QismⅡ: Cistanche salsadan yangi fenilpropanoid bilan almashtirilgan diglikozidlarni dereplikatsiya bo'yicha izolyatsiyalash va ularning makrofagda ishlab chiqarilmasligiga qarshi faolligi

Aloqa: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Ⅰ qismga qaytish

H-2 ning H-1a va H-1b bilan COZY korrelyatsiyasi va H{{ o'rtasidagi HMBC korrelyatsiyasi bilan 3-metilbutenil guruhi, aglikon quyi tuzilishi taklif qilingan. 4}} va H-5 va olefin uglerodlari, kC 120,7 (C-2) ​​va 136,4 (C-3). Ikki shakar qismi NMR spektrlarini tahlil qilish va kislota gidrolizatining HPLC spektrlarini tahlil qilish orqali, MS fragment namunasi bilan o'rnatildi. Ularning mutlaq konfiguratsiyasi kislota gidrolizatining HPLC tahlili yordamida D-glyukoza va L-ramnoz ekanligi aniqlandi [17]. Ushbu shakar qismlari anomerik protonlarning konstantalarini bog'lash orqali -glyukoza va a-ramnoz sifatida aniqlandi. 1H-1H COZY spektri H-13 dan H-63 va H-133 dan H-633 gacha boʻlgan ketma-ket korrelyatsiyalarni koʻrsatdi (4-rasm).

4,70 kH (H-43) da pasaytirilgan glyukoza protoni glyukozada asil o'rnini bosuvchini taklif qildi. HMBC spektridan H-43 va C-9333 o'rtasidagi korrelyatsiya kofeol o'rnini bosuvchi joyni tasdiqladi. H-13 va C-1 (kC 64,5) va H-33 (kH 3,68) va C-133 (kC 101,2) o'rtasidagi HMBC korrelyatsiyalari har bir o'rinbosarning pozitsiyasini taklif qildi. . Shunga ko'ra, 6 ning tuzilishi 3-metilbutenil-O- -L-ramnopiranosil-(1→3)-4-O-(E)-kaffeol- -D- sifatida aniqlandi. glyukoza-piranozid va sistansalsid B deb nomlanadi.

Cistansalside C (12), jigarrang amorf kukun (plyus )-HR-ESI-QTOF-MS tomonidan C26H38O13 molekulyar formulasiga ega ekanligi aniqlandi, u m/z 581,2213 [M plus Na] plus (hisoblash) da cho'qqini ko'rsatdi. C26H38O13Na uchun, 581.2205). m/z 163 dagi xarakterli ion strukturada kofeol o‘rnini bosuvchi mavjudligini ko‘rsatdi. m/z 325 va m/z 471 da fragment ionlari ramnoz birligi va glyukoza birligi mavjudligini ko'rsatdi.

12 ta NMR spektrlarini 6 ta spektrlar bilan taqqoslash shuni ko'rsatdiki, ular aglikon tuzilishidan tashqari o'xshash edi. 12 NMR spektrlarida kC 12 da ikkita olefin uglerod oʻrniga kC 38.0 (C-2) va 24.4 (C-3) ​​da ikkita parafinik uglerod kuzatildi{{16} 6 ning aglikonida }},7 (C-2) va 136,4 (C-3). 6 aglikonida H-4 va H-5 (kH 1,71 va 1,63) ga nisbatan (2-jadval). 12 ning aglikonini 3-metilbutil guruhi boʻlishi taklif qilindi, bu 1H va COZY NMR spektrlari bilan tasdiqlangan. 3-metilbutil guruhining eng yuqori nuqtalari 3,81 (1H, m, H-1a), 3,48 (1H, m, H-1b), 1,71 (1H, m) da kuzatildi. , H-3), 1,44 (2H, m, H-2) va 0,88 (H-4, 5).

Ikki shakar qismi kislota gidrolizatining HPLC tahlili va NMR spektrlari tahlili, shuningdek, MS fragment namunasi bilan yana bir bor tasdiqlandi. Shakarlarning mutlaq konfiguratsiyasi kislota gidrolizatining HPLC tahlili yordamida D-glyukoza va L-ramnoz sifatida aniqlandi [17]. A-glyukoza qismi va a-ramnoz qismi anomerik protonlarning ulanish konstantalari bilan tasdiqlangan. 1H-1H COZY spektri H-13 dan H-53, H-133 dan H-333 va H{{11} ga ketma-ket korrelyatsiyalarni ko‘rsatdi. } dan H-433gacha (4-rasm).

O'rinbosarlarning pozitsiyasi HMBC tahlili orqali tasdiqlandi. HMBC spektrida H-13 va C-1 (kC 67,2), H-33 (kH 3,68) va C-133 (kC 101,2) va orasidagi korrelyatsiyalar. H-43 (kH 4,70) va C-9333 (kC 165,7) aniqlandi. Shunday qilib, 12 ning tuzilishi 3-metilbutil-OaL-ramnopiranosil-(1→3)-4-O-(E)-kaffeol- -D-glyukoza-piranozid va cistansalside C deb nomlangan.

Cistansalside D (17), amorf jigarrang kukun, musbat rejimdagi yuqori aniqlikdagi ESI-QTOF-MS tomonidan C31H38O14 molekulyar formulasiga ega ekanligi aniqlandi, bu m/z 657,2147 [M plus Na] plyusda qo'shimcha ion cho'qqisini ko'rsatdi. (C31H38O14Na uchun hisoblangan, 657,2154). Fragment ionlari, jumladan, [M plyus H x Aglikon x Rha x Asetil Glc] plyus m/z 147 da ion, a [M plyus H x Aglikon x Rha] plyus m/z 351 da ion va [M plyus H x Aglikon] m/z 497 da ortiqcha ion ham aniqlandi. M/z 147 dagi xarakterli ion uning tarkibida kumaroil o‘rnini bosuvchi mavjudligini ko‘rsatdi. m/z 351 va m/z 497 da fragment ionlari ramnoz birligi va atsetil almashtirilgan glyukoza birligi mavjudligini ko'rsatdi.

Cistansalside dancistanche o'ti

13C-NMR spektri 31 ta uglerod atomining mavjudligini aniqladi. 1H va HSQC spektrlarida kH 4,61 (1H, m, H-13) va 4,60 (1H, s, H{{0}}) ikkita anomerik proton kuzatildi. . 1H-NMR spektri 1,97 (3H, s, atsetil-CH3) da metil guruhi, kH 7,55 (1H, d, J=15.9 Gts, H{{) da trans-olefin borligini ko'rsatdi. 25}}) va 6.34 (1H, d, J=15.9 Hz, H-8333) va kH 7.53 (2H, d, J=6 da para-almashtirilgan benzol halqalari. 9 Gts, H-3333, 5333) va 6,79 (2H, d, J=6,9 Gts, H-2333, 6333)/ kH 6,98 (2H, d, J {{5) 0}}.0 Hz, H-2, 6) va 6.65 (2H, d, J=8.0 Hz, H-3, 5) (2-jadval) . HMBC NMR spektridan kc 165,5 (C-9333) va H-8333 da karbonil uglerod va H-2333, 6333 va C-7333 (kc) o‘rtasidagi korrelyatsiyalar. 145.4) (E) - kumaroil guruhini taklif qildi. Kc 169.0 da metil proton cho'qqisi va karbonil uglerod o'rtasidagi HMBC korrelyatsiyasi asetil guruhining mavjudligini tasdiqladi.

KC 155,6 (C-4) va 128,6 (C-1) ​​da H-3, 5 va to'rtlamchi aromatik uglerodlar o'rtasidagi HMBC korrelyatsiyasi asosida 4-gidroksifenil guruhi taklif qilindi. . Gidroksillangan etil guruhi COZY NMR signallari bilan kH 2.66 (2H, t, J=6.1 Hz, H-7), 3.90 (1H, m, H-8a da tasdiqlandi. ) va 3,54 (1H, m, H-8b). H-7 va C-1 (kC 128,6) va C-2, 6 (kC 129,7) o'rtasidagi HMBC korrelyatsiyasi aglikon quyi tuzilishi sifatida 4-gidroksifeniletil guruhini taklif qildi.

MS fragment namunasidan taklif qilingan ikkita shakar qismi kislota gidrolizati va NMR spektrlarining HPLC tahlili bilan qayta tasdiqlandi. D-glyukoza va L-ramnoz kislota gidrolizatining HPLC tahlili yordamida aniqlandi [17]. A -glyukoza qismi va a-ramnoz qismi anomerik protonlarning konstantalarini birlashtirish orqali o'rnatildi. 1H-1H COZY spektri H-13 dan H-53 va H-133 dan H-633 gacha boʻlgan ketma-ket korrelyatsiyalarni koʻrsatdi (4-rasm).

1H-NMR spektridan H-23 (kH 4.69) va H-43 (kH 4.80) ning pastga siljishi glyukozadagi asil oʻrnini bosuvchi pozitsiyani taklif qildi. Glyukoza va ikki asil guruhi o'rtasidagi bog'liqlik H-43 (kH 4,80) va C-9333 va H-23 va atsetil guruhining karbonil uglerod (kC 169,0) o'rtasidagi HMBC korrelyatsiyasi bilan tasdiqlangan. ). Aglikon va ramnozning pozitsiyalari H-33 (kH 3.95) va C-1333 va H-8 va C-13 oʻrtasidagi HMBC korrelyatsiyasi bilan berilgan. Shunga ko'ra, 17 ning tuzilishi 4-gidroksifeniletil-2-O-asetil-O- -L-ramnopiranosil-(1→3)-4-O-(E)- sifatida tayinlangan. kumaroil- -D-glyukopiranozid va sistansalsid D.

Cistansalside E (18) amorf jigarrang kukun sifatida ajratilgan. Uning molekulyar formulasi 13C-NMR ma'lumotlari bo'yicha C31H38O14 va musbat rejimdagi yuqori aniqlikdagi ESI-QTOF-MS cho'qqisi m/z 657,2166 [M plyus Na] plus (C31H38O14Na, 657,2154 uchun hisoblangan) bilan aniqlandi. Bundan tashqari, fragment ionlari, jumladan m/z 163 da kofeol ioni, m/z 367 da [M plyus H x Aglikon x Rha] plyus ion va m/z 513 da [M plyus H x Aglikon] ioni ham aniqlandi. Fragment ionlari ramnoz birligi va atsetil o'rnini bosuvchi glyukoza birligi mavjudligini ko'rsatdi.

1H-NMR spektri kH 4.63 (1H, d, J=8.2 Hz, H-13) va 4.60 (1H, s, H-133 da ikkita anomerik proton mavjudligini koʻrsatdi. ) va ikkita atsil almashtirilgan glyukoza protonlari kH 4.71 (1H, dd, J=8.9, 8.2 Hz, H-23) va 4.81 (1H, dd, J=9.7). , 9,5 Gts, H-43). 1H va HMBC spektrlari atsetil guruhining kH 1,94 (3H, s, atsetil-CH3), kH 7,48 (1H, d, J=15,9 Gts) da (E)-kofeol qismining mavjudligini ko'rsatdi. H-7333), 7,02 (1H, d, J=1,6 Gts, H-2333), 6,98 (1H, dd, J=8,1, 1,6 Gts, H-6333), 6,76 (1H,d, J=8,1 Gts, H-5333) va 6,21 (1H, d, J=15,9 Gts, H{ {67}}) va mono-almashtirilgan benzol halqasi kH 7,29 (2H, m, H-3, 5), 7,21 (2H, m, H-2, 6) va 7,20 (1H, m, H-4) (2-jadval). H-7 (2H, kH 2.80, m) va C-1 (kC 138.8) va H{-7 va C oʻrtasidagi HMBC korrelyatsiyasi boʻyicha aglikon quyi tuzilishi boʻlgan fenilmetil guruhi taklif qilingan. -2, 6 (kC 128.9) va H-7 ning H-8a (1H, kH 3.99, m) va H-8b (1H,) bilan COZY NMR signallari kH 3.63, m).

Ikki shakar qismi kislota gidrolizatining HPLC tahlili va NMR spektrlari tahlili bilan yana bir bor tasdiqlandi. Shakarlarning mutlaq konfiguratsiyasi kislota gidrolizatining HPLC tahlili yordamida aniqlandi, ular D-glyukoza va L-ramnoz [17] ekanligi tasdiqlandi. A -glyukoza qismi va -ramnoz qismi anomerik protonlarning konstantalarini birlashtirish orqali o'rnatildi. 1H-1H COZY spektri H-13 dan H-53, H-133 dan H-233 va H{{11} ga ketma-ket korrelyatsiyalarni ko‘rsatdi. } dan H-333gacha (4-rasm).

HMBC spektridan H{0}} va C-8 (kC 69,4), H-23 va atsetil guruhidagi karbonil uglerod (kC 169,1) o'rtasidagi bog'liqlik. H-33 (kH 3,95) va C-133 (kC 102,0) va H-43 (kH 4,81) va C-9333 (kC 165,6) oralig‘ida o‘rinbosarlarning joylashishini tasdiqladi. tuzilishi. Shuning uchun 18 ning tuzilishi feniletil-2-O-asetil-OaL-ramnopiranosil-(1→3)-4-O-(E)-kaffeol- -D-glyukopiranozid va cistansalside deb nomlangan E.

Trans-cinnamoil o'rnini bosuvchi moddalarning aksariyati in vitroda cis-izoformaga izomerlangan. Nur trans-sinnamik kislota hosilalarini cis-izoformlarga aylantirishi haqida xabar berilgan [18,19]. Sinnamoil o'rnini bosuvchi moddalarning trans-sis konversiyasining muvozanati trans-izoformdagi izolatlarning taxminan 70 foizini saqlab turishi kuzatildi. Cis shaklidagi olefin protonlari uchun eng yuqori nuqtalar taxminan 6,90 ppm(d, J=12~13 Hz, H-7333) va 5,80 ppm (d, J=12~13 Hz, H-8333) 1H-NMR spektrlarida tayinlanishi mumkin edi, cho'qqilar esa taxminan 7,55 ppm (d, J=15.8 Hz, H-7333) va 6,40 ppm (d, J { Transformatsiya [20] uchun {28}}.8 Hz, H-8333) kuzatildi. Trans-sis aralashmalarining 1H-NMR spektrida ikkita olefinik proton (H-7333 va H-8333) uchun 7:3 (trans:cis) nisbatida tepaliklar kuzatildi. Cis shaklidagi 13C-NMR cho'qqilari transformatsiyaga o'xshash edi.

Cistanche dan samarali ingredientlar: akteozidlar

Barcha izolatlar RAW da LPS tomonidan qo'zg'atilgan NO ishlab chiqarishga inhibitiv ta'siri uchun sinovdan o'tkazildi

Barcha izolatlar RAW 264.7 hujayralarida LPS tomonidan qo'zg'atilgan NO ishlab chiqarishga inhibitiv ta'siri uchun sinovdan o'tkazildi. Deksametazon musbat nazorat sifatida ishlatilgan va uning IC50 7.0 uM edi. Tekshirilgan birikmalardan 5 (IC50 42,7 o 6,6 uM), 11 (IC50 37,3 o 2,2 uM), 13 (IC50 40.{{2{{) 24}}}} o 4.0 uM) va 18(IC50 27,9 o 0,8 uM) induksiyalanuvchi NO sintazada o‘rtacha inhibitiv faollikni ko‘rsatdi, boshqa birikmalar esa bu tahlilda (IC50) faol emas edi. qiymatlar > 100 uM). Ushbu birikmalarning sitotoksisitesi borligini tekshirish uchun hujayra hayotiyligi MTT tahlili yordamida o'lchandi. Natijada, ularning hech biri sezilarli sitotoksiklikni ko'rsatmadi (Qo'shimcha rasm S6-1). Ushbu to'rtta birikma LPS bilan stimulyatsiya qilingan RAW 264.7 hujayralarida NF-lB yo'liga qarshi inhibitiv faolligini baholash uchun tanlangan. RAW 264,7 hujayralarini LPS bilan stimulyatsiya qilish 0,5 soatlik inkubatsiyadan so'ng I-B va NF-b (p65) fosforlanishini keltirib chiqardi. NF-k B (p65) ning fosforillanishi western blot tahlilida ko'rsatilganidek, 11, 13 va 18 birikmalari bilan oldindan ishlov berish orqali sezilarli darajada kamaydi (5-rasm). Shunday qilib, 11, 13 va 18 birikmalar makrofaglarda NF-b ni inhibe qilish orqali yallig'lanishga qarshi ta'sir ko'rsatishi mumkin.

5-rasm.To'rtta birikmaning LPS bilan stimulyatsiya qilingan RAW 264,7 hujayralarida I-B va NF-b (p65) fosforlanishiga ta'siri. (A) G'arbiy dog'lar LPS va namuna bilan ishlov berilgan RAW 264,7 hujayralarida o'tkazildi; (B, C) Immunoblot signallari miqdori Molecular Analyst/PC densitometry dasturi (Bio-Rad, Richmond, CA, AQSH) yordamida aniqlangan. Fosforlangan izoformlarning densitometrik tahlili haqida xabar berilgan. RAW 264.7 hujayradagi NF- y B -aktin tarkibiga normallashtirildi.

3. Materiallar va Usullari

3.1. Umumiy tajriba Jarayon

Optik aylanishlar Jasco P{0}} raqamli polarimetri (Jasco, Tokio, Yaponiya) bilan o'lchandi. UV spektrlari Chirascan plus Circular Dichroism spektrometrida (Chirascan, APL, Buyuk Britaniya) qayd etildi. IQ spektrlari Jasco FT/IR-4200 spektrofotometri yordamida qayd etildi. Agilent 1260 Infinity seriyali (Agilent Technologies, Inc.) bilan jihozlangan Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS qurilmasida yuqori aniqlikdagi elektrosprey ionlashtiruvchi kvadrupol-uchish vaqti massa spektrometriyasi (HR-ESI-qTOF-MS) amalga oshirildi. , Palo Alto, CA, AQSH) va foydalanilgan ustun Jasco SFCpak Crest C18T-5 ustuni (id 150 4,6 mm, 5 um). Ma'lumotlarni yig'ish uchun MassHunter Workstation Software dasturidan foydalanilgan.

1D (1H va 13C) va 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) NMR spektrlari Jeol LA 300 (Jeol, Tokio, Yaponiya), Bruker AVANCE-400, Bruker yordamida olingan. AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 va Bruker AVANCE 800 HD spektrometrlari krioprob bilan birlashtirilgan (Bruker, Ettlingen, Germaniya). DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, In Cistanche Andover, MA, AQSH) NMR hal qiluvchi va mos yozuvlar cho'qqilari (kH 2,50 va kC 39,5) sifatida ishlatilgan. Ustun xromatografiyasi (CC) Sephadex LH-20 (25–100 um; Pharmacia, Uppsala, Shvetsiya) yoki Kieselgel 60 silikagel (40–63 um, 230–400 mesh, Art. 9385; Merck, Darmstadt) yordamida amalga oshirildi. , Germaniya). Yupqa qatlamli xromatografiya (TLC) oldindan qoplangan Kieselgel 60 silikagel F254 plitalarida o'tkazildi (5715-modda; Merck). TLC ustidagi dog'lar 254 nm va 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torsi, Fransiya) ultrabinafsha chiroq yordamida aniqlandi. O'rta bosimli suyuqlik xromatografiyasi (MPLC) RediSep 120 g silika flesh ustunida (Isco, Linkoln, NE, AQSH) va Kiesegel 60 silika jelida (40-63 um, 230-400 mesh, Art. 9385; Merck) o'tkazildi. Kombiflash hamrohi (Isco). Yuqori bosimli suyuqlik xromatografiyasi (HPLC) tizimi Gilson HPLC bo'lib, Gilson 321 nasosi va UV.VIS 151 detektori (Gilson, Middleton, WI, AQSH) bilan jihozlangan bo'lib, yarim tayyorlovchi ODS ustunlari (Luna 5 um C18 (2)) 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, AQSH; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf C18 ustuni, Germaniya Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Koreya). Analitik RP-HPLC tizimi a996 Photodiode Array (PDA) detektori (Waters Corp, Milford, MA, AQSH) bilan Waters 2695 alyans tizimi edi va foydalanilgan ustun Hypersil™ BDS C18 ustuni (130 Å, id 150: 4.6) edi. mm, 5 um, Thermo Scientific™). Chumoli kislotasi Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Seul, Koreya) dan sotib olindi. HPLC sinfidagi erituvchilar Fisher Scientific Korea Ltd. (Seul, Koreya) dan sotib olingan. H2SO4, Na2CO3 va ekstraksiya, fraksiyalash va izolyatsiyalash uchun birinchi navli erituvchilar Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Seul, Koreya) dan sotib olindi. L- va D-sistein metil ester gidroxloridi va o-tolilizotiyosiyanat Tokio Chemical Industry (Tokio, Yaponiya) dan sotib olindi.

3.2. O'simlik Material

ning butun o'simliklariCistanche salsa, Shinjang Uyg'urdan yig'ilgan Daerim farmatsevtika ulgurji kompaniyasi (Cheongju, Koreya) orqali olib kelingan. Ularni professor doktor Jehyun Li (Dongguk universiteti, Seul, Koreya) aniqlagan. Vaucher namunasi (SNUPH2016-03) Seul Milliy Universiteti farmatsevtika kolleji dorivor oʻsimliklar bogʻi gerbariysiga saqlangan.

3.3. Ekstraktsiya va Izolyatsiya

ning quritilgan butun o'simliklariCistanche salsa(5,7 kg) kesilgan va xona haroratida 99 daqiqa davomida sonikatsiya bilan MeOH (20 L) bilan uch marta ekstraksiya qilingan. Erituvchi vakuumda chiqarilgandan so'ng, xom ekstrakt (1,35 kg) H2O (5 L) da to'xtatildi, so'ngra EtOAc (5 L) bilan bo'lindi. EtOAc qoldig'i (55,3 g) CHCl3/MeOH (50:1-0:1, bosqichli gradient tizimi) bilan elutsiya qilingan silikagel xromatografiyasida 16 fraksiyaga (E01-16) ajratildi.

E08 (611,7 mg) silikagel o‘rta bosimli suyuqlik xromatografiyasiga (25 g) o‘tkazildi va CHCl3/MeOH (18:1–0:1, bosqichli gradient tizimi) bilan elut qilindi va 11 kasrni berdi (E08a-k). E08g dan 13 (0,7 mg) va 18 (0,6 mg) birikmalari Luna 5 um HPLC ustuni va 28 foiz suvli izokratik elyusiya yordamida tozalandi. MeCN. HPLC tozalash (Hypersil GOLD, 25 foiz ak. MeCN) E08h (138,5 mg) 7 (10,6 mg), 8 (17,2 mg), 14 (13,4 mg) va 17 (4,9 mg) birikmalarini taqdim etdi.

E09 (1,15 g) silika-MPLC ustunida (2{24}} g) CHCl3/MeOH (10:1–0:1, bosqich- gradient tizimi) 11 ta kichik fraksiyalarni (E09a-k) berish. E09e (398,7 mg) Sephadex LH-20 (MeOH) ga ta'sir qildi va sakkizta subfraktsiyani berdi (E09e1-8). E09e6 keyinchalik Hypersil GOLD HPLC ustuni (22% aq. MeCN) yordamida 11 (0,4 mg) birikmasini olish uchun tozalandi. E09e7 dan 5-aralashma (0,6 mg) Luna 5 um HPLC kolonnasidan 40 foizli akk bilan izokratik eluktsiya yo'li bilan tozalandi. MeOH.

E10 (1,20 g) Sephadex LH-20 ustunida MeOH bilan elut qilingan holda to‘qqizta fraksiyaga (E1{21}}ai) ajratildi. E10g (147,5 mg) dan 4 (13,4 mg), 9 (8,0 mg) va 15 (5,0 mg) birikmalar HPLC (Inno, 23 foiz ak. MeCN) bilan ajratilgan. 1 (3,8 mg), 10 (42,1 mg) va 16 (3,0 mg) birikmalarini olish uchun E10h fraksiyasi (470,0 mg) Hypersil GOLD ustunida izokratik elyusiya (40 foiz ak. MeOH) orqali tozalandi.

E11 (2,96 g) to'qqiz fraksiya (E11a-i) hosil qilish uchun MeOH bilan elutsiya qilingan Sephadex LH-20 ta'siriga solindi. E11e Sep-Pak C18 kartriji bilan 10 foiz, 20 foiz, 30 foiz, 50 foiz va 100 foiz oq bilan bosqichma-bosqich elutsiya qilingan. MeOH yetti fraksiya hosil qiladi (E11e1-7), keyin Luna 5 um HPLC (28 foiz ak. MeCN) 3 (3,4 mg), 6 (1,4 mg) va 12 (1,2 mg) birikmalarini hosil qiladi.

E12 (19.0 g) oltita fraksiya (18:1–0:1) hosil qilish uchun CHCl3/MeOH bosqichli gradient tizimi yordamida silika MPLC (120 g) taʼsiriga oʻtkazildi. , E12a-f). E12f Sephadex LH-20 ustunida (MeOH) xromatografiya qilindi, natijada yetti fraksiya (E12f1-7) hosil bo‘ldi. HPLC tozalash (Hypersil GOLD, 25% aq. MeCN) E12f7 bilan jihozlangan 2 birikmasi (3,3 mg). HPLC uchun ishlatiladigan barcha erituvchilar 0,05 foiz chumoli kislotasi buferi edi. HPLC va MPLC xromatografiyasi uchun umumiy oqim tezligi mos ravishda 3 va 40 ml/min edi.

3.4.Xarakterlash

Cistansalside A (5): jigarrang amorf kukun; [ |20 x33,7 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 332 (3.18); IQ (toza) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 smx1; 1H-NMR (800 MGts) va 13C-NMR (200 MGts) ma'lumotlari, 2-jadvalga qarang; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plyus 645,2146 (C30H38O14Na uchun hisoblangan, 645,2154).

Cistansalside B (6): jigarrang amorf kukun; [ |20 x72,9 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 333 (3.32); IQ (toza) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 smx1; 1H-NMR (500 MGts) va 13C-NMR (125 MGts) ma'lumotlari, 2-jadvalga qarang; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plyus 579,2054 (C26H36O13Na uchun hisoblangan, 579,2048).

Cistansalside C (12): jigarrang amorf kukun; [ |20 x61,6 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 337 (3,25); IR (toza) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 smx1; 1H-NMR (800 MGts) va 13C-NMR (200 MGts) ma'lumotlari, 2-jadvalga qarang; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plyus 581,2213 (C26H38O13Na uchun hisoblangan, 581,2205).

Cistansalside D (17): jigarrang amorf kukun; [ |20 x51,1 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 221 (3.53), 315 (3.52); IQ (toza) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 smx1; 1H-NMR (400 MGts) va 13C-NMR (75 MGts) ma'lumotlari, 2-jadvalga qarang; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plyus Na] plyus 657,2147 (C31H38O14Na uchun hisoblangan, 657,2154).

Cistansalside E (18): jigarrang amorf kukun; [ |20 x59,2 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 336 (3.22); IQ (toza) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 smx1; 1H-NMR (800 MGts) va 13C-NMR (200 MGts) ma'lumotlari, 2-jadvalga qarang; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plyus Na] plyus 657,2166 (C31H38O14Na uchun hisoblangan, 657,2154)

3.5.HPLC-QTOF-MS Tahlil

Xromatografik-mass-spektrometriya tahlili Agilent 1260 Infinity seriyali LC tizimida (Agilent Technologies, Inc., AQSh) amalga oshirildi. Analitik ustun SFCpak Crest C18T-5 ustuni edi (id 15{{10}} : 4,6 mm, 5 um, Jasco, Yaponiya). Harakatlanuvchi faza MeCN (A) va suv (B) tarkibidagi 0.1 foiz (v/v) chumoli kislotasidan iborat boʻlib, gradientli elyusiya yordamida 0–35 daqiqa (23 foiz A), 35–45 daqiqa ( 23-28 foiz A), 45-75 min (28 foiz A) va 75-80 min (90 foiz A). Oqim tezligi 0,3 ml / min da ushlab turildi. Absorbans 320 nm da o'lchandi. ESI manbasining shartlari quyidagicha edi: quritish gazining (N2) oqim tezligi, 10 L/min; quritish gazining harorati, 350 daraja; nebulizer, 30 psig; g'ilofning gaz oqimi tezligi, 12,0 L / min; g'ilof gazining harorati, 350 daraja; kapillyar, 4000 V; skimmer, 60 V; oktapol chastotasi, 750 V; parchalanuvchi kuchlanish, 180 V; ijobiy rejim. Tizim Masshunter ish stantsiyasining dasturiy ta'minoti ostida ishlagan. Massa diapazoni m/z 50-1000 gacha o'rnatildi.

3.6.Kislota Gidroliz

Murakkablar 1 N H2SO4 (100 uL) yordamida gidrolizlandi, suv hammomida 9{32}} daraja 2 soat davomida isitiladi, so'ngra to'yingan suvli Na2CO3 eritmasi bilan neytrallanadi. Eritmalar N2 oqimi ostida quritilganidan so'ng, mahsulotlar va standart shakarlar (D-Glc, L-Glc, L-Rha) L-sistein metil ester gidroxlorid (0,5 mg) o'z ichiga olgan piridinda (100 uL) eritildi. L-ramnoz namunasi D-sistein metil ester gidroxlorid (0,5 mg) o'z ichiga olgan piridinda (100 uL) eritildi. Shundan so'ng, ular 1 soat davomida 60 daraja isitiladi. Eritmalarga 1 uL (1,11 mg) o-tolilizotiyosiyanat bilan ishlov berildi, ular yana 1 soat davomida 60 daraja qizdirildi. Har bir yakuniy aralashma to'g'ridan-to'g'ri analitik RP-HPLC (Hypersil™ BDS C18 ustuni, 17 foiz suvli MeCN, 0,8 ml/min, 40 min, 35 daraja) bilan tahlil qilindi. 21,9 va 40,4 minutdagi cho'qqining tR darajasi mos ravishda D-glyukoza va L-ramnozning tiokarbamoil tiazolidin hosilasi bilan mos keldi.

3.7. Hujayra Madaniyat

Sichqoncha makrofaglari, RAW 264.7 Koreya biofan va biotexnologiya ilmiy-tadqiqot institutidan (Daejon, Koreya) olingan va 10 foiz homila sigir zardobi va 100 U/ml penitsillin/streptomitsin sulfatdan iborat RPMI muhitida yetishtirilgan. Hujayralar namlangan 5 foizli CO2 atmosferasida 37 daraja haroratda inkubatsiya qilindi.

3.8.Dori va kimyoviy moddalar

RPMI, penitsillin va streptomitsin HyClone kompaniyasidan (Logan, UT, AQSh) sotib olindi. Sigma (Sent-Luis, MO, AQSh) dan sigir zardobidagi albumin va LPS sotib olingan.

3.9.Yo'q ishlab chiqarishni o'lchash

Madaniy muhitdagi nitrit konsentratsiyasi Griess reaktsiyasiga ko'ra NO ishlab chiqarish ko'rsatkichi sifatida o'lchandi. Hujayralar 2:105 hujayra/quduqda 96-quduq kultura plitalariga ekilgan. RAW 264,7 hujayralarini 18 soat davomida oldindan inkubatsiya qilgandan so'ng, hujayralar aralashmalar (50 uM, 10 uM, 5 uM yoki 1 uM) bilan oldindan ishlov berildi va 24 soat davomida LPS (500 ng/ml) bilan stimulyatsiya qilindi. h. DMSO da erigan sinov birikmalari. Hujayralar, shuningdek, avtomobil nazorati sifatida 0,05 foiz DMSO bilan ishlov berildi. RAW 264,7 hujayralar (2: 105 hujayra/quduq) fenol qizilsiz RPMI yordamida 96-quduq plastinkalarida yetishtirildi va 0,5 soat davomida namunalar bilan oldindan ishlov berildi. Uyali NO ishlab chiqarilishi 500 ng/mL yakuniy konsentratsiyali LPS va 24 soatlik inkubatsiya qo'shilishi bilan yuzaga keldi. Inkubatsiyadan so'ng, 100 uL konditsioner muhit bir xil hajmdagi Griess reaktivi bilan aralashtirildi va 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Aralashmaning 540 nm chastotada absorbsiyasi ELISA mikroplyonkasini o'quvchi (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, AQSh) bilan o'lchandi. Olingan qiymatlar RPMIda erigan natriy nitritning standart konsentrasiyalari bilan solishtirildi va namuna bilan ishlov berilgan hujayralarning shartli muhitidagi nitrit konsentratsiyasi hisoblab chiqildi.

3.10.3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid (MTT) hujayra hayotiyligini tahlil qilish

Hujayralar {0}} quduq plastinkalariga 5:104 hujayra/quduq zichligida ekilgan va namunalar mavjudligida sarumsiz muhit bilan inkubatsiya qilingan. DMSO da erigan sinov birikmalari. Hujayralar, shuningdek, avtomobil nazorati sifatida 0,05 foiz DMSO bilan ishlov berildi. 24 soat davomida inkubatsiyadan so'ng, 10 uL MTT (5 mg/mL sho'r suvda) qo'shildi va inkubatsiya yana 4 soat davom ettirildi. Tirik hujayralardagi mitoxondrial suksinat dehidrogenaza inkubatsiya paytida MTTni ko'rinadigan formazan kristallariga aylantiradi. Keyin formazan kristallari dimetil sulfoksidda eriydi va absorbans fermentga bog'langan immunosorbent tahlili (ELISA) mikroplatasini o'quvchi (Benchmark, Bio-Rad Laboratories) yordamida 540 nm da o'lchandi. Nisbiy hujayra hayotiyligi ishlov berilmagan nazorat guruhining absorbsiyasi bilan solishtirganda hisoblab chiqilgan. Barcha tajribalar uch nusxada amalga oshirildi.

3.11.Immunoblot tahlili

Protein ifodasi standart protseduralarga muvofiq western bloting bilan baholandi. Qisqacha aytganda, RAW264,7 xujayralari 6{{20}} mm kulturali idishlarda (2: 106/ml) ekilgan, so'ngra 50 uM birikmalar bilan oldindan ishlov berilgan. . Hujayralar ikki marta muzli sovuq PBS (pH 7,4) da yuvildi, hujayra granulalari 15 daqiqa davomida muz ustida lizis tamponida qayta suspenziya qilindi va hujayra qoldiqlari keyin santrifüj orqali olib tashlandi. Protein kontsentratsiyasi ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Bio-Rad oqsil tahlili reagenti yordamida aniqlandi. Protein (20–30 ug) 1:1 nisbatda 2 bilan aralashtirildi: namuna buferi (20 foiz glitserin, 4 foiz SDS, 10 foiz 2- ME, 0,05 foiz bromofenol ko'k va 1,25 M Tris [pH 6,8]), 8 yoki 15 foiz SDS-PAGE jellariga yuklanadi va 150 V da 90 daqiqa davomida ishlaydi. Uyali oqsillar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Bio-Rad yarim quruq uzatish tizimidan foydalangan holda Immunoblot poliviniliden difluorid membranalariga (Bio-Rad) o'tkazildi. Keyin membranalar 5 foiz yog'siz sut va 0,1 foiz Tweenni o'z ichiga olgan Tris-buferli sho'r suvda tegishli p-NF-b, NF-b, B va -aktin birlamchi antikorlari (Abcam, Kembrij, Buyuk Britaniya) bilan bir kechada inkubatsiya qilindi. 20. Ertasi kuni dog'lar uch marta Tris-buferli fiziologik eritma (0,1 foiz Tween 20) bilan yuvildi va HRP-konjugatsiyalangan ikkilamchi anti-IgG antikori (1:2000-1 nisbatda suyultirilgan) bilan 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. :20 000). Blotlar yana uch marta Tris-buferli sho'r suv bilan yuvildi (0,1 foiz Tween 20) va immunoreaktiv tasmalar kimyoluminesans substrat ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, AQSh) yordamida ishlab chiqilgan.

3.12.Statistik tahlil

Eksperimental ma'lumotlar o'rtacha yoki SEM sifatida taqdim etiladi. Statistik ahamiyatga egalik darajasi dispersiya tahlili (ANOVA) va Dunnettning bir nechta taqqoslashlar uchun t-testi orqali aniqlandi.p 0.05 dan kichik qiymatlar muhim deb topildi.

Cistanche salsa ekstrakti

4. Xulosa

Ushbu tadqiqotda biz dereplikatsiya strategiyasidan foydalangan holda 13 ta ma'lum birikmani ajratib olish va identifikatsiya qilishdan tashqari, sistansalsid AE (5, 6, 12, 17 va 18) deb nomlangan beshta yangi fenilpropanoid o'rnini bosuvchi glikozidlarning strukturalarini ajratib oldik va yoritib berdik. Ma'lum bo'lgan birikmalar lipedozid AI (1) [21], 23-asetillakteozid (2) [22], izokistanozid C (3) [15], osmantusid B (4) [21], epimeridinozid A () ekanligi aniqlandi. 7) [15], sistanozid D (8) [23], salzasid B (9) [6], tubulozid E (10) [16], sistanozid M (11) [15], izomartinozid (13) [24], salsaside C (14) [6], jionosid C (15) [25] va salsaside F (16) [6]. Ularning tuzilmalari keng spektroskopik ma'lumotlarni tahlil qilish va adabiyotdagi hisobot ma'lumotlarini taqqoslash yo'li bilan o'rnatildi. Fenilpropanoid bilan almashtirilgan glikozidlarning taxminiy bashorat qilingan tuzilmalari ularning haqiqiy tuzilmalariga to'g'ri mos kelishi tasdiqlandi.

Cistanche salsa ekstraktining foydasi

Ma'lumotnomalar

1. Shimamura, X.; Miyazava, M.; Enomoto, K.; Nakamura, S.-I.; Kameoka, H. Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002 umu testida Cistanche salsa yog' kislotalari tomonidan Trp-P-1 ning SOS-induktsiya faolligini bostirish. Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 261–265. [CrossRef]

2. Jeon, E.; Chung, K.-S.; An, H.-J. Benign prostata giperplaziyasining rivojlanishiga Cistanches salsaning tarqalishiga qarshi ta'siri. mumkin. J. Fiziol. Farmakol. 2016, 94, 104–111. [CrossRef] [PubMed]

3.Xu, C.; Jia, X.; Syu, R.; Vang, Y.; Chjou Q.; Sun, S. Ko'p bosqichli infraqizil makro-barmoq izlari yordamida Herba Cistanchesning tezkor diskriminatsiyasi, sinf o'xshashligini yumshoq mustaqil modellashtirish (SIMCA). Spektroxim. Acta qism A Mol. Biomol. SpectrosCistanche2013, 114, 421–431. [CrossRef] [PubMed]

4. Jiang, Y.; Li, SP; Vang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Herba Cistanches-ning yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi-diodli massivni aniqlash-mass-spektrometriyasi bilan barmoq izlari bilan farqlash. J. Xromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]

5. Kobayashi, X.; Karasava, X.; Miyase, T.; Fukusima, S. Cistanchis Herba tarkibiy qismlarini o'rganish. V. Ikkita yangi fenilpropanoid glikozidlar, Cistanosidlar E va F. Chemning izolyatsiyasi va tuzilishi. Farm. Buqa. 1985, 33, 1452–1457. [CrossRef]

6.Ley, L.; Jiang, Y.; Liu, X.-M.; Tu, P.-F.; Vu, L.-J.; Chen, F.-K. Cistanche salsadan yangi glikozidlar. Helv. Chim. Acta 2007, 90, 79–85. [CrossRef]

7. Kartbaeva, E.B.; Sakipova, ZB; Ibragimova, L.N.; Kapsalyamova, EN; Ternynko, II Qozog'iston Respublikasida o'sadigan Cistanche salsa (CA Mey) G. Beckning fenolik birikmalarini kompozitsion o'rganish. J. Chem. Farm. Res. 2015, 7, 120–122.

8. Liu, J.-Y.; Guo, Z.-G.; Zeng, Z.-L. Cistanche salsa suspenziya madaniyatini prekursor bilan oziqlantirish orqali feniletanoid glikozidlarning to'planishi yaxshilandi. Biokimyo. Eng. J. 2007, 33, 88–93. [CrossRef]

9. Maruyama, S.; Akasaka, T.; Yamada, K.; Tachibana, H. Cistanche salsa ekstrakti oqsil bilan bog'langan kabi harakat qiladi

polisakkarid-K (PSK) har xil turdagi hujayra liniyalarida. J. Tradit. Med. 2008, 25, 166–169.

10. Tian, ​​X.-F.; Pu, X.-P. Cistanches salsadan olingan feniletanoid glikozidlar neyronlardagi 1-metil-4-fenilpiridinyum ioni tomonidan induktsiya qilingan apoptozni inhibe qiladi. J. Etnofarmakol. 2005, 97, 59–63. [CrossRef] [PubMed]

11.Mishel, T.; Xalabalaki, M.; Skaltsounis, AL yangi kontseptsiyalar, eksperimental yondashuvlar va tabiiy manbalardan yangi fitoestrogenlarni kashf qilish uchun deplikatsiya strategiyalari. Planta Med. 2013, 79, 514–532. [CrossRef] [PubMed]

12.De Medeiros, LS; Abreu, LM; Nielsen, A.; Ingmar, H.; Larsen, TO; Nielsen, KF; Rodrigues-Filho, E. Endofitik qo'ziqorin Setophoma sp. dan depsides theaflavins ST va lecanora DF ning dereplikatsiya bo'yicha boshqariladigan izolyatsiyasi. Fitokimyo 2015, 111, 154–162. [CrossRef] [PubMed]

13.Rakotondraibe, LH; Rasolomampianina, R.; Park, H.-Y.; Li, J.; Slebodnik, C.; Brodi, PJ; Blasiak, LC; Xill, R.; TenDyke, K.; Shen, Y.; va boshqalar. Tanlangan Streptomyces turlaridan antiproliferativ va antiplazmodial birikmalar. Bioorg. Med. Kimyo. Lett. 2015, 25, 5646–5649. [CrossRef] [PubMed]

14.Jiang, Y.; Liu, F.-J.; Vang, Y.-M.; Li, H.-J. Seloziya urug'idan yangi hepatoprotektiv triterpenoid saponinlarni yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi va elektrosprey ionlash tandem kvadrupol-uchish vaqti massa spektrometriyasi bilan birgalikda deeplikatsiyaga asoslangan izolyatsiyasi. J. Pharm. Biomed. Analiz. 2017, 132, 148–155. [CrossRef] [PubMed]

15.Chjan, J.; Li, C.; Che, Y.; Vu, J.; Vang, Z.; Cai, V.; Li, Y.; Ma, Z.; Tu, P. An'anaviy xitoy tibbiyoti uchun LTQ-Orbitrap-ga asoslangan strategiya maqsadli sinfni kashf qilish, identifikatsiya qilish va uning omiks tadqiqoti: Herba Cistanchesning uch xil turidagi feniletanoid glikozidlar bo'yicha amaliy tadqiqot. RSC Adv. 2015, 5, 80816–80828. [CrossRef]

16. Yoshizava, F.; Deyama, T.; Takizava, N.; Usmangoniy, K.; Ahmad, M. Cistanche tubulosa (Schrenk) Hookning tarkibiy qismlari. f. II. Yangi feniletanoid glikozid va yangi neolignan glikozidning izolyatsiyasi va tuzilmalari. Kimyo. Farm. Buqa. 1990, 38, 1927–1930 yillar. [CrossRef]

17. Tanaka, T.; Nakashima, T.; Ueda, T.; Tomii, K.; Kouno, I. Aldoz enantiomerlarini teskari fazali HPLCistancheChem tomonidan oson kamsitish. Farm. Buqa. 2007, 55, 899–901. [CrossRef] [PubMed]

18. Vong, VS; Guo, D.; Vang, XL; Yin, ZQ; Xia, B.; Li, N. Arabidopsis thalianadagi sis-cinnamik kislotani o'rganish. O'simlik fizioli. Biokimyo. 2005, 43, 929–937. [CrossRef] [PubMed]

19.Kahnt, G. Trans-Cis-Har xil pH da suvli eritmalarni nurlantirish paytida gidroksisinnamik kislotalarning muvozanati. Fitokimyo 1967, 6, 755–758. [CrossRef]