Kaltsitriolning insonning tabiiy qotil hujayralariga anti-aging ta'sirini in vitroda o'rganish

ANTRACT

D vitamini immunitet tizimiga tartibga soluvchi ta'sir ko'rsatadi. Ba'zi klinik tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, talabD vitamini yoshi bilan ortadi. Kaltsitriol ning biologik faol shaklidirD vitamini. Biroq, uning inson tabiiy qotil (NK) hujayralariga ta'siri noaniqligicha qolmoqda. Shu sababli, ushbu tadqiqotda biz kalsitriolning tug'ma immunitetdagi muhim rolini o'rganish uchun bir qator immunologik usullardan foydalangan holda NK hujayralariga anti-aging va immunomodulator ta'sirini o'rgandik. Biz kalsitriolning NK hujayralarida qarish bilan bog'liq biomarkerlarning ifodasini o'zgartirganini va bu hujayralarni G1 fazasida hech qanday apoptoz va charchoqsiz ushlab turish orqali ularning kengayishini inhibe qilganligini aniqladik. Kaltsitriol interleykin-5 (IL-5), interleykin-13 (IL-13), interferon-gamma (IFN-) kabi yallig'lanish bilan bog'liq sitokinlarning chiqarilishini bostiradi. va o'simta nekrozi omil-alfa (TNF-). Ushbu hujayralar K562 o'simta hujayralari bilan birgalikda o'stirilganda NK hujayralarining degranulyatsiyasi kalsitriol tomonidan pastga tushirildi. Shuningdek, biz kalsitriol qarish bilan bog'liq sirtuin 1- protein/kinaz R-ga o'xshash endoplazmatik retikulum kinaz (SIRT1/pERK) yo'lini va SIRT1-deltaExon8 (SIRT1-∆Exon8) ifodasini ko'targanini aniqladik. D vitamini retseptorlarini (VDR) faollashtirish orqali. Bundan tashqari, kalsitriol NK hujayrasining potentsial salbiy regulyatori bo'lishi mumkinapoptozvamitoxondrial inaktivatsiyatomonidan yuzaga kelganoksidlovchi stress. Shunday qilib, kalsitriol namoyon bo'ladiqarishga qarshi ta'sirSIRT1-PERK o'qini faollashtirish orqali in vitroda inson NK hujayralarida vaoksidlovchi qarishga qarshi turish.

Cistanche Anti-aging qo'shimchalarini olish uchun shu yerni bosing

1.Kirish

Ko'pgina tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, qarish yuqumli kasalliklar, yurak-qon tomir kasalliklari, neyrodegenerativ kasalliklar, otoimmün kasalliklar va saraton kabi bir qator kasalliklarga bevosita ta'sir qiladi. Organizmning qarishi immunosensensiya bilan kechadi. Qarishning umumiy xususiyatlariga asosan surunkali past yallig'lanish [1] bilan yallig'lanishli qarish, genomning beqarorligi, oqsil ekspressiyasining nomutanosibligi, mitoxondriyal inaktivatsiya, hujayra qarishi va hujayralararo aloqadagi o'zgarishlar kiradi [2]. Tug'ma immunitetning asosiy komponenti sifatida NK hujayralari infektsiyaga qarshi va o'smaga qarshi ta'sirda, shuningdek immunitet tizimini tartibga solishda muhim rol o'ynaydi [3]. NK xujayralari maqsadli hujayralarni to'g'ridan-to'g'ri yoki antikorga bog'liq hujayrali sitotoksisite (ADCC) orqali antigen yoki antikorga xos bo'lgan javoblarni ko'rsatish o'rniga yo'q qilishi mumkin [4]. NK hujayralari yuqori sezuvchanlik reaktsiyalari va otoimmün kasalliklar bilan ham bog'liq [5]. Immunitet tizimi qariganda, tabiiy qotil guruhi 2 a'zosi D (NKG2D) [6], qotil immunoglobulinga o'xshash retseptorlar (KIR), differensiatsiyaning sirt marker klasteri 57 (CD57) [7] kabi sirt faollashuv retseptorlarining ifodasi. , farqlash klasteri 16 (CD16) [8] oshdi. Ushbu molekula NK hujayralarining o'ldirish funktsiyasini faollashtirishi mumkin, bu esa hujayra muvozanatining buzilishiga va oqsoqollarda yallig'lanishga olib kelishi mumkin. Shu bilan birga, tabiiy qotil guruhi 2 a'zosi A (NKG2A), tabiiy qotil guruhi 2 a'zosi C (NKG2C) va tabiiy sitotoksiklik retseptorlari (NCRs) [6] kabi NK hujayralarining inhibitiv molekulalari kamaydi. NK hujayralarining qarishi bilan bog'liq boshqa belgilar T hujayra immunoglobulini va musin domenini o'z ichiga olgan protein 3 (TIM3) va dasturlashtirilgan hujayra o'limi-1 (PD-1) ortdi. Immunosensensiya davrida PD-1 va TIM3 ning ko'tarilishi NK hujayralarining funktsiyalarini inhibe qilishi va NK hujayralarining kamayishiga olib kelishi mumkin [9].

Immunosensensiyaga olib keladigan yana bir omil immun yallig'lanishdir [10]. NK hujayralari tomonidan chiqarilgan yallig'lanish sitokinlarining yuqori darajasi DNKning shikastlanishiga, oksidlovchi stressga va hujayra qarishiga olib kelishi haqida xabar berilgan. Bundan tashqari, NK hujayralarining hujayra muvozanati va yallig'lanish holati otoimmün kasallikka olib kelishi mumkin [11]. Interleykin-1 (IL-1), interleykin-4 (IL-4), interleykin-6 (IL-6), interleykin darajalari Keksa odamlarda -10 (IL-10) va o'sma nekrozi omil-alfa (TNF- ) ko'proq bo'ladi [12]. Qarish bilan umumiy immunitet hujayralari soni kamaygan bo'lsa-da, NK hujayralari populyatsiyasi sezilarli darajada ko'paydi, bu yallig'lanish hujayralarining infiltratsiyasi tufayli yuzaga kelishi mumkin [13].

D vitamini inson tanasida D2 vitamini (ergokalsiferol) va D3 vitamini (kaltsitriol) kabi ikkita faol shaklda mavjud. D vitaminining asosiy vazifasi kaltsiy va fosforning so'rilishini rag'batlantirishdir. D vitamini immunitet funktsiyalarini ham tartibga soladi [14]. Ko'pgina hisobotlar uning infektsiyaga qarshi va o'simtaga qarshi funktsiyalariga [15] e'tibor qaratgan bo'lsa-da, kalsitriol ham yallig'lanishga qarshi ta'sir ko'rsatadi [16]. D vitamini retseptorlari (VDR) turli immun hujayralarida ifodalanadi [17]. Yallig'lanish sitokinlarini ishlab chiqarishning kamayishi yallig'lanish reaktsiyalarining kamayishiga yordam beradi. Kaltsitriol TNF-, interleykin-1 (IL-1), interleykin-2 (IL-2), interferon-gamma (IFN-) va ishlab chiqarishni bostirishi ma'lum. B va T hujayralarida boshqa yallig'lanish sitokinlari. Shuningdek, u IL-4 va IL-10 [18] kabi yalligʻlanishga qarshi sitokinlarni chiqarishi va yalligʻlanish hujayralari infiltratsiyasiga qarshi autofagiyani tartibga solishi mumkin [19].

Kaltsitriolning antioksidant xususiyatlari depressiya, yog'li jigar kasalligi [20], yurak-qon tomir kasalliklari va boshqa yallig'lanish bilan bog'liq kasalliklarda qayd etilgan. Erkin radikallar va reaktiv kislorod turlari (ROS) ham qarish jarayonida hujayralar va to'qimalarda to'planadi. Nashr etilgan ma'lumotlar oksidlovchi stress hujayralardagi turli signal yo'llariga ta'sir qilishini ko'rsatdi [21], jumladan SIRT1, mitogen bilan faollashtirilgan protein kinaz (MAPK) va yadro omil-kB (NF-kB) yo'llari. SIRT1 geni uzoq umr ko'rish geni sifatida qaraladi va bu genning bostirilishi oqsillarni ifodalash, hujayra aylanishi va metabolizm bilan bog'liq kasalliklarga olib keladi [22]. SIRT1-DExon8 SIRT1 ning yangi izoformasi boʻlib, u sutemizuvchilarda muqobil ravishda qoʻshilish orqali mavjud edi. SIRT1-DExon8 toʻliq uzunlikdagi SIRT1 [23] ning birgalikda tartibga soluvchi omili sifatida ham koʻrib chiqildi.

Hozirgacha juda kam tadqiqotlar qarish va oksidlovchi qarishning NK hujayralariga ta'siriga qaratilgan. Kaltsitriolning SIRT1-DEXon8 ga ta'siri ham xabar qilinmagan. Shu sababli, ushbu tadqiqot kalsitriolning NK hujayralarining qarishi va oksidlanish qarishiga ta'sirini o'rganishga qaratilgan, chunki bu hujayralar insonning tug'ma immunitet tizimida markaziy o'rinni egallaydi.

2. Materiallar va usullar

2.1 Hujayra madaniyati va reaktivlar

Har qanday faol otoimmün kasalligi, o'tkir yoki surunkali yallig'lanish kasalligi, saraton yoki immunitet bilan bog'liq boshqa kasalliklarga ega bo'lmagan donorlardan uchta odamning periferik qon namunalari olindi. Donorlarning yoshi 48 dan 65 gacha. Periferik qonning mononuklear hujayralari (PBMCs) Lymphoprep Ficoll yordamida ajratilgan. NK hujayralari kengaytirildi va NK hujayra madaniyati to'plami (MoreCell, Shenzhen, Xitoy) yordamida 37 daraja / 5 foiz CO2 darajasida saqlangan.

2.2 Oqimning sitometrik tahlili

72 soat davomida kaltsitriol bilan davolashdan so'ng, NK hujayralari insonga qarshi FITC-CD3, PerCp-CD56, APC-CD16, PE-NKG2A, PE-TIM3, PE-PD1 va PE-KIR (BioLegend, Kaliforniya,) bilan bo'yalgan. AQSH). Barcha FACS tahlillari DxFLEX Flow Cytometer (Bekman, Kaliforniya, AQSh) yordamida amalga oshirildi.

2.3 Hujayra kengayishini o'lchash, sitokinlarni chiqarish va hujayra siklini tahlil qilish

Hujayra kengayishi hujayralarni hisoblash to'plami-8 [24] (CCK8; Beyotime, Shanxay, Xitoy) yordamida aniqlandi. NK hujayralari 48 soat davomida kaltsitriol bilan davolandi va supernatant sitokinni chiqarish tahlili uchun yig'ildi. Sitokin darajalari LEGEND Plex Human Inflammation Panel (BioLegend, Kaliforniya, AQSh) yordamida tekshirildi. Birinchidan, sitokinni ushlash boncuklari standartlar yoki namunalar bilan inkubatsiya qilindi va keyin biotinlangan aniqlovchi antikorlar bilan inkubatsiya qilindi. Keyinchalik lyuminestsent signalni ta'minlash uchun biotinlangan aniqlovchi antikorlarni bog'lovchi eritma, streptavidin (SA)-PE qo'shildi [25]. Keyinchalik bu signallar FACS tahlili yordamida tahlil qilindi.

Hujayra sikli hujayra siklini aniqlash to'plami (Beyotime, Shanxay, Xitoy) yordamida o'lchandi. NK hujayralari 72 soat davomida kaltsitriol bilan davolandi. Ushbu hujayralar 70 foiz muzdek sovuq etanolda mahkamlangan va keyin ribonukleaza A (RNase A) va propidiy yodid (PI) bilan bo'yalgan (Beyotime, Shanxay, Xitoy) [26].

2.4 NK hujayralarini o'ldirish tahlili

Inson eritroleykemik hujayralari, K562 hujayralari (ATCC, Virjiniya, AQSh) 10 uM 3,3 -dioktadesil-oksakarbosiyanin (DIOBeyotime, Shanxay, Xitoy) bilan 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va keyin kalsitriol bilan ishlangan NK hujayralariga qo'shildi. turli nisbatlarda (E/T'=1:1, 5:1 va 10:1) mos ravishda 4 soat davomida (27).

2.5 Oksidlanish qarish induksiyasi va X-gal bo'yash tahlili

Vodorod peroksid (H2O2) yordamida in vitro NK hujayra qarish modeli. Kaltsitriolning oksidlanishga qarshi ta'sirini aniqlash uchun NK hujayralari avval kalsitriol bilan ishlov berildi va keyin 24 soat davomida 100 mkM H2O2 ta'siriga duchor qilindi. -galaktosidazaning faolligi 5-bromo-4-xloro-3-indolil- -D-galaktopiranozid (X-gal) bo'yash yordamida o'lchandi. Ishlov berilgan hujayralar 4 foizli paraformaldegidda fiksatsiya qilindi va 37 daraja haroratda -galaktosidaza bo'yash eritmasi (Beyotime, Shanxay, Xitoy) bilan bo'yaldi [28]. Keyin bo'yalgan hujayralar PBSda to'xtatildi va bu hujayralarning tasvirlari Leica floresan inversiya mikroskop tizimi yordamida olingan. Har bir guruh uchun 40 × kattalashtirishda turli pozitsiyalardan tasodifiy uchta mikroskopik tasvir to'plangan. X-gal bilan bo'yalgan hujayralar foizi hisoblab chiqilgan va ImageJ V.1.45S dasturi yordamida hujayralarning qarishini baholash uchun ishlatilgan.

2.6 Mitoxondriyal membrana potentsialini bo'yash va tahlil qilish

Xlorometil-X-Rosamin (CMXRos) va Hoechst (Beyotime, Shanxay, Xitoy) mitoxondriyal membrana salohiyatini baholash uchun ishlatilgan. Hujayra yadrolari (ko'k) Hoechst bo'yash yo'li bilan joylashgan bo'lsa, mitoxondriyal membrana potentsiali flüoresan bo'yoq, CMXRosni bildiruvchi mitoxondrial o'ziga xoslik bilan aniqlangan. Hoechst plus CMXRos- hujayralari (oq o'qlar bilan belgilangan) past faollikni ko'rsatdi. Nisbiy floresans darajasi Hoechst-musbat hujayralar sonini CMXRos-musbat hujayralarga bo'lish yo'li bilan hisoblab chiqilgan [29]. Hujayralar 200 nM CMXRos va Hoechst (30 min, 37 daraja) bilan inkubatsiya qilindi va Leica teskari mikroskop yordamida 579 nm va 350 nm qo'zg'alish to'lqin uzunliklarida aniqlandi. Hoechst plus CMXRos plyus hujayralar foizi 2.5-bo'limda tavsiflanganidek hisoblab chiqilgan.

2.7 Western bloting

Hujayralar fosfataza inhibitori PhosSTOP (Roche, Bazel, Shveytsariya) va 1 mkM fenilmetilsulfonil ftorid (PMSF) (Beyotime, Xitoy, Shanxay) bilan radioimmunopresipitatsiya tahlili (RIPA) lizis buferi (Beyotime, Shanxay, Xitoy) yordamida lizing qilindi. Jami oqsil miqdori Bradford Protein Assay Kit (TAKARA, Tokio, Yaponiya) yordamida aniqlandi. Protein namunalari natriy dodesil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) bilan ajratildi va 0.22 mikron poliviniliden ftorid (PVDF) membranalariga (Immobilon-P membrana; Millipore, Massachusets, AQSh) o'tkazildi. Bloklangandan so'ng, membranalar birlamchi antikorlar bilan tekshirildi va ikkilamchi antikorlar bilan inkubatsiya qilindi [30]. Membranalar Odyssey tizimi (LI-COR, Nebraska, AQSh) yordamida aniqlangan.

2.8 Statistik tahlil

Ma'lumotlar GraphPad Prism yordamida bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) orqali tahlil qilindi va o'rtacha ± standart og'ish (SD) sifatida taqdim etildi. 6846 W. LI ET AL. Farqlar P < 0.05 da statistik ahamiyatga ega deb hisoblandi. Natijalar GraphPad dasturi yordamida ham tahlil qilindi.

Ko'proq so'rang:

Email:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950