Miqdoriy proteomik tadqiqot jigar polikistik kasalligida fibrinogen yo'lini ochib beradi.
Nov 21, 2023
Annotatsiya:(1) Ma'lumot: Jigar polikistik kasalligi (PLD) o't yo'llarining kengayishi va xolangiositlardan kelib chiqqan kista rivojlanishi bilan tavsiflangan tug'ma kasalliklarning heterojen guruhidir. Shunga qaramay, sistogenez mexanizmi hozircha noma'lum va PLD davolash jigar transplantatsiyasi bilan cheklangan. Yangi va samarali terapevtik yondashuvlar zarur. Shu nuqtai nazardan, ushbu ishning asosiy maqsadi jigar sistogenez jarayonida ishtirok etadigan yangi molekulyar yo'llarni, shuningdek, yangi terapevtik maqsadlarni topishdir. (2) Usullar: SWATH-MS texnologiyasiga asoslangan miqdoriy proteomika jigar proteomalarini solishtirish orqali amalga oshirildi.Yovvoyi turva mutant/polikistik jigarlar apolikistik buyrak kasalligi(PKD) murin modeli (/cond uchun Pkd1cond; Tam-Kre−/+). (3) Natijalar: Biz ko'p miqdorda o'zgartirilgan bir nechta oqsillarni aniqladik.p-jigar sistogenezi bilan sezilarli darajada bog'liq qiymat. Keyin, biz jigar fibrinogenlariga qaratilgan klasterni aniqlaydigan boyitish va oqsil-oqsil tahlilini o'tkazdik. Nihoyat, biz RT-qPCR tomonidan tanlangan maqsadlarni tasdiqladik,Western blotting,va immunohistokimyo, miqdoriy proteomik ma'lumotlar bilan yuqori korrelyatsiyani topish va fibrinogen kompleksini tasdiqlash. (4) Xulosa: Bu ish jigarning kist kasalligida yangi molekulyar yo'lni aniqladi va fibrinogen kompleksini PLD uchun mumkin bo'lgan yangi terapevtik maqsad sifatida ta'kidladi.
Kalit so‘zlar:PLD; SWATH; miqdoriy proteomika; terapevtik maqsadlar
1.Kirish
Jigarning polikistik kasalligi(PLD) - o't yo'llarining kengayishi va xolangiositlardan (o't yo'llarining epitelial hujayralari) kelib chiqqan kista rivojlanishi bilan tavsiflangan tug'ma kasalliklarning heterojen guruhi. Ko'p sonli kistalar jigar parenximasi bo'ylab tarqaladi va rivojlanib, uning funktsiyasini buzadi [1]. PLDlar dominant yoki retsessiv shaklda meros bo'lib, alohida holda paydo bo'lishi mumkin (izolyatsiya qilingan polikistik jigar kasalligiyokiOʻngga) yoki, odatda, a sifatidabuyrakdan tashqari namoyon bo'lishiautosomalkattalardagi dominant polikistik buyrak kasalligi(PKD) [2]. Inautosomal dominant polikistik buyrak kasalligi(ADPKD), bemorlarning ~85% jigar parenximasida jigar kistalarini rivojlantiradi va uning zo'ravonligi bir necha kistadan og'ir jigar sistogeneziga qadar bo'lishi mumkin [3,4]. Ayni paytda, inautosomal retsessiv polikistik buyrak kasalligi(ARPKD), jigar kistalari rivojlanishi mumkin, ammo jigarning asosiy asorati tug'ma jigar fibrozi bilan kanal plastinkasining nuqsonli qayta tuzilishidir [5,6]. Ikkalasi uchun PLD asosiy ekstrarenal namoyon bo'lib, klinik davolash va davolashni talab qiladi [2,5]. PLD bilan og'rigan bemorlar uchun asosiy klinik yondashuv ularning klinik belgilarini kamaytirishdir. O't yo'llarining asoratlarini boshqarish nazorat qilinishi kerak bo'lgan asosiy klinik xususiyatdir va yakuniy davolash strategiyasi odatda jigar transplantatsiyasidir [7], chunki PLD uchun samarali farmakologik davolash mavjud emas [2,5]. Ko'p molekulyar yo'llar kasallik bilan bog'liq edi [8], masalan, suyuqlik sekretsiyasining ko'payishi [9,10], proliferatsiya [11], fibroz [12,13], siliyer nuqsonlar [14] va boshqalar [7,8]; ammo sistogenezning asosiy mexanizmini tushuntirish kerak. Yangi potentsial terapevtik maqsadlarni aniqlash zudlik bilan talab qilinadi. Ushbu tadqiqotlarning barchasi turli xil klassik molekulyar vositalardan foydalangan holda molekulyar tadqiqotlarga asoslangan: 3D hujayra madaniyati [7,8], immunohistokimyo [7-9,11,12], ELISA [9,11], transmissiya elektron mikroskopiyasi (TEM) [12] , immunotsitokimyo [11], RT-qPCR (miqdoriy real vaqtda PCR) [7,8,10,11] va Western blot [7,8,10-12]. Kasallikni o'rganishga yangi nuqtai nazardan yondashish, yaxshi tasdiqlangan klinik hayvonlar modellari va yangi texnologiyalardan foydalanish molekulyar kashfiyotlarni yangi davolash usullariga aylantirish uchun kasallikning yangi molekulyar mexanizmlarini ochishda foyda keltirishi mumkin.
Tandem massa spektrometriyasi (LC-MS/MS) bilan birlashtirilgan suyuqlik xromatografiyasi kasallik proteomalarini tavsiflash, shuningdek, mumkin bo'lgan kasallikning biomarkerlarini yoki dori skriningini aniqlash uchun eng ko'p qo'llaniladigan texnologiyadir [15,16]. SWATH-MS (barcha nazariy fragment-ion spektrlari-mass spektrometriyasining ketma-ket oynasi) deb nomlangan rivojlanayotgan strategiya har bir biologik namunada tahlil qilinadigan minglab oqsillar bilan qayta tiklanadigan, ishonchli, yuqori o'tkazuvchanlik miqdorini aniqlash imkonini beradi va bir vaqtning o'zida amalga oshirish imkoniyatini beradi. ko'p sonli tahlillar [16,17]. Ushbu texnologiya uchun namunalar tripsin bilan hazm qilinadi va suyuq xromatografiya orqali tahlil qilinadi va tandem massa xromatografiyasi "Ma'lumotlardan mustaqil yig'ish" (DIA) deb ataladigan rejimda ishlaydi [16] (Qarang: Materiallar va usullar). Keyingi avlod proteomikasi SWATH-MS texnologiyasi proteoma miqdorini aniqlashga va turli namunalar va sharoitlarda oqsil ko'pligidagi farqlarni aniqlashga imkon beradi.
Ushbu tadqiqotda biz mutant hayvonlar modellaridan polikistik jigar kasalligida SWATH-MS texnologiyasiga asoslangan differentsial proteomik miqdoriy tahlilni o'tkazdik. Biz turli xil boyitish tahlillari va ma'lumotlar kuratsiyasi bilan tavsiflangan differentsial oqsil ko'pligining statistik ahamiyatiga ega bo'lgan oqsillar ro'yxatini xabar qilamiz. Nihoyat, biz fibrinogen kompleksini kasallikning yangi mexanizmi va PLD uchun yangi terapevtik maqsad sifatida aniqlash va ta'kidlash orqali SWATH ma'lumotlarini tasdiqladik.
2. Materiallar va usullar
2.1. Murin modeli
Ushbu tadqiqotda biz sichqonchani Pkd1 shartli nokautli hayvon modeli, C57/BL6 k Pkd1cond/cond; Tam-Kre [18,19]. Krem sichqon modeli yovvoyi turlar (WT), Cre+ esa mutant (KO) sifatida ishlatilgan. Genotiplar tavsiflangan shartlar va primerlarga rioya qilgan holda standart PCR bilan tasdiqlandi [18]. Pkd1ni yo'q qilish har doim tug'ruqdan keyingi 10 va 11-kunlarda (p10 va p11) makkajo'xori yog'ida suyultirilgan tamoksifenni (10 mg / 40 g) (Sigma®, Sent-Luis, MO, AQSh No T5648) bir marta qorin bo'shlig'iga yuborish bilan sodir bo'ldi. (Sigma-Aldrich®, Sent-Luis, MO, AQSH No. C8267), har ikkala kun ham induktsiya qilinadigan axlatning onasida. Hayvonlar tug'ruqdan keyingi 30-kunida evtanizatsiya qilindi (p30). Guruhlar turli shaxslar tomonidan tashkil etilgan va barcha guruhlardagi erkaklar va ayollar o'rtasidagi 1: 1 nisbatda tasodifiy (tasodifiy) tashkil etilgan. Hayvonlarning jinsini aniqlash uchun anatomik xarakteristikalar ishlatilgan. Sichqonlar Santyago universitetining o'rnatilgan shartlariga ko'ra patogensiz muassasada (SPF) joylashtirilgan.
2.2. Proteinlarni ajratib olish va hazm qilish
P30 qurbonlik nuqtasida ajratilgan jigarlar -80 ◦C da saqlanadi. Suyuq azot bilan sovutilgan ohak (DD Biolab®, Barselona, Ispaniya № 088763) yordamida butun jigar suyuq azotda maydalangan bo'lib, to'qimalarning yarmi protein ekstraktsiyasiga, qolgan yarmi esa RNK ekstraktsiyasiga ajratilgan. Protein ekstraktlari RIPA lizis buferi (10 mm TRIS, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% TRITON X-100 va 1% natriy deoksixolat) bilan tayyorlangan. 1% proteaza va fosfataza inhibitörleri (Sigma® No. P8340 y No. P0044) ham qo'shilgan. Ushbu to'qima lizat santrifüjlash jarayonidan o'tdi (30 daqiqa davomida 4 ◦C va 14 000 aylanish tezligida). Keyin supernatant qayta olindi va Bradford protein tahlili (Bio-Rad® No. 5000001) yordamida miqdori aniqlandi. Protein alikvotlari (100 mkg) 10% natriy dodesil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezida (SDSPAGE) bitta bandda konsentratsiyalangan, kesilgan va yuqorida tavsiflanganidek qo'lda hazm qilish uchun topshirilgan [20]. Nihoyat, ekstrakte qilingan peptidlar keyingi tahlil qilish uchun 0,1% chumoli kislotasida eritildi.
2.3. Proteomika
2.3.1. DDA-ma'lumotlar
Bog'liq tahlil Har bir namunadan 4 µL (4 mkg dan ortiq protein) micro-LC–MS/MS yordamida ov miltig'i ma'lumotlariga bog'liq yig'ish (DDA) yondashuvi bilan tahlil qilindi. Namunalar Ekspert nLC425 micro-LC tizimi (Eksigen®, Dublin, CA, AQSH) tomonidan 3 mm zarracha oʻlchamli va 12{11}} Å gözenek oʻlchamiga ega boʻlgan YMC-TRIART C18 tutqich ustunidan foydalangan holda ajratilgan (YMC Technologies, Teknokroma, Barselona, Ispaniya) va Chrom XP C{{10}} mm × 0,30 mm, 3 mm zarracha hajmi va 120 Å gözenek o'lchami (Eksigen®) ustuni ) 10 µL/min oqim tezligida. Amaldagi erituvchilar A (suv, 0,1% chumoli kislotasi) va erituvchi B (ACN, 0,1% chumoli kislotasi) edi. Gradient 30 daqiqa davomida 5% dan 95% B gacha, 90% B da 5 minut va nihoyat, ustun muvozanati uchun 5% B da yana 5 minut, umumiy vaqt 40 minut. Birlashtirilgan massa spektrometri musbat ion rejimida ma'lumotlarga bog'liq yig'ish tizimi bilan ishlaydigan 6600 (SCIEX®, Framingham, MA, AQSH) gibrid kvadrupol-TOF massa spektrometri edi. Mass-spektrometr yordamida 400 dan 1250 m/z gacha tezlikda 250 msli tadqiqot skanerlash amalga oshirildi, so‘ngra MS/MS tajribalari 100 dan 1500 m/z gacha (25 ms olish vaqti) umumiy aylanish vaqti 2,8 soniya davomida amalga oshirildi. Parchalangan prekursorlar dinamik istisnolar roʻyxatiga 15 soniya davomida qoʻshildi, zaryadi +1 boʻlgan har qanday ion MS/MS tahlilidan chiqarib tashlandi. MS raw fayli va ma'lumotlar bazasini qidirish ProteinPilot v.5.0.1 dasturi yordamida birlashtirildi va amalga oshirildi. (SCIEX®, Framingham, MA, AQSh) sichqonchaga xos UniProt Swiss-Prot ma'lumotlar bazasidan foydalangan holda. Ruxsat etilgan modifikatsiya va tripsin hazm qilish sifatida yodoasetamid sistein alkilatsiyasini ko'rsatish kerak. Ishonch darajasi 99% dan yuqori bo'lgan peptidlar va oqsillar uchun noto'g'ri kashfiyotlar darajasi (FDR) 1 ga o'rnatildi [21].
2.3.2. Ma'lumotnomalarni yaratish
Spektral kutubxona Spektral kutubxona yuqorida ta'riflanganidek DDA usuli bilan amalga oshirildi, lekin har bir mustaqil namuna o'rniga ko'proq vakillik oqsilini olish uchun har bir namunadan 4 µL (4 mkg dan ortiq protein) bilan har bir guruhning hovuzi bajarildi. spektral kutubxonada identifikatsiya qilish. Oldingi bo'limda aytib o'tilgan protein sinov shartlaridan foydalangan holda spektral kutubxonani olish uchun barcha xom fayllar Uniprot ma'lumotlar bazasiga birgalikda ishga tushirildi.
2.3.3. SWATH va ma'lumotlarni tahlil qilish orqali miqdorni aniqlash
SWATH-MS ni olish DIA usuli yordamida amalga oshirildi. Biz har bir guruhga 4 ta biologik replikatsiya va har bir namunaga 3 ta texnik takroriy ega bo'lgan 4 ta guruhdan foydalandik (batafsil ma'lumot uchun S1-jadvalga qarang). To'qimalar tahlil qilindi va barcha holatlarda Wild Type (Pkd1cond/cond; Tam-Cre− mouse) va Mutant (Pkd1cond/cond; Tam-Cre+ sichqoncha) sharoitlarida solishtirildi. Har bir namunaga 4 mkg protein va texnik replikatsiyalar SWATH usuli yordamida bajarildi. Har bir namunalar to'plami uchun 100 ta o'zgaruvchan oynaning kengligi Sciex SWATH o'zgaruvchan oyna elektron jadvalidan foydalangan holda DDA kutubxonasida topilgan ion zichligiga muvofiq optimallashtirildi. Shuning uchun, SWATH usuli 100TOF MS/MS skanerlarini (400 dan 1500 m/z gacha, yuqori sezuvchanlik rejimi, 50 ms olish vaqti) kenglikdagi ketma-ket bir-biriga mos keladigan prekursor o'zgaruvchilari izolyatsiya oynalarini olishdan iborat takrorlashlar tsikliga asoslangan edi. Har bir tsikl uchun oldingi TOF MS skanerlashi (400 dan 1500 m/z gacha, 50 ms olish vaqti) bilan 400 dan 1250 m/z gacha bo'lgan massa diapazonini qamrab oluvchi (1 m/z qoplama). Umumiy aylanish vaqti 6,3 s ni tashkil etdi.
2.3.4. Ma'lumotlarni tahlil qilish
ProteinPilot tomonidan FDR 1% dan past bo'lgan ion kutubxonasidagi barcha oqsillar SWATH usuli bilan aniqlangan. Alohida namunalar olingandan so'ng, spektral moslashtirish va maqsadli ma'lumotlarni olish PeakView v.2.2 tomonidan amalga oshirildi. (SCIEX®, Framingham, MA, AQSh) quyida tavsiflanganidek mos yozuvlar spektral kutubxonasiga mos keladi [22-26]. Har bir oqsil uchun tanlangan peptidlarni saqlash vaqtlari har bir namunada mavjud bo'lgan iRT peptidlariga muvofiq har bir ishda o'zgartirildi va butun vaqt o'qi bo'ylab elutsiya qilindi. Keyin olingan ion xromatogrammalari tanlangan fragmentning har bir ioni uchun yaratildi; peptidlar uchun eng yuqori joylar tegishli bo'laklar ionlarining tepalik joylarini qo'shish orqali olingan. PeakView Xromatografik va spektr komponentlariga muvofiq har bir tayinlangan peptid uchun FDR va ballni hisoblab chiqdi; oqsil miqdorini aniqlash uchun faqat FDR 5% dan past bo'lgan peptidlar ishlatilgan. Xuddi shunday, signal intensivligi funktsiyasi sifatida oqsil miqdorini aniqlash uchun maydonlarni olish uchun har bir protein uchun 10 tagacha peptid va peptid uchun etti bo'lak tanlangan. Barcha umumiy va o'zgartirilgan peptidlar qayta ishlashdan chiqarildi. Ion xromatogrammalarini olish uchun besh daqiqali oynalar va 30 ppm kengligi ishlatilgan.
2.3.5. Signal yo'lini tahlil qilish
Eng mos o'zaro ta'sir tarmoqlari, tegishli yo'llar yoki uyali komponentlar va boshqa bog'langan oqsillar yoki yo'llarni baholash uchun differentsial ifodalangan oqsillar yordamida turli funktsional tahlillar o'tkazildi. UniProt oqsiliga kirish raqamlari (https://www.uniprot.org/, 2021 yil 28-avgust) ishlatilgan. Proteinlar ko'pligidagi farqlarga ega bo'lgan oqsillar: String® (https://string-db.org/, 2021 yil 25 oktyabr) Gen Ontologiyasi (GO) atamalari va FunRich® (http://funrich.org/index.html) yordamida o'tkazildi. , 21 oktyabr 2021 yil) oqsil tarmoqlari va oqsillar orasidagi biologik bog'lanishni o'rganish; va Reactome® (https://reactome.org/, 2021 yil 25 oktyabr) sezilarli darajada ifodalangan oqsillar bilan bog'lanish yoki o'zaro ta'sir qilish yo'llarini o'rganish uchun.
2.4. Gistologiya va Kistik indeksni o'lchash
Hayvonlar jigarining eng katta bo'lagi har doim paraformaldegidda (4% paraformaldegid buferli eritmasi, pH=7, laboratoriya № FORM-D0P-10K) tun davomida 4 da mahkamlangan. ◦C. Keyin jigarlar ksilen va etanol bilan suvsizlangan va nihoyat kerosinga solingan. 4,5 mkm bo'lgan tasavvurlar yig'ildi. Gematoksilin-eozin (HE) va Masson trixrom bo'yash uchun standart protokollar ishlatilgan.
Miqdorlarni aniqlash uchun jigarning eng katta bo'lagining bo'ylama bo'laklarining slaydlari har doim reprezentativ tasvirlar sifatida olingan va Olympus Camera DP70 ga ulangan Olympus BX51 mikroskopi ostida tasvirlangan har bir hayvon uchun kamida oltita turli bo'limlar miqdorini aniqlash uchun ishlatilgan. kist indeksi va bir qator kistlar. Ikkala parametrning miqdori yuqorida tavsiflanganidek CystAnalyser (https://citius.usc.es/transferencia/software/cystanalyser, 2020-yil 1-iyul) deb nomlangan kistani avtomatik aniqlash dasturiy vositasi bilan hisoblab chiqilgan [35].
2.5. Klinik kimyo
Qon evtanaziyadan oldin to'plangan va sarum BD Vacutainer SST II Advance naychalari yordamida olingan. Sarum alanin transaminazasi (ALT) va gidroksidi fosfataza (ALP) ADVIA 2400 Kimyo tizimi (Siemens Healthineers, Erlangen, Germaniya) yordamida o'lchandi.
2.6. RNK ekstraktsiyasi
RNK ilgari ta'riflanganidek [36] TRIzol protokoli (TRI Reagent, Sigma®, Sent-Luis, MO, AQSh, № T9424) yordamida ajratilgan, unda xloroform (Sigma® No. C2432) hujayralar uchun denaturatsiya qiluvchi vosita sifatida xizmat qilgan. va izopropanol (Sigma® No. 650447) RNK uchun cho'ktiruvchi vosita edi. Cho'kma DEPC suvida suyultirildi (Ambion®, Ostin, TX, AQSh, № AM9920), shuningdek, 1% SUPERaseIn RNase inhibitori (Thermo Fisher®, Waltham, MA, AQSh, № AM2694) mavjud.
2.7. Haqiqiy vaqtda miqdoriy PCR
Bir mikrogram umumiy jigar RNKsi DNase I (Invitrogen®, Carlsbad, CA, AQSH, № 18068015) bilan ishlov berildi. Keyin SuperScript® III Birinchi strand sintez tizimi to'plami (Invitrogen®, № 18080051) bilan teskari transkripsiya va FastStart Universal SYBR GREEN Master (ROX) (Roche® № 049139140) yordamida real vaqtda miqdoriy PCR orqali gen ekspressiyasi tahlili amalga oshirildi. ) Mx3005P tizimida (Agilent Technologies®, Santa Clara, CA, AQSH). Ushbu tadqiqot uchun foydalanilgan primerlar Primer 3 Plus (http://tiny.cc/pf928y, 2020-yil 11-mart) bilan ishlab chiqilgan va Ensembl genom brauzerida chop etilgan cDNK mos yozuvlar ketma-ketligiga asoslangan (http://www.ensembl.org). /index.html, 2020 yil 11 mart). Tadqiqotda foydalanilgan barcha primerlarning to'liq ketma-ketligi S2-jadvalda keltirilgan. Barcha to'liq PCR reaktsiyalari uchun quyidagi dastur ishlatilgan: 95 ◦C da 30 soniyali denatürasyon bosqichi; 95 ◦C da 30 s, 60 ◦C da 1 min va 72 ◦C da 30 sekundlik 45 tsikl; keyin sovutish bosqichi. Oldinroq [36] qilganimizdek, har bir tajribada har bir namuna (har bir guruh uchun n=6) uch nusxada bajarildi. Natijalar mutlaq miqdoriy aniqlash usuli orqali tahlil qilindi. Shunday qilib, tahlilda ma'lum konsentratsiyali standart egri chiziq ishlatilgan va qo'shimcha ravishda har bir namuna doimiy ekspressiya geniga normallashtirildi. Ushbu tadqiqotda Gapdh geni (glitseraldegid{24}}fosfatdehidrogenaza) uyni saqlash geni sifatida ishlatilgan.
2.8. Western Blotting
Western blotting tahlillari butun jigar lizatlarida o'tkazildi. Jami oqsil miqdori Bradford protein tahlili (Bio-Rad®, Hercules, CA, AQSH, № 5000001) yordamida aniqlandi va har bir oqsilning bir xil miqdori (20–30 mkg) 95 ◦C da 5 daqiqa qaynatiladi va 10% SDS-PAGEda reduksiya sharoitida ajratiladi. Protein molekulyar og'irligi standarti sifatida PageRulerTM Prestained Protein Ladder (Thermo Fisher®, Waltham, MA, AQSH, № 26616) ishlatilgan. Keyinchalik, oqsillar nitrotsellyuloza membranalariga o'tkazildi (Bio-Rad® No. 1620115). Nonspesifik bog'lanishning oldini olish uchun membranalar fosforlangan oqsillar uchun 2,5% BSA eritmasi (NZYTech®, Lisboa, Portugaliya, No. MB046) yoki SuperBlock Blocking Bufer (Thermo Fisher®, Waltham, MA,) yordamida xona haroratida 1 soat davomida bloklandi. AQSh, № 37515). Keyinchalik, membranalar birlamchi antikorlar bilan kechasi 4◦C da inkubatsiya qilindi va keyin PBS da 0,3% Tween-20 bilan yuvildi. Nihoyat, nitrotsellyuloza membranalari HRP bilan bog'langan ikkilamchi antikorlar bilan xona haroratida 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Signallar oldin SuperSignal™ West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate to'plami (Thermo Fisher®, Waltham, MA, AQSH, № 34580) yoki PierceTM ECL Western Blotting Substrate to'plami (Thermo Fisher®, Waltham, MA, AQSh № 32109) bilan ishlab chiqilgan. ChemiDoc™ Imaging tizimida vizualizatsiya qilish uchun (Bio-Rad®, Hercules, CA, AQSh). Protein guruhlari ImageJ® Lab dasturi yordamida aniqlangan (v 4.0.1, https://imagej. nih.gov/ij/, 2021 yil 26 mart). Protein densitometriyasi darajalari uy-ro'zg'or oqsillari GAPDH yoki -ACTIN uchun normallashtirildi. Har bir guruh uchun. Barcha tajribalarda N=6 ishlatilgan.
Western bloting uchun quyidagi asosiy antikorlar qo'llaniladi: anti-ANXA2 (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, AQSH #sc-28385), antikor -SAMP (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, AQSH, No. sc-393948), anti-FIBB (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, AQSh, № sc-271035), anti-FIBA (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, AQSH, № sc-398806), anti-FIBG (1:500) , Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, AQSH, № sc-133157), anti-HAO2 (1:1000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, AQSh, № 113442), anti-GAPDH (1:1000, Cusabio®, Xyuston, TX, AQSH, № CSB-RA009232A0HU) va anti- -ACTIN (1:1000, Cell Signaling Technology®, Danvers, MA, AQSh, № 8457), kabi shuningdek, ikkilamchi antikor Echkiga qarshi quyonga qarshi IgG HRP (1:5000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, AQSh, № 31460) yoki echkiga qarshi sichqonchaga qarshi IgG HRP (1:5000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, AQSh, № 31430).
2.9. Immunogistokimyo va miqdoriy aniqlash
Immunohistokimyo uchun natriy sitrat buferi pH=6 (Agilent Dako®, Glostrup, Daniya № S2369) antigen olish uchun ishlatilgan va to'qimalar antikor seyreltici (Agilent Dako® No. K8006) bilan bloklangan. Immunohistokimyoviy tahlil uchun antikor fibrinogen (Agilent Dako® No. A0080) va immunodeteksiya uchun HPR-konjugatsiyalangan aniqlash tizimi ishlatilgan. Nihoyat, immunohistokimyoning miqdorini aniqlash Fiji-ImageJ® dasturidan (https: //imagej.net/software/fiji/, 2021-yil 13-oktabr) "Split channels" funksiyasi (yashil kanal) yordamida amalga oshirildi. Har bir namuna uchun n 6 dan katta yoki unga teng tasvir ishlatilgan.
2.10. Statistik tahlil
Data are presented as means ± SEM for all cases (bar or point plots). First, normal distribution was confirmed using the Kolmogorov–Smirnov test. A two-tailed t-test was used to determine the significance of differences between two groups. p < 0.05 was considered statistically significant. Furthermore, ** corresponds to p-values < 0.01 and *** to p-values < 0.001. All datasets were analyzed using GraphPad Prism software (version 9, https://www.graphpad.com/, 13 October 2021). For proteomic studies, a Student's t-test (using MarkerView software, 22 December 2017) was performed to compare the groups in pairs to identify proteins, which were significantly differentially represented using adjusted p-value < 0.05 (multiple correction FDR method) and fold change >2 kesish sifatida. Namunalardagi ma'lumotlarni solishtirish uchun asosiy komponentlar tahlili (PCA) yordamida nazoratsiz ko'p o'zgaruvchan statistik tahlil o'tkazildi.
Wecistanche-ning qo'llab-quvvatlovchi xizmati - Xitoydagi eng yirik cistanche eksportchisi:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp% 2fTel:+86 15292862950}
Batafsil texnik xususiyatlar uchun xarid qiling:
https://ww.xjcistanche.com/cistanche-shop
