2-qism: Buyrak shikastlanishi molekulasi-1 SARS-CoV uchun potentsial retseptordir-2

Qo'shimcha ma'lumot uchun. aloqatina.xiang@wecistanche.com

Koronavirusning klinik ko'rinishlari

1. Kuluçka muddati uzoq, asosiy belgilari isitma, holsizlik, tomoq og'rig'i va yo'taldir. Isitma yuqori isitma, o'rtacha isitma yoki past harorat bo'lishi mumkin;

2. Chaqaloqlar va qariyalar tipik emas va ko'pincha xirillash va nafas qisilishi bilan birga keladi. Og'ir holatlarda ko'p tizimli shikastlanish paydo bo'lishi mumkin;

3. Dastlabki bosqichda quruq yo'tal asosan paroksismal va og'ir bo'lib, ko'k yo'talga o'xshaydi, bu uyqu va faoliyatga ta'sir qiladi; keyingi bosqichda yo'tal balg'amli, balg'am shafqatsiz, vaqti-vaqti bilan oz miqdordagi qonni o'z ichiga oladi, ba'zilari esa xirillash bilan birga keladi;

4. Ba'zi bemorlarda engil alomatlar mavjud va isitma bo'lmasligi mumkin. Bemorlarning ko'pchiligi yaxshi prognozga ega va kam sonli bemorlar og'ir ahvolda yoki hatto vafot etadi;

5. O'tkir respirator distress sindromi, septik shok, refrakter metabolik atsidoz va koagulyatsion disfunktsiya.

Yangi koronavirusning oldini olish, o'z immunitetini oshirish odamlar uchun virusga qarshi kurashishning eng samarali vositasidir. Qadim zamonlardan beri oziqlantiruvchi xazina sifatida foydalanilgan Cistanche, "cho'ljenshen" va immunitetni oshirish shohi. Cistanche - Immunitetni oshirish qiroli

Zamonaviy tibbiy tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Cistanche organizmni oziqlantirish va mustahkamlash funktsiyalaridan tashqari, o'smalarning oldini olish, qarishga qarshi, aritmiyaga qarshi, apoptozni inhibe qilish va immunitetni yaxshilashda sezilarli shifobaxsh ta'sirga ega. yaxshilik.

TheCistanche umumiy glyukozidlariimmun funktsiyasini tartibga solish uchun ginsengning faol komponentlari bo'lib, ular nafaqat oddiy odamlar uchun, balki immuniteti past bo'lgan odamlar uchun ham immunitetni yaxshilashi mumkin.

Klinik kuzatishlar shuni tasdiqladiki, Cistanche malign o'smalarga ma'lum bir davolovchi ta'sir ko'rsatadi va leykotsitlarni ko'paytirishning aniq ta'siriga ega. Radioterapiya va kimyoterapiya vaqtida ginsengni qabul qilish radioterapiya va kemoterapiyaning toksik va yon ta'sirini kamaytirishi, shikastlangan to'qimalarni tiklashni tezlashtirishi va leykopeniyaning oldini olishi mumkin;

Munozara

ga qarshi kurashish uchunCOVID-19 pandemiyasi, qanday qilib chuqur tushunishSARS-CoV-2inson hujayralarini bosib olish kafolatlanadi. Tadqiqotlar SARS-CoV-2 ning to'g'ridan-to'g'ri infektsiyasini ko'rsatdibuyrako'pkadan tashqari (Braun va boshq., 2020; Farkash va boshq., 2020). Biroq, ACE2 ushbu bosqinga vositachilik qilishi mumkin bo'lgan yagona taniqli retseptor bo'lib qolmoqda. Bundan tashqari, SARS-CoV-2 ning buyrak tropizmi va u bilan bog'liqbuyrak shikastlanishiVirusli hujumda ACE2 darajasining nisbatan kamayishi bilan tushuntirib bo'lmaydigan ko'rinadi (Kuba va boshq., 2005). Bu erda, bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatadiki, KIM1, buyrak shikastlanishi uchun keskin yuqori tartibga solinadigan biomarker (Yang va boshq., 2015), retseptor sifatida SARS-CoV-2 buyrak invaziyasiga vositachilik qiladi.

Shuningdek, SARS-CoV-2-RBD KIM1 bilan SARS-CoV-RBD va MERS-COV-RBDga qaraganda yuqoriroq yaqinlik bilan bog‘lanishini aniqladik, bu esa SARS-CoV ning kuchliroq tarqalishiga asos bo‘lishi mumkin-2 (Rabaan va boshqalar, 2020); shuning uchun buyrak infektsiyasi va KIM1 ning ushbu og'ir respirator kasalliklardagi roli qayta ko'rib chiqilishi kerak. Shunisi e'tiborga loyiqki, bizning natijalarimiz virusli RBDda KIM1 va ACE2 ning aniq bog'lanish joylarini ko'rsatadi, shuning uchun KIM1 va ACE2 ushbu organlarga SARS-CoV-2 invaziyasiga vositachilik qiladimi yoki yo'qmi va qanday qilib o'rganishga arziydi. Bundan tashqari, KIM1 klatringa bog'liq yo'llar orqali endotsitozlanganligi sababli (Chjao va boshq., 2016), virusning hujayra membranasiga biriktirilishidan keyin KIM{21}}bog'liq jarayonini batafsil o'rganish qiziq bo'lar edi.

ACE2 SARS-CoV-2 uchun eng yaxshi o‘rganilgan retseptoridir, ammo u COVID-19 uchun ideal terapevtik maqsad emas, chunki u bir nechta organlarda keng tarqalgan va qon bosimini tartibga solishda hal qiluvchi rol o‘ynaydi. va yurak / buyrak shikastlanishining oldini olish (Imai va boshq., 2005; Li va boshq., 2020d). Aksincha, KIM1 buyrak funktsiyasi bilan kuchliroq aloqaga ega va faqat keyin yuqori darajada ifodalanadi.buyrak shikastlanishi(Kondratowicz va boshq, 2011; Yuan va boshq, 2015; Kostafreda va Kaplan, 2018), bu esa buyrak kasalliklari bilan kasallangan COVID-19 bemorlari uchun uni yanada aniqroq va balki xavfsizroq terapevtik maqsad qiladi.

Xulosa qilib aytganda, bizning ma'lumotlarimiz KIM1 ning SARS-CoV-2 buyrak tropizmida SARS-CoV-2 uchun potentsial retseptor sifatida hal qiluvchi rolini ko'rsatadi. Bu yerda biz KIM1 va ACE2 vositachiligidagi “shafqatsiz tsikl” modelini taklif qilamiz (5G-rasm), bu COVID-19 bemorlarida SARS-CoV-2 ning buyrak tropizmini tushuntirishi mumkin. SARS-CoV-2 invaziyasining dastlabki bosqichida yuqori fiziologik daraja (qo‘shimcha S1 rasm) va bog‘lanish yaqinligi (qo‘shimcha S1 jadvali) ACE2 ni buyraklarga xos bo‘lmagan asosiy maqsad qilib qo‘yadi. Biroq, virus tomonidan qo'zg'atilgan AKl boshlanganidan so'ng, natijada keskin ko'tarilgan KIM1 tezda KIM1 va ACE2 vositachiligida ikkilamchi virusli infektsiyani rivojlantiradi, bu esa ko'proq buyraklarga xosdir va natijada buyrak shikastlanishini yomon tsiklda kuchaytiradi (5G-rasm). SARS-CoV-2 va KIM1 o'rtasidagi o'zaro ta'sirni buzishi mumkin bo'lgan yondashuvlar, jumladan anti-KIM1 antikorlari, kichik molekula ingibitorlari va KIM{29}}oliy antagonist peptidlari COVID-19ga oydinlik kiritishi mumkin. davolash.

Materiallar va uslublar

Materiallar

Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >95 foiz ) Genscript tomonidan kimyoviy sintez qilingan. Sichqoncha-lgGga qarshi antikor (p/n 18-8816-33) va quyon-lgGga qarshi antikor (p/n 18-8817-33) Rocklanddan olingan. IgG with SureBeads" Protein G magnit boncuklari (J2112LB-02) Bio-Rad'dan sotib olingan. DAPI (D9542) Sigma'dan edi. Alex Flour 594 etiketli phalloidin (C2205S) Beyotimes'dan edi. KIMB ga qarshi antikorlar (NB{{1). 15}}, Novus Biologicals), Flag (F1804, Sigma), HA (H6908, Sigma) va ACE2 (2115-1-AP, Proteintech) ishlatilgan.

KIM1 va ACE2 ifoda profillarini olish va tahlil qilish

Inson to'qimalari uchun KIM1 va ACE2 ning keng qamrovli transkriptom va protein profillarini olish uchun biz inson oqsili atlasidan (HPA, https://www.proteinatlas.org) transkriptom ma'lumotlarini va immunohistokimyoga asoslangan protein profillarini to'pladik va tahlil qildik, bu ko'rsatgan. 37 ta normal to'qimalardan RNK (RNK-seq) ning chuqur ketma-ketligiga va 44 ta to'qimalar turini o'z ichiga olgan to'qimalar mikroarraylarida immunohistokimyoga asoslangan inson oqsillarini to'qimalar va organlar bo'ylab ifodalash va lokalizatsiya qilish (Uhlen va boshq., 2015). Protein kodlovchi genning HPA RNK-seq to'qimasi har bir to'qimadan olingan namunalarning o'rtacha qiymatlariga mos keladigan o'rtacha protein kodlovchi transkript (pTPM) sifatida qayd etildi. Gistologiyaga asoslangan protein ifoda darajalari qo'lda to'rt darajaga (aniqlanmagan, past, o'rta va yuqori) tahlil qilindi. Qo'shimcha S1-rasmda mos ravishda KIM1 va ACE2 ning 10 ta eng yaxshi to'qimalar transkripsiya darajasi va gistologiyaga asoslangan protein ifoda darajalari ro'yxatga olingan va KIM1 va ACE2 ning bir-biriga o'xshash ifoda profili umumlashtirilgan.

Molekulyar ulanish va dinamikani simulyatsiya qilish

O'rnatish Z-Dock (http://zdock. umasmed.edu/) orqali amalga oshirildi. SARS-CoV-RBD (PBD ID 2AJF), ​​SARS-CoV-2-RBD (PDB ID 6MOJ), MERS-COV-RBD (PDB ID 4L3N), ACE2(PDB ID 1R42) va KIM1 Ig kristall tuzilmalari Potentsial ulanish modellarini izlash uchun V domeni (PDB ID 5DZO) ishlatilgan. Desmond serveri tomonidan o'tkazilgan va Pymol2.3 va Maestro11.8.012 tomonidan tahlil qilingan quyidagi molekulyar dinamika simulyatsiyalari uchun eng yaxshi ball olgan oqsil komplekslari tanlandi. Protein komplekslarining dinamik parametrlarini o'rganish uchun 50 ns dinamik simulyatsiya diagrammasi qo'llanildi. . MM-GBSA bog'lovchi erkin energiya HawkDock tomonidan hisoblab chiqilgan (Misini lgnjatovic va boshq., 2016).

Ildiz o'rtacha kvadrat og'ish (RMSD) va ildiz o'rtacha kvadrat tebranish (RMSF)

RMSD ta'riflanganidek ma'lum bir ramka uchun atomlar tanlovining o'rtacha o'zgarishini baholash uchun ishlatilgan (Li va boshq., 2011). RMSF oqsil zanjiridagi siljish o'zgarishlarini o'rganish uchun o'tkazildi (Li va boshq., 2011) .

AKI sichqoncha modellari va qPCR

I / R jarohati C57BL / 6 sichqonlarida yuqorida tavsiflanganidek amalga oshirildi (Chen va boshqalar, 2015, 2017). Sisplatin bilan qo'zg'atilgan OKI uchun tana vazniga 30 mg/kg sisplatin 8-haftalik erkak sichqonlarga qorin bo'shlig'iga yuborildi va sichqonlar 3 kundan keyin qurbon qilindi. Qo'shimcha tahlil qilish uchun qon va buyrak namunalari yig'ildi, har bir eksperimental hayvonlar guruhi uchun n=4. Jami RNK RNAiso Plus (TaKaRa) yordamida buyraklardan ajratilgan va M-MLV birinchi zanjirli sintez tizimi (Invitrogen) yordamida cDNKga teskari transkripsiya qilingan. Maxsus gen transkriptlarining ko'pligi qPCR tomonidan baholandi. Tadqiqotda ishlatiladigan primerlar taqdim etilgan (qo'shimcha jadval S4).

Quradilar

Inson KIM1, KIM1 Ig V (KIM1 qoldiqlari aa 20-127), KIM1 △lg V (kesilgan KIM1 qoldiqlari aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1 lg uchun sutemizuvchilarning ifoda plazmidlari V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD(SARS-CoV-2-S qoldiqlari aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV{{20 }}RBD-YFP va TIM4-YFP qurildi. Tegishli cDNK fragmentlarining PCR kuchaytiruvchi mahsulotlari HA yoki FLAG tegini o'z ichiga olgan pRK promotoriga asoslangan vektorga klonlandi. SARS-CoV bilan bog'liq plazmidlar Shandun universitetidagi doktor PHWang tomonidan yaxshi sovg'a bo'ldi.

Hujayra madaniyati va transfeksiyasi

Odam buyragi HK-2 (Xitoy turi madaniyati toʻplamidan olingan) 17,5 mM glyukoza va 10 foiz homila sigir zardobini oʻz ichiga olgan DMEM/F12 muhitida (Hyclone) yetishtirildi. SARS-CoV-2 ning hujayralarga ta'sirini baholash uchun HK-2 hujayralari SARS-CoV-2-S va SARS-CoV-2-RBD plazmidlari bilan transfektsiya qilindi va keyin to'plandi. qo'shimcha aniqlash.

Co-IP

Belgilangan HK-2/HEK293T hujayralari (1x10) 1 ml lizisdan oldingi buferda (25 mM Tris-HCl, pH7,4,150 mM NaCl, 1 foiz NP-40, 1 mM EDTA, 5 lizislangan. foiz glitserin), u tortish va IP tahlillari uchun va boncuklar uchun yuvish tamponi sifatida ishlab chiqilgan. IP uchun hujayra lizati ko'rsatilgan antikor yoki tegishli gG bilan SureBeadsTM Protein G magnit boncuklari bilan bir kechada 4C da immuno-presipitatsiya qilindi. 500 mM NaCl o'z ichiga olgan lizizdan oldingi tampon bilan yuvilgandan so'ng, boncuklar yuklash tamponida qaynatiladi va immunoblotatsiyaga duchor bo'ldi (Wan va boshq., 2017).

FRET tahlili

KIM1 va SARS-CoV-2-RBD o'rtasidagi hujayra ichidagi o'zaro ta'sir KIM1-CFP va SARS-CoV-2-RBD-YFP yordamida standart FRET asosidagi tahlil (Karpova va McNally, 2006) bilan aniqlandi. . Qisqacha aytganda, sutemizuvchilarning KIM{9}}CFP yoki KIM1 Alg V-CFP ifodalovchi plazmidlari SARS-CoV-2-RBD-YFP bilan-293T hujayralariga kotransfektsiya qilingan. Flüoresan spektrofotometrga asoslangan aniqlash uchun hujayralar transfeksiyadan 24 soat o'tgach yig'ildi va lizing qilindi va lizat F-2700 floresans spektrofotometri (Hitachi) tomonidan to'lqin uzunligi skanerlash (500-600nm) va vaqtni skanerlash (435) orqali aniqlandi. /527 nm, qo'zg'alish/emissiya).Konfokalga asoslangan aniqlash uchun hujayralar Leica TCS SP8 konfokal mikroskopida yuqori quvvatli ob'ektiv (40×) ostida tasvirlangan (CFP kanali: 435/485 nm, qo'zg'alish/emissiya; YFP kanali) : 485/527nm, qo'zg'alish / emissiya; FRET kanali: 435/527 nm, qo'zg'alish / emissiya) (Li va boshqalar, 2020b). Konjugatsiyalanmagan CFP va YFP ning kotransfeksiyasi tavsiflanganidek salbiy nazorat sifatida kiritilgan (Karpova va McNally, 2006). KIM1 va uning ligand TIM4 o'rtasidagi o'zaro ta'sir FRET tahlili bilan ijobiy nazorat sifatida aniqlandi (Rong va boshq, 2011).

CRISPR-Cas9- vositachi KIM1 nokauti

Genom muhandisligi uchun CRISPR-Cas{1}}asosidagi protokollar tavsiflanganidek ishlatilgan (Zhang va boshq., 2017). KIM1 uchun qo'llanma RNK maqsadli ketma-ketliklari keltirilgan (qo'shimcha jadval S4).

FITC yorlig'i va konfokal mikroskopiya

FITC yorlig'i yuqorida aytib o'tilganidek amalga oshirildi (Li va boshq., 2020b; Zhang va boshq., 2020). Qisqacha aytganda, SARS-CoV-2-RBD bir kechada FITC (molyar nisbati 1:5) bilan inkubatsiya qilindi, so‘ngra reaksiyani to‘xtatish va reaksiyaga kirishmagan FITCni o‘chirish uchun 5 mM NHCl qo‘shildi. Eritma ikki marta dializlangan va keyingi foydalanish uchun liyofilizatsiya qilingan.

HEK293T hujayralari (5×109) yoki HK{3}} hujayralari (1×107) bepul FITC yoki FITC-SARS-CoV-2-RBD (2 uchun 100ug/ml) bilan inkubatsiya qilindi. Peptid asosidagi ichki tahlillar uchun AP1 yoki AP2 (50 mkM) FITC-SARS-CoV-2-RBD (100 ug/m) bilan birgalikda qo'shilgan. 4 foiz (v/v) formaldegid bilan mahkamlangandan so‘ng, hujayra membranalari Alex Flour 594 yorliqli phalloidin (2ug/ml) bilan bo‘yalgan va yadrolar DAPI (1ug/m) bilan bo‘yalgan va Leica TCS bilan tasvirlangan. SP8 konfokal mikroskop. Har bir guruh uchun yuqori quvvatli ob'ektiv (64 ×) ostidagi beshta maydondan kamida 100 ta hujayra baholashga kiritilgan. Vakillik suratlari taqdim etildi. Tasvirlar miqdorini aniqlash ImageJ1.8.0 tomonidan amalga oshirildi.

Hujayra hayotiyligini tahlil qilish

Hujayralar har bir quduqga 3000-4000 katakchada 96-quduq plitalari bilan qoplangan. 80 foiz qo'shilishda SARS-CoV-2-RBD (100 ug/ml) bilan inkubatsiya qilingan hujayralar AP1 yoki AP2 (10,50,100 mkM) bilan yoki ularsiz ishlov berildi. Shundan so'ng, 10ul MTT (har biriga 5 mg / ml qo'shildi

4 soat davomida yaxshi, vosita olib tashlandi va DMSO qo'shildi. 490 nm da o'lchangan absorbsiya tegishli nazorat guruhiga normallashtirildi.

Statistik tahlil

Ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida ifodalangan. Muhim farqlar ikki tomonlama Student testi bilan baholandi. Ikki tomonlama P-qiymati<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">