Ketoglutarat qo'shimchasining turli energiya holatlarida C2C12 miyoblastlariga ta'siri uchun NMR asosidagi metabolomik tahlil

Cistanche qarishga qarshi va charchoqni yo'qotuvchi qo'shimchalarni olish uchun shu yerni bosing

1.Kirish

Skelet mushaklari inson tanasidagi eng katta organ bo'lib, normal hayot faoliyatini ta'minlaydi.Uzoq muddatli mashg'ulotlaryoki patologiyal kasalliklar jarayonlari mushaklarning shikastlanishiga olib keladiyokimushaklarning energiya ta'minoti etarli emas, bu vaqtda mushaklar kuchini va funktsiyasini tiklash ayniqsa muhimdir. Skelet mushaklari gipertrofiyasini rag'batlantirish va sport samaradorligini oshirish uchun turli xil ozuqaviy qo'shimchalar qo'llanilgan [1]. Organik uglerod va azot almashinuvining kesishishi va bir vaqtning o'zida TCA siklida muhim oraliq mahsulot sifatida -Ketoglutarat (AKG) klinik va hayvonlarda o'tkazilgan tajribalarda mushaklarning ishlashini yaxshilash uchun pleiotrop ta'sir ko'rsatdi [2-9]. Misol uchun, AKG ichak shilliq qavatining shikastlanishini [8] va yallig'lanishni [9] kamaytiradi, shishishni susaytiradi.kolorektal saraton rivojlanishi[4] va jigar fibrozisi [5], o'sishni rag'batlantiradi [6] va kasallanishni kamaytiradi vaqarishni kechiktirish[7]. Oldingi ishlar shuni ko'rsatdiki, AKG qo'shimchasi to'liq kestirib almashtirilgan bemorlarning travma modelida parenteral yuborish orqali mushaklarning yo'qolishini engillashtirishi va Akt / mTOR signalizatsiya yo'llari orqali mushaklarning gipertrofiyasi va oqsil sintezini rag'batlantirishi mumkin [10,11]. Duchenne mushak distrofiyasi holatida AKG qo'shimchasi mushak atrofiyasi va disfunktsiyasini PHD3/ADRB{5}}vositachilik yo'li orqali oldini oladi [12]. Bizning oldingi ishimiz shuni ko'rsatdiki, AKG qo'shimchasi C2C12 miyoblastlarining ko'payishini sezilarli darajada osonlashtirishi va glyukozasiz muhitda yetishtirilgan C2C12 miyotublarining atrofiyasini engillashtirishi mumkin [13]. Glyukoza skelet mushaklarining normal fiziologik funktsiyalarini ta'minlash uchun asosiy energiya manbai ekanligini hisobga olsak, AKG qo'shimchasining mushaklar faoliyatini yaxshilashga ta'siri skelet mushaklaridagi glyukoza darajasiga juda bog'liq. Skelet mushaklaridagi AKG ta'sirining turli energiya holatlari o'rtasidagi farqlari aniq emas.

AKG aminokislotalar, vitaminlar va sintezida ishtirok etadiorganik kislotalarvaenergiya almashinuviorganizmda, bu glutamat dehidrogenaza ta'sirida AKG ni glutamatga aylantirish va keyinchalik glutamin sintetaza bilan ammiak bilan glutamatning amidlanishini o'z ichiga oladi. AKG hujayra o'sishi uchun energiyani TCA sikli va oksidlovchi fosforillanish orqali ta'minlaydi va hujayra membranasidagi OXGR (G protein bilan bog'langan retseptor) retseptorlari bilan o'zaro ta'sir qilish orqali hujayra metabolizmi va signalizatsiyasini rag'batlantiradi [14,15]. Bundan tashqari, AKG mitoxondriyal oksidlovchi metabolizmni tartibga solishi va erta embrion hujayra holatiga o'tish va jinsiy hujayra rivojlanishiga vositachilik qilib, ruxsat etilgan epigenetik holatni rag'batlantirishi mumkin [16]. Bundan tashqari, jismoniy mashqlar natijasida kelib chiqqan AKG buyrak usti bezlaridagi OXGR1 retseptorini yog 'to'qimalarida termogenez va triglitseridlarning parchalanishini nazorat qilish va metabolizmga foydali ta'sir ko'rsatish uchun rag'batlantirishi mumkin [17].

Biroq, turli energiya holatlarida va asosiy metabolik mexanizmlarda skelet mushaklarining AKG sabab bo'lgan metabolik o'zgarishlarini aniqlash uchun bir nechta tadqiqotlar o'tkazildi. So'nggi paytlarda metabolomik tahlil ozuqaviy qo'shimchalarning foydali ta'siri ostida yotgan molekulyar mexanizmlarni muntazam ravishda aniqlash uchun qo'llanildi. Gen transkripsiyasining quyi oqimi mahsuloti sifatida harakat qiluvchi metabolitlarning almashinuvi umumiy metabolik o'zgarishlarni intuitiv ravishda aks ettirishi mumkin. Biosuyuqliklar, to'qimalar va hujayralardagi metabolitlar darajasidagi o'zgarishlarni miqdoriy aniqlash uchun ayniqsa mos usullar sifatida yuqori aniqlikdagi 1H yadro magnit-rezonans (NMR) spektroskopiyasi metabolomik tahlillarda keng qo'llaniladi. Shunisi e'tiborga loyiqki, NMR-ga asoslangan metabolomik profillash yuqori takrorlanuvchanlik, zararsiz miqdoriy o'lchash va qulay namuna tayyorlash kabi bir qator afzalliklarga ega. Ilgari biz kreatin qo'shimchasining C2C12 miyoblastlariga [20] ta'sirini va alanil-glutamin qo'shimchasining energiya etishmasligidan shikastlangan miyoblastlarga ta'sirini aniqlash uchun NMR asosidagi metabolomik tahlillarni o'tkazdik [21].

2. Natijalar

2.1. AKG qo'shimchasi bilan C2C12 miyoblastlarining ko'payishi va differentsiatsiyasi

Oddiy o'sish muhitida AKG qo'shimchasi bo'lgan va bo'lmagan C2C12 miyoblast hujayralari Nor-A va Nor sifatida guruhlangan, AKG qo'shimchasi bo'lgan yoki bo'lmagan past glyukoza o'sish muhitidagilar esa Past-A va Past deb guruhlangan. Oldingi tadqiqot [10] chodiridan kelib chiqqan holda, 2 mm konsentratsiyada AKG qo'shimchasi bo'lgan Nor-A hujayralari Nor hujayralariga nisbatan sezilarli darajada yaxshilangan hujayra hayotiyligini namoyish etdi (S1-rasm).

Shuning uchun, 2 mm AKG konsentratsiyasi miyoblastlarning ko'payishi va differentsiatsiyasida AKG sabab bo'lgan o'zgarishlarni baholash uchun eksperimentlarda ishlatilgan. Nor hujayralari bilan solishtirganda, past hujayralar energiya tanqisligi tufayli ko'payish tezligining keskin pasayishini ko'rsatdi (1A-rasm). Garchi AKG qo'shimchasi ikki energiya holatida miyoblastlarning morfologiyasini sezilarli darajada farq qilmasa ham, u nafaqat past glyukozali muhitda o'stirilgan past hujayralarning ko'payish tezligini oshiribgina qolmay, balki normal muhitda o'stirilgan Nor hujayralarining ko'payishini ham kuchaytirdi. oldingi tadqiqotlar [10,12]. To'rtta mioblastlar guruhi (guruh uchun n=4) uchun ma'lum hududdagi hujayralar soni hisoblangan: Nor, 563,8 ± 10,4; Nor-A, 624,0 ± 10,8; Past, 493,8 ± 14,5; Past A, 547,0 ± 11,7 (1B-rasm). Shuni ta'kidlash kerakki, Low-A hujayralari Nor hujayralaridan statistik jihatdan farq qiladigan hujayra raqamlarini ko'rsatmadi, bu AKG qo'shimchasi past glyukoza madaniyati sharoitida miyoblastlar uchun hujayra sonlarini tiklashi mumkinligini ko'rsatadi (1B-rasm).

1-rasm, Oddiy madaniyat va past sharoitlarda C2C12 miyoblastlarining proliferatsiya va differentsiatsiya qobiliyatlari. glyukoza madaniyati. A) Mioblastlar morfologiyasi. (B) A paneliga mos keladigan katak raqamlari (n=4). (C) MTS hujayra proliferatsiyasi tahlili (n=5) bilan tahlil qilingan Nor hujayralariga nisbatan hujayra hayotiyligi. (D) Western blot tomonidan tahlil qilingan miyoblastlardagi MyoD1 ifodalari. Anti-GAPDH antikori har bir chiziqdagi protein miqdorini standartlashtirish uchun ishlatilgan. (E) Panellarga mos keladigan statistik tahlil (D) (n=4). * p < 0.{{10}}5,** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.

Bundan tashqari, MTS tahlili hujayralarning to'rtta guruhining ko'payish tezligini miqdoriy jihatdan solishtirish uchun amalga oshirildi (1C-rasm). Past hujayralar Nor hujayralari bilan solishtirganda ko'payish tezligini sezilarli darajada kamaytirdi, bu past glyukozali muhit hujayralar proliferatsiyasiga salbiy ta'sir ko'rsatishini ko'rsatdi. Shunisi e'tiborga loyiqki, AKG qo'shimchasi Nor-A va Past-A hujayralarining Nor va Past hujayralariga nisbatan ko'payish tezligini oshirdi. E'tibor bering, past-A hujayralari Nor hujayralariga qaraganda pastroq ko'payish qobiliyatini ko'rsatdi, bu AKG qo'shimchasi past glyukozali muhitda yetishtirilgan hujayralarning ko'payishini faqat qisman tiklaganligini anglatadi.

.Miogen differentsiatsiya 1 (MyoD1) oqsilining ifodasi odatda hujayralarning differentsiatsiya qobiliyatini tavsiflash uchun ishlatiladi. Shunday qilib, biz to'rtta hujayralar guruhi o'rtasida MyoD1 ifodalarini miqdoriy jihatdan solishtirdik (1D-rasm). Past hujayralar Nor hujayralari bilan solishtirganda sezilarli darajada pasaygan differentsiatsiya qobiliyatini ko'rsatdi. Shunisi e'tiborga loyiqki, AKG qo'shimchasi normal muhitda ham, past glyukozali muhitda ham o'stirilgan hujayralarning differentsiatsiya qobiliyatini oshirdi, bu Nor-A va Past-A hujayralarida MyoD1 ekspressiyasining taxminan 30 foizga oshishi bilan ko'rsatilgan. Shunisi e'tiborga loyiqki, Low-A hujayralari Nor hujayralaridan statistik jihatdan sezilarli darajada farq qiladigan MyoD1 ifodasini ko'rsatmadi, bu kam glyukozali muhitda yetishtirilgan hujayralarning differentsiatsiya qobiliyatini tiklash uchun AKG qo'shimchasining yuqori samaradorligini anglatadi.

Bundan tashqari, biz C2C12 miyoblastlarining to'rtta guruhi uchun miyotube farqlash qobiliyatini tahlil qildik. Miyotublar normal va past glyukozali differentsiatsiya muhitida AKG qo'shilgan yoki qo'shilmagan holda yetishtirilgan mioblastlarning birlashishi natijasida hosil bo'lgan. C2C12 miyotublarining morfologiyasi shuni ko'rsatdiki, past glyukozali madaniyat hujayralarning miyotubik farqlash qobiliyatini buzgan va AKG qo'shimchasi oddiy muhitda ham, glyukozali muhitda ham yetishtirilgan miyoblastlarning miyotubik farqlanishiga yordam berishi mumkin.

2.2. C2C12 miyoblastlarining suvli ekstraktlarining NMR spektrlari

Odatda 850 MGts 1H NMR spektrlari C2C12 mioblastlarining Nor, Nor-A, Past va Past-A guruhlaridan olingan suvli ekstraktlarda qayd etilgan (2A-rasm). Jami 34 ta metabolit tayinlangan va S1-jadvalda umumlashtirilgan. Metabolitlarning rezonans tayinlanishi 2D 1H-13C HSOC va 1H-H TOCSY spektrlari (S4 va S5-rasmlar) yordamida tasdiqlangan. NMR spektrlarining vizual tekshiruvi shuni ko'rsatdiki, miyoblastlarni AKG qo'shimchasi bilan etishtirish Nor-A va Low-A hujayralarida hujayra ichidagi AKG ning sezilarli to'planishiga olib keldi (2B-rasm).

2-rasm, C2C12 miyoblastlarining Nor, Nor-A, Past va Past-A guruhlaridan olingan suvli ekstraktlarda qayd etilgan o'rtacha 850 MHz lH yadro magnit-rezonans (YMR) spektrlari. (A) To'rt guruhning o'rtacha NMR spektrlarini solishtirish. Vertikal shkalalar barcha lH NMR spektrlarida doimiy bo'lib qoldi. Suv hududi (4.7-5.2 ppm) olib tashlandi (B) a-Ketoglutarat (AKG) cho'qqilarining mahalliy kuchaytirilgan hududlari. Moviy/yashil/sariq/qizil chiziq: Nor/Nor-A/Low/Low-A guruhlari spektral hududlari. AKG, a-ketoglutarat; Kompyuter, O-fosfokolin; GPC, sn-glisero{15}}fosfokolinUDP-glyukoza, Uridin difosfat glyukoza: CTP, sn-glisero-3-fosfokolin; NAD plyus, nikotinamid adenin dinukleotid AXP adenin mono/di/trifosfat.

2.3. Uyali metabolik profillarni o'rganish uchun ko'p o'zgaruvchan ma'lumotlarni tahlil qilish

Bundan tashqari, biz C2C12 miyoblastlarining to'rtta guruhining metabolik profilini aniqlash uchun NMR spektr ma'lumotlari bo'yicha ko'p o'zgaruvchan ma'lumotlar tahlilini o'tkazdik. Guruhlash tendentsiyalarini ko'rib chiqish va miyoblastlar guruhlari o'rtasidagi metabolik farqlarni aniqlash uchun birinchi ikkita komponent (PC1, PC2) bilan uchta nazoratsiz PCA modelini yaratdik. ThePCA skorlari grafigi shuni ko'rsatadiki, past glyukozali muhitda o'stirilgan hujayralarning metabolik profili oddiy muhitda o'stirilgandan aniq farqlanadi (3A-rasm) va AKC qo'shilishi normal muhitda ham, ekilgan hujayralarning metabolik naqshlarini sezilarli darajada o'zgartirdi. past glyukozali muhitda (3B, C-rasm). Shu bilan birga, Nor-A va Nor guruhlari o'rtasidagi metabolik farq Past-A va Past guruhlarga qaraganda kattaroq edi, bu AKG qo'shimchasining miyoblastlarning metabolik profiliga ta'siri katta darajada hujayralarning energiya holatiga bog'liqligini anglatadi.

Shakl 3. "HNMR spektrlari" uchun ko'p o'lchovli tahlillar Nor, Nor-A, Past va Past-A guruhlari C2C12 miyoblastlaridan olingan suvli ekstraktlarda qayd etilgan. (AC) PCA past va Nor guruhlari, Past-A va Past guruhlar Nor-A va Nor guruhlari syujetlarini baholaydi; (DF) OPIS-DA ballari Past va Nor guruhlari (R2: 0.999, 02: 0.996), Past-A va Past guruhlar (R2: 0.918: 02: 0.761), Nor-A va Nor guruhlari (R2: 0.927: 02: 0.838). Ellipslar 95 foizlik ishonch chegarasini bildiradi.

Bundan tashqari, biz miyoblastlarning to'rtta guruhi o'rtasidagi metabolik ajralishlarni ko'rsatish uchun uchta nazorat ostidagi OPLS-DA modelini yaratdik (3D-F-rasm). Kutilganidek, OPLSDA modellari korrelyatsiya qilingan ortogonal o'zgaruvchilar ma'lumotlarini saqlash va korrelyatsiya qilinmagan ortogonal o'zgaruvchilar ma'lumotlarini filtrlash orqali to'rtta guruh o'rtasidagi metabolik farqlarni maksimal darajada oshirdi. Bundan tashqari, o'rnatilgan OPLS-DA modellarining haqiqiyligini ko'rsatadigan OPLS-DA modellarining ishonchliligini baholash uchun tasodifiy almashtirish testlarini (n=200) o'tkazdik (S6-rasm).

2.4. Differensial va muhim metabolitlarni aniqlash

C2C12 miyoblastlarining to'rtta guruhi o'rtasidagi metabolitlar darajasini miqdoriy jihatdan solishtirish uchun biz aniqlangan metabolitlarning nisbiy darajasini ularning nisbiy integrallari asosida hisoblab chiqdik (jadval S2). AKG qo'shilishi Nor-A va Past-A guruhlarida hujayra ichidagiAKG darajasini sezilarli darajada oshirdi, ammo Nor va Past guruhlardagilarni sezilarli darajada o'zgartirmadi. Differensial metabolitlarni p < 0.05 mezoni bilan aniqlash uchun Student t-testini o'tkazdik (4-rasm). Nor va Lowni taqqoslashda 29 ta differensial metabolit (4A-rasm), shu jumladan 18 ta yaxshilangan metabolit (leytsin, izolösin, valin, asetat, glutamat, glutamin, metionin, aspartat, lizin, kreatin, PC (O-fosfokolin) tirozin taurin, , fenilalanin, histidin, NAD plus, format, AXP) va 11 Metaboni rad etdi. litlar (glutation, piroglutamat, fosfokreatin, beta-alanin, GPC, glyukoza, glitsin, atsetat, treonin, GTP, UDP-glyukoza). Past-A va past aniqlangan differentsial metabolitlarni solishtirish (4B-rasm), shu jumladan 7 ta ko'paygan metabolit (etanol, AKGbeta-alanin, PC, taurin, glitsin va GTP) va 3 ta kamaygan metabolit (glutamin, lizin va miyoinositol). Nor-A va Norning solishtirilishi 18 ta differentsial metabolitni aniqladi (4C-rasm), shu jumladan 6 ta yuqori tartibga solinadigan metabolitlar (AKG, piroglutamat, glutamin, lizin, glyukoza, laktat) va 12 ta pastga regulyatsiya qilingan metabolitlar (alanin, asetat, glutai). metionin, fosfokreatin, PC, miyoinositol, glitsin, treonin, GTP, UDP-glyukoza va AXP).

Shakl 4. Differensial metabolitlarning nisbiy intensivligi C2C12 miyoblastlarining to'rtta guruhi o'rtasida juftlik bilan taqqoslash natijasida aniqlandi. (A) Past va Nor; (B) Past-A va past; (C) Nor-A va Nor. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.n { Har bir guruh uchun {13}}.

Bundan tashqari, biz OPLS-DA modellaridan VIP > 1 mezoni bilan muhim metabolitlarni aniqlash uchun foydalandik (5-rasm). Hammasi bo'lib, OPLS-DA modellaridan Nor-A va Nor, Nor va past, Low-A va past bo'lgan OPLS-DA modellaridan jami 12, 10 va 10 ta muhim metabolitlar aniqlangan.

Shakl 5. Muhim metabolitlarning VIP ko'rsatkichlari C2C12myoblastlarning to'rtta guruhi o'rtasida juftlik bilan taqqoslash natijasida aniqlandi. (A) Past va Nor; (B) Past-A va past; (C) Nor-A va Nor. Qizil/ko‘k shrift metabolit darajasining ko‘tarilgan/kamayganligini bildiradi.

Aniqlangan muhim metabolitlar va differentsial metabolitlarning kombinatsiyasi xarakterli metabolitlarni berdi (1-jadval). Past va Nor, Low-A va past va Nor-A va Norning juftlik taqqoslashlari mos ravishda 10, 6 va 10 ta xarakterli metabolitlarni aniqladi, bu AKG qo'shimchasining miyoblastlarga ta'siri energiya bilan chambarchas bog'liqligini ko'rsatadi. hujayralar holati.

2.5. Sezilarli darajada o'zgargan metabolizmni aniqlash

Yo'llar Biz C1C12 miyoblastlarining to'rtta guruhi o'rtasidagi juftlik taqqoslashlari natijasida aniqlangan metabolitlar darajasiga asoslanib, sezilarli darajada o'zgargan metabolik yo'llarni (muhim yo'llar) aniqlash uchun metabolik yo'l tahlilini o'tkazdik (S7-rasm; 2-jadval va S3-jadval). Nor va Lowning tahlili 11 ta muhim yo'lni aniqladi: (1) Alanin, aspartat va glutamat almashinuvi; (2) Glitsin, serin va treonin almashinuvi; (3) Glutation metabolizmi; (4) D-glutamin va D-glutamat almashinuvi; (5) Kraxmal va saxaroza almashinuvi; (6) beta-alanin almashinuvi; (7) Taurin va gipotaurin almashinuvi; (8) Fenilalanin almashinuvi; (9) Fenilalanin, tirozin va triptofan biosintezi; (10) Nikotinat va nikotinamid almashinuvi; (11) Histidin almashinuvi. Ushbu muhim yo'l energiya almashinuvi, oksidlovchi stress va TCA siklining anaplerotik oqimi bilan bog'liq edi.

Nor-A va Norning tahlili faqat birinchi beshta muhim yo'lni aniqladi 1-5, qolgan oltita yo'l 6-11 bundan mustasno. Boshqacha qilib aytganda, Low-A vs. Low tahlili faqat oltita muhim yo'lni aniqladi: birinchi to'rtta 1-4 yo'llar Low va Nor, Nor-A vs. Nor taqqoslashlari bilan bo'lingan; ikki yo'llari 6-7 solishtirish bilan o'rtoqlashdi Low va boshqalar Nor. E'tibor bering, AKG qo'shimchasi past glyukozali muhitda o'stirilgan hujayralardagi 5-yo'lni (kraxmal va saxaroza almashinuvini) sezilarli darajada o'zgartirmadi, lekin boshqa ikkita yo'lga (beta-alanin almashinuvi va taurin va gipotaurin metabolizmi) aralashdi. Xarakterli metabolitlarda AKG tomonidan qo'zg'atilgan o'zgarishlarni tasavvur qilish uchun biz ushbu metabolitlarni Kioto Genlar va Genomlar Ensiklopediyasi (KEGG) ma'lumotlar bazasiga asoslangan metabolik xaritaga prognoz qildik (6-rasm). KEGG metabolik tarmoqlarni rekonstruksiya qilish va muhim metabolik yo'llarni ajratib ko'rsatish uchun asosiy ma'lumotlar resurslaridan biri sifatida keng qo'llanilgan. O'zgartirilgan xarakterli metabolitlar va sezilarli darajada o'zgargan metabolik yo'llar AKG qo'shimchasining C2C12 miyoblastlariga ta'siri ostida yotgan molekulyar mexanizmlar haqida yangi tushunchalar beradi.