Miqdoriy proteomik tadqiqot jigar polikistik kasalligida fibrinogen yo'lini ochib beradi Ⅱ
Nov 22, 2023
3. Natijalar
3.1. Buyraklar va jigar bir xil kist mexanizmlariga ergashmaydi
Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Pkd1 genining erta inaktivatsiyasi (p12 dan oldin) polikistik kasallikning tez rivojlanishiga olib keladi (kistik oyna), p14 dan keyin inaktivatsiya esa 4-5 oydan keyin engil fenotip bilan kech kista shakllanishiga olib keladi (kistik bo'lmagan oyna) [19]. ADPKD ning bir xil ortologik modelidan (Pkd1cond/cond; Tam-Cre) [18,19] foydalanib, biz buyrak rivojlanishining ushbu oynasi jigar rivojlanishining o'xshash oynasiga o'z vaqtida mos kelishini tekshirdik. Oldingi tadqiqotlarimiz bilan to'g'ridan-to'g'ri taqqoslash uchun [37], sichqonlar tug'ruqdan keyingi 14 (p14) va 12 (p12) kunlarida Pkd1 genini inaktivatsiya qilish uchun tamoksifen bilan qo'zg'atildi va 30 kunlik (p30) yoshda qurbon qilindi. Qizig'i shundaki, biz har ikki vaqtda kasallikning turli darajasi (engil va og'ir) bo'lgan kista fenotipini kuzatdik, bu buyrak va jigarning mustaqil kist rivojlanishi oynalariga ega ekanligini ko'rsatdi (1a-rasm) va/yoki kasallikning turli vaqtlari va rivojlanishi mumkin. . Ushbu so'yish yoshidagi erkaklar va urg'ochilar o'rtasida ikkala inaktivatsiya oynasi o'rtasida hech qanday farq topilmadi (har bir mutantlar guruhi uchun n=6 ishlatilgan). P14 mutant hayvonlari ALP sarum qiymatiga ko'ra kist indeksi, kistalar soni va jigar funktsiyasining past qiymatlari bilan p12 mutant guruhiga qaraganda yumshoqroq fenotipni taqdim etdi (1b-d-rasm). Bu Pkd1 jigar va buyrak etishmovchiligi uchun turli rivojlanish oynalari/mexanizmlarini ko'rsatadigan birinchi tadqiqot. Ushbu molekulyar farqlar kelajakdagi tadqiqotlarda aniqlanishi kerak.
Shakl 1. P12 va p14 shakllarining 3-kuni 0 bosqichlarida kistali jigar fenotipining xarakteristikasi. p12 da Pkd1ni yo'q qilish yanada og'ir sistogenezga olib keladi. (a) Pkd1cond/cond;Tam-Cre sichqonchasining Wild Type (WT, Pkd1cond/cond;Tam-Cre−) va Mutant (KO, Pkd1cond/cond; Tam-Cre+) jigaridan bo'yalgan gematoksilin-eozinning reprezentativ makroskopik va mikroskopik tasvirlari. ) tug'ruqdan keyingi 14 (p14 guruhi) va 12 (p12 guruhi) da tamoksifen tomonidan qo'zg'atilgan Pkd1 genini yo'q qilish bilan. Barcha sichqonlar p30 da qurbon qilindi. Masshtab paneli, 2 mm (yuqori panel) 100 mkm (pastki panel). n guruhdagi namunalar sonini, Bd esa o't yo'lini bildiradi. (b,c) Jigar kistasi indeksi va turli fenotipli kistalar soni. (d, e) Qon zardobidagi ALP va ALT qiymatlari. Barlar barcha holatlarda ± SEM vositalarini ifodalaydi. Talabaning t-testi (ikki dumli) bo'yicha p <0,05 muhim natija sifatida qabul qilindi. ns ahamiyatli emasligini bildiradi. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
Buyrak kasalligi uchun cistanche herba uchun bosing
3.2. PLDda ov quroli va SWATH-MS proteomik tahlili
2-rasmda ko'rsatilganidek, biz mutantlarning (KO) har ikkala kist bosqichida (p12 - og'ir kistoz kasalligi va p14 - engil kista kasalligi) ni aniqlash va aniqlash uchun yovvoyi tipdagi (WT) hayvonlarga nisbatan differentsial proteom tahlilini o'tkazdik. jigar sistogenezi va kasallikning rivojlanishining tegishli molekulyar mexanizmlarini tavsiflaydi.
Rasm 2. Ish jarayonining tasvirlangan sxemasi. Biz ADPKD sichqoncha modelidan (Pkd1cond/cond; Tam-Cre sichqonlari) foydalandik, unda Pkd1 ning genetik inaktivatsiyasi tug'ruqdan keyingi 10-kun (p10) va p11 (kasallikning tez rivojlanishi) yoki p15 va p16 (kechiktirilgan kasallikning rivojlanishi) tamoksifenni yuborish orqali qo'zg'atildi. ) buyrak sistogenezi uchun rivojlanish kalitiga ko'ra, p12 va p14 deb nomlangan tadqiqotning ikkita guruhini aniqlaydi [19]. Ikkala guruh uchun biz har bir holatda oltitadan ortiq yovvoyi (WT) va mutant (KO) shaxslardan n dan foydalandik va barcha hayvonlar p30 da qurbon qilindi. Biz miqdoriy proteomik SWATH-MS va ov miltig'i ma'lumotlariga bog'liq DDA-MS tahlilini qo'llagan holda, biz jigar kisti kasalligining ikkala og'irligida WT va KO jigarlarining differentsial proteomini o'rgandik (1-rasm). Mo'l-ko'llikda sezilarli o'zgarishlarga ega bo'lgan oqsillardan biz bioinformatikadan foydalandik 2-rasm. Ish jarayonining tasvirlangan sxemasi. Biz ADPKD sichqoncha modelidan (Pkd1cond/cond; Tam-Cre sichqonlari) foydalandik, unda Pkd1 ning genetik inaktivatsiyasi tug'ruqdan keyingi 10-kun (p10) va p11 (kasallikning tez rivojlanishi) yoki p15 va p16 (kechiktirilgan kasallikning rivojlanishi) tamoksifenni yuborish orqali qo'zg'atildi. ) buyrak sistogenezi uchun rivojlanish kalitiga ko'ra, p12 va p14 deb nomlangan tadqiqotning ikkita guruhini aniqlaydi [19]. Ikkala guruh uchun biz har bir holatda n teng yoki oltidan ortiq yovvoyi tip (WT) va mutant (KO) shaxslardan foydalandik va barcha hayvonlar p30 da qurbon qilindi. Biz WT va KO jigarlarining differentsial proteomini jigar kistasi kasalligining ikkala og'irligida ham o'rgandik (1-rasm), ikkala miqdoriy proteomik SWATH-MS va ov miltig'i ma'lumotlariga bog'liq DDA-MS tahlilidan foydalangan holda. Ko'pligi sezilarli darajada o'zgargan oqsillardan biz kasallikning yangi terapevtik maqsadlari va yo'llarini aniqlash uchun bioinformatika vositalaridan foydalandik. Nihoyat, biz ushbu maqsadlarni avval silico (DDA va SWATH tahlili) va nihoyat in vivo strategiyalar, shuningdek, RT-qPCR, Western blotting va immunohistokimyo yordamida tasdiqladik. p tug'ruqdan keyingi kunni anglatadi
Jigar sistogenezidagi oqsillarni ifodalash namunasi Birinchidan, biz DDA-MS yoki DDA ma'lumotlariga bog'liq bo'lgan ov quroli yordamida proteomik massa spektrometriyasi tahlilini o'tkazdik. Ushbu tahlil proteomani to'liq va individual namunalardan tavsiflash imkonini beradi, yuqori sezuvchanlikka ega, ammo ularning miqdorini ko'rsatmasdan, oqsillarning mavjudligini / yo'qligini ta'minlaydi. Biz faqat yovvoyi tipdagi p14 va p12 bosqichlari va mutant shaxslar uchun jami oltita namunadan beshdan ortiq mustaqil namunalarda differentsial tarzda ifodalangan barcha oqsillarni ko'rib chiqdik (S1-rasm). p14 da 1 WT-eksklyuziv (yoki kasallik uchun pastga regulyatsiya qilingan) va 7 MUT eksklyuziv (yuqori tartibga solinadigan) oqsillar aniqlangan, p12 da sakkizta WT-eksklyuziv va oltita MUT-eksklyuziv oqsillar kuzatilgan (S1-rasm).
Keyinchalik, biz differensial ravishda ifodalangan oqsillarni miqdorini aniqlashga imkon beruvchi usuldan foydalandik. Biz DDA uchun ishlatgan bir xil namunalar bo'yicha SWATH-MS miqdoriy proteomik tahlilini o'tkazdik, har bir namunada ~ 1500 ta oqsil va har bir tadqiqot guruhida 2000 dan ortiq oqsillarni oldik. Birinchidan, biz S2 va S3-rasmlarda ko'rsatilganidek, namunalarimiz normal taqsimot sxemasiga rioya qilganligini baholash uchun umumiy maydon summasini (TAS) normalizatsiya qildik. Keyinchalik, biz Wild Type va Mutant guruhlari o'rtasida sezilarli farqlar bilan oqsilni o'rgandik. 1-jadvalda oqsillar miqdorining ikki baravar ko'payishi (yuqori tartibga solingan) yoki kamayishi (pastga tushirilgan) va sezilarli darajada o'zgartirilgan p-qiymati (parametrik Student t-testiga ko'ra) WT va boshqalar bilan ko'pligi sezilarli darajada o'zgargan. p14 va p12 da MUT namunalari. Hammasi bo'lib, oltita oqsil WT p14 va MUT-p14 guruhlari (beshta yuqori tartibga solinadigan oqsil va bitta pastga regulyatsiya qilingan oqsil) o'rtasida protein ko'pligida sezilarli farqlarni ko'rsatdi. WT-p12 va MUT-p12 o'rtasida 26 ta oqsil (20 ta oqsil yuqori tartibga solingan va 6 ta oqsil pastga regulyatsiya qilingan) sezilarli farqlarni ko'rsatdi (3a-rasm va 1-jadval). Grafik jihatdan, bu o'zgarishlarni ularning −log (10) p-qiymatiga nisbatan aniqlangan barcha oqsillar uchun log (2)-katta o'zgarishlarni grafigini tuzish orqali hosil qilingan vulqon uchastkalari orqali kuzatish mumkin (3b-rasm). Protein ko'pligi darajasi o'rtasidagi sezilarli farqlarni issiqlik xaritasida spektral kutubxonaning hududlariga va uning klasterlash darajasiga qarab individuallashtirilgan qiymatlari bilan klaster issiqlik xaritasi tahlilida ko'rish mumkin (3c va S4-rasmlar). SWATH-MS tahlili orqali aniqlangan ushbu klasterlar miqdoriy tahlil uchun ko'rib chiqiladigan sifat jihatidan ajratilgan namunalarni aniqlashga yordam beradi (S5-rasm). Nazorat qilinmagan ko'p o'lchovli statistik tahlil namunalar orasidagi ma'lumotlarni solishtirish uchun asosiy komponentlar tahlili (PCA) yordamida amalga oshirildi (S6-rasm). Issiqlik xaritasi va PCA ma'lumotlari namunaning uch nusxasi orasida takrorlanuvchanlikni ko'rsatdi, chunki uchta replikatsiya ikkala tahlilda yaqindan to'plangan. Biz PCAda ham, issiqlik xaritasi klasterini tahlil qilishda (S5 va S6-rasmlar) ba'zi namunalar qanday qilib to'g'ri guruhlanmaganligini, ikkala klaster o'rtasida bir-biriga mos kelishini kuzatishimiz mumkin. Shunga qaramay, biz Wild Type va Mutant klasterlarida ma'lumotlarni ajratish tendentsiyasini ko'rishimiz mumkin. P14 va p12 o'rtasidagi sezilarli farqlarga ega bo'lgan oqsillarning kam sonini turli darajadagi zo'ravonlik bilan oqlash mumkin (2-rasm), bu oqsillar va yo'llar soni kista fenotipining og'irligi va kasallik holatiga qarab ko'payishini ko'rsatadi.
3.3. PLDda gen ifodasini klasterlash, yo'lni boyitish va oqsil-oqsil o'zaro ta'sirini tahlil qilish
SWATH-MS tahlili bilan aniqlangan differentsial ifodalangan oqsillar bilan bog'liq funktsiyani o'rnatish uchun biz bir nechta bioinformatik vositalar va tahlil shakllaridan foydalandik. Gen Ontologiyasi (GO) atamalari va yo'llari tahlillari FunRich [39,40], String [41] va Reactome [42] yordamida amalga oshirildi. Proteinlar FunRich genini boyitish tahlilida saralangan. Biologik jarayonga kelsak, p14 guruhi (engil kistoz) uchun oqsillarning eng boyitilgan guruhi yog 'kislotalarining tashilishi va prostaglandinlar biosintezi bilan, fibrinogen/fibrin faolligi, hujayra-hujayra/matritsa yopishishi va metabolik faolligi bo'lgan p12 (og'ir kistoz) guruhi bilan bog'liq edi. jarayon (4a-rasm, yuqori panel). ANXA2 va fibrinogen kompleksi mos ravishda p14 va p12 guruhlarida ikkita eng boyitilgan uyali komponentlar edi. Bundan tashqari, hujayradan tashqari bo'shliq ikkala guruhdagi oqsillarning eng yuqori foiziga ega bo'lgan hujayra komponenti edi (4a-rasm, pastki panel). Xuddi shunday tahlil, asosiy biologik jarayon sifatida turli metabolik jarayonlarni va hujayradan tashqari bo'shliqni eng boyitilgan hujayra komponenti sifatida aniqlab, string tahlili bilan o'rnatildi; GO natijalariga mos keladi (S7a-rasm). Nihoyat, biz Reactome platformasi bilan tahlilni takrorladik, metabolizm va immunitet tizimi eng boyitilgan yo'llar ekanligini aniqladik (S7b-rasm).
Protein-oqsil yoki oqsil-oqsilning mumkin bo'lgan o'zaro ta'sirini (eksperimental dalillar bilan o'zaro ta'siri) tekshirish uchun string tahliliga asoslangan oqsil-oqsil yoki klaster tahlili ham o'tkazildi. Turli guruhlarda ko'plab oqsil o'zaro ta'sirlari aniqlangan (S8-rasm), ammo p14 da bitta klaster va p12 da boshqasi oqsillar o'rtasidagi o'zaro ta'sirlar soni va ifoda darajasiga qarab eng dolzarb bo'lgan (4b-rasm). P14-klasterda fibrinoliz, hujayra harakatchanligi (epiteliya hujayralarida), aktin bilan bog'liq bo'lgan bir qancha hujayra funktsiyalari bilan bog'liq bo'lgan aneksin A2 oqsili (ANXA2_P07356) mavjud. sitoskeleton va hujayra-matritsaning o'zaro ta'siri [43], hujayra ichidagi lipidlarni tashishda ishtirok etadigan boshqa ikkita oqsil bilan o'zaro ta'sir qiladi (FABP1_P12710 va FABP5_Q05816). Qizig'i shundaki, p12-klasterda bir nechta fibrinogenlar (FGL1_Q71KU9, FIBB_Q8K0E8, FIBA{{22) o'rtasida juda kuchli oqsil-oqsil o'zaro ta'siri bo'lgan boshqa tegishli oqsillar guruhi aniqlangan. }}E9PV24 va FIBGG_Q8VCM7). Fibrinogenlar gepatotsitlar o'sishida ishtirok etadi va ular qon trombotsitlarining tarqalishiga, interstitsial kollagen va fibrotik lezyonlarga vositachilik qiladi [44]. Bundan tashqari, qo'shimcha oqsillarning fibrinogenlar bilan o'zaro ta'siri aniqlandi (S8-rasm), masalan, sarum amiloid p-komponenti (SAMP_P12246), gemopeksin (HEMO_Q91X72) yoki gidroksi kislota oksidaza 2 (HAOX{). {37}}Q9NYQ2). Satr natijalariga mos ravishda, ANXA2 va fibrinogen komplekslari FunRich tahlili bilan aniqlangan eng boyitilgan uyali komponentlar edi (4a-rasm). Qizig'i shundaki, DDA va SWATH tahlillari natijasida olingan ma'lumotlarni solishtirganda, biz SWATH tomonidan aniqlangan bir nechta oqsillar DDA tahlili bilan aniqlanganligini tasdiqladik, shu jumladan fibrinogen kompleks oqsillari bilan bog'liq bir nechta (SAMP / Apcs va S10A9 / S100a9; Jadval S3).
3.4. SWATH-MS tahlilini tasdiqlash fibrinogen kompleksini PLD bilan bog'liq yangi molekulyar mexanizm sifatida ochadi.
Ushbu ma'lumotlarga asoslanib, biz SWATH-MS tahlilidan (S9-rasm) p12 va p14 bosqichlarida fibrinogen kompleksi bilan bog'liq o'zgartirilgan oqsillarni RT-qPCR, Western blotting va immunohistokimyo bilan in vivo tekshirish uchun tanladik, ularning tasdiqlanishini iloji boricha aniqladik. kasallikning maqsadlari. Ushbu tanlangan oqsillarning 10 dan sakkiztasi RT-qPCR orqali mRNK darajasida tasdiqlandi (5-rasm); biri 14-bosqichda (ANXA2_P07356) va p12-guruhda (SAMP_P12246, FGL1_Q71KU9, ILK{{) yuqori tartibga solingan. 17}}O55222, S10A9_P31725, FIBB_Q8K0E8, HEMO_Q91X72, FIBA_E9PV24 va FIBG_Q8VCM7) va bittasi past p12 guruhida tartibga solinadi (HAOX2_Q9NYQ2). Qizig'i shundaki, fibrinogen guruhiga (ILK va S10A9) ko'proq masofa yoki kamroq o'zaro ta'sirga ega bo'lgan ikkita oqsilning gen ifodasi tasdiqlanmagan yagona narsa edi (5c-rasm).
Fibrinogen kompleksining yuqori regulyatsiyasi (ANXA2, SAMP, FIBB, FIBA, FIBG va HAOX2 oqsillari) Western blotting (WB) tahlili bilan qo'shimcha tasdiqlandi (6-rasm). Umuman olganda, gen ifodasi va WB SWATH-MS proteomik ma'lumotlariga juda mos edi. Va nihoyat, biz mutant va polikistik jigar namunalarida fibrinogen kompleksini immunohistokimyoviy tekshirishni ham amalga oshirdik (7-rasm). Fibrinogenning bo'yalishi kista bilan qoplangan epiteliya hujayralarida va o't yo'llarining kengayishlarida kuchli tartibga solingan (7a-rasm). Ushbu natijalar birinchi marta fibrinogen kompleksini jigar sistogenezi bilan bog'liq bo'lishi mumkin bo'lgan yo'l va PLD uchun kelajakda mumkin bo'lgan terapevtik maqsad sifatida ochadi.
Shakl 5. RT-qPCR tomonidan mumkin bo'lgan PLD maqsadlarini tekshirish. SWATH-MS maʼlumotlari bilan bogʻliq 8 dan 10 ta tanlangan maqsadning gen ifodasi. Yuqori tartibga solingan tanlangan p14 maqsadli ilova A2 (Anxa2) (a) ning RT-qPCRlari; yuqori tartibga solinadigan p12 amiloid p komponentini, sarumni (Apcs, SAMP geni), fibrinogenga o'xshash 1 (Fgl1), fibrinogen beta zanjiri (Fgb), gemoeksin (Hpx), fibrinogen alfa zanjiri (Fga), fibrinogen gamma zanjirini (Fgg) nishonga oladi. (b), integrin bilan bog'langan kinaz (Ilk) va S10{{30}} kaltsiyni bog'lovchi protein A9 (S100a9) (c); va pastga regulyatsiya qilingan p12 maqsadli gidroksi kislota oksidaz 2 (Hao2) (d). Har bir protein guruhi uchun n=6 ishlatilgan. Gapdh uy xo'jaligi geni sifatida ishlatilgan. Barlar ± SEM vositalarini ifodalaydi. Ikki dumli talabaning t-testi ishlatilgan va p <0,05 qiymati muhim deb hisoblangan. ns: ahamiyatli emas (p 0,05 dan katta yoki teng), * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
Shakl 7. Fibrinogen kompleksi kista epiteliyasida yuqori tartibga solinadi. (a, b) Safro yo'llari (yuqori panel) va jigar parenximasi (pastki panel) (a) va uning miqdoriy ko'rsatkichlari (b) da fibrinogen immunohistokimyosining vakillik tasvirlari. Har bir guruh uchun n=6 ishlatilgan. Immunohistokimyoviy tahlillar kista epiteliyasi orqali fibrinogenning yuqori regulyatsiyasini ko'rsatdi. Namunalar p12 guruhiga to'g'ri keldi. Masshtab chiziqlari 100 mkmni bildiradi. Bd o't yo'li degan ma'noni anglatadi. Barlar ± SEM vositalarini ifodalaydi. Ikki dumli talabaning t-testi ishlatilgan va p <0,05 qiymati muhim deb hisoblangan. *** p <0,001.
Wecistanche-ning qo'llab-quvvatlovchi xizmati - Xitoydagi eng yirik cistanche eksportchisi:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp% 2fTel:+86 15292862950}
Batafsil texnik xususiyatlar uchun xarid qiling:
https://ww.xjcistanche.com/cistanche-shop
