):2281–2308.

45. Liu P va boshqalar. Immunogen hujayralar o'limi bilan bog'liq kalretikulin ta'sirining miqdori. Usullari Enzimol. 2020;632:1–13.