Makrofagda FPR2 ni inhibe qilish orqali izoliquiritigeninning sisplatin bilan bog'liq o'tkir buyrak shikastlanishiga renoprotektiv ta'siri

Qoʻshimcha maʼlumot olish uchun quyidagi manzilga murojaat qiling: ali.ma@wecistanche.com

Tan Rui-Zhi va boshqalar

Buyrak kasalliklarini davolash uchun Cistanche-ga bosing

Abstrakt

O'tkir buyrak shikastlanishi (AKI) og'ir bemorlarda jiddiy asoratdir. To'plangan dalillar makrofaglarning yallig'lanishga qarshi muhim rol o'ynashini ko'rsatdiO'tkir buyrak shikastlanishiva izoliquiritigenin (ISL) makrofagik yallig'lanishni inhibe qilishi mumkin, ammo uning roliO'tkir buyrak shikastlanishiva asosiy mexanizm noma'lum. Ushbu tadqiqot ISL ning AKI ga renoprotektiv ta'sirini va bu jarayonda Formilpeptid retseptorlari 2 (FPR2) rolini o'rganishga qaratilgan. Ushbu tadqiqotda in vivo va in vitro tajribalarini o'tkazish uchun sisplatin bilan induktsiya qilingan AKI modeli va lipopolisakkaridlar bilan bog'liq makrofaglarning yallig'lanish modeli ishlatilgan. Natijalar ISL kuchli yengillashganini ko'rsatdibuyrak shikastlanishiva in vivo buyrak yallig'lanishini inhibe qiladi va in vitro makrofagik yallig'lanish reaktsiyasini bostiradi. Muhimi shundaki, FPR2 AKI va LPS tomonidan qo'zg'atilgan makrofagda nazorat guruhiga nisbatan sezilarli darajada yuqori tartibga solingan, holbuki u ISL tomonidan kuchli bostirilgan. Qizig'i shundaki, pcDNA3 transfeksiyasi bilan FPR2 ning haddan tashqari ifodalanishi.1-FPR2 makrofaglarda ISL ning yallig'lanishga qarshi ta'sirini samarali ravishda bekor qildi, bu FPR2 yallig'lanishning oldini olish va yaxshilash uchun ISL uchun potentsial maqsad bo'lishi mumkinligini ko'rsatdi.buyrak shikastlanishiningO'tkir buyrak shikastlanishi. Birgalikda bu topilmalar ISL sisplatin ta'sirida yaxshilanganligini ko'rsatdibuyrak shikastlanishiFPR2 ni inhibe qilish orqali makrofagik yallig'lanish ishtirok etadi, bu AKI uchun potentsial terapevtik variantni ta'minlaydi.

1.Kirish

O'tkirbuyrakshikastlanish (AKI) keng tarqalgan og'ir turidirbuyrako'lim darajasi yuqori bo'lgan kasallik.1 Bu 7 kun yoki undan kamroq vaqt ichida sodir bo'ladigan buyrak funktsiyasining tez pasayishi bilan tavsiflanadi. Oxirgi nashrlar OKI bilan kasallanish darajasi statsionar bemorlarning 5 foizini va og'ir bemorlarning 30 foizini tashkil qiladi vaAKIhar yili dunyo bo'ylab 2 million kishining o'limiga sabab bo'ladi, bu global sog'liq muammosiga aylandi. Garchi ta'rif oddiy va bir xil bo'lsa-da, AKI turli sabablarga ko'ra yuzaga kelishi mumkin, jumladan, nefrotoksik dorilarni qabul qilish, ishemiya-reperfuzion shikastlanish (ishemiya-reperfuzion shikastlanish, IRI), sepsis, yurak-qon tomir jarrohligi, gipertoniya va diabet.2,3 Eski. yoshi, qandli diabet va yurak yetishmovchiligi AKI xavfini oshiradi, bu odatda ba'zi bemorlarda qaytarilmas surunkali buyrak kasalligi (CKD) va oxirgi bosqich buyrak kasalligi (ESRD) ga olib keladi.4 Ta'kidlash joizki, tadqiqotlar deyarli barcha immunitet hujayralari ishtirok etishini ko'rsatdi. AKIda buyrakning immun yallig'lanishida.5 Ular orasida makrofaglar buyrak yallig'lanishini rag'batlantirishda muhim rol o'ynashi ko'rsatilgan.6 Makrofaglarni yo'q qilish AKI buyrak shikastlanishi va yallig'lanishini yaxshilaydi.7 Shuning uchun makrofagik yallig'lanishni samarali inhibe qilish uchun foydali bo'lishi mumkin. AKIni boshqarish uchun mavjud terapevtik yondashuvlarni takomillashtirish.

Izoliqiritigenin (ISL) - kalkon tuzilishiga ega flavonoid bo'lib, uning ildizi mashhur an'anaviy xitoy o'simliklari tabobatida joylashgan.8 So'nggi yillarda u antioksidant, yallig'lanishga qarshi, trombotsitlarni to'plashga qarshi, antibakterial ta'siri tufayli olimlarning e'tiborini tortdi. , virusga qarshi, shishlarga qarshi, gepatoprotektiv, neyroprotektiv, yurak himoyasi va detoksifikatsiya xususiyatlari.9 ISL hujayra proliferatsiyasini inhibe qilish, ROSni kamaytirish va apoptoz, nekrotik va saraton hujayralarining turli darajada o'limini keltirib chiqarishi ko'rsatilgan.10 Yaqinda hisobotlar shuni ko'rsatdiki, izoliquiritigenin RAW264.7 makrofaglarida LPS ning lipid A qismi tomonidan induktsiya qilingan IL-6 va TNF-a ishlab chiqarishni inhibe qilishi va LPS-TLR4/MD-2 kompleksining shakllanishini susaytirishi mumkin. Bundan tashqari, ISL ROS vositachiligidagi MAPK, STAT3 va NF-kB signalizatsiya yo'llari orqali HepG2 hujayra apoptozini qo'zg'atishi mumkin.11 Eksperimental dalillar, shuningdek, ISL ROS vositachiligidagi ichki faollashuvni keltirib chiqarishini va mitoxondrial-sitoxrom c-sisteintaza mexanizmini faollashtirishini ko'rsatdi. PC{22}} hujayra apoptozi. Shuni ta'kidlash kerakki, ISL ko'pincha ayollar uchun parhez qo'shimchasi sifatida ishlatiladi.12 Yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, ISL AKIga sezilarli yallig'lanishga qarshi ta'sir ko'rsatadi, ammo ta'sir qilishning o'ziga xos mexanizmi hali ham aniq emas.

Bizning jamoamizning oldingi tadqiqotlari shuni ko'rsatdiki, makrofaglar tomonidan qo'zg'atilgan C-tipli lektin Mincle buyrak yallig'lanishida ishtirok etadigan transmembran naqshni aniqlash retseptoridir13, bu orqali biz Mincle bilan ma'lum bir aloqaga ega bo'lgan formil peptid retseptorlari 2 (FPR2) ni tekshirdik. GEO ma'lumotlar bazasi. Biroq, uning o'tkir buyrak kasalligidagi roli tasdiqlanmagan. FPR2 oqsil kodlovchi gen bo‘lib, u G oqsili bilan bog‘langan retseptorlari oilasiga mansub va 351 ta aminokislota qoldig‘ini o‘z ichiga oladi.14,15 Ular 7- transmembran G oqsili bilan bog‘langan retseptorlari bo‘lib, immunitetni tartibga solish, yallig‘lanish omillari sekretsiyasi, turli kasalliklarning paydo bo'lishi va rivojlanishi bilan chambarchas bog'liq bo'lgan hujayra xemotaksisi va hujayra yopishishi.16 Uning FPR1 va FPR3 bilan homologiyasi 69 foiz va 83 foizni tashkil qiladi. FPR2 subhujayralari hujayra membranasida joylashgan va ko'p o'tishli membrana oqsillaridir. Ular asosan neytrofillar, eozinofillar, monotsitlar, epitelial hujayralar, fibroblastlar, glial hujayralar, mezangial hujayralar va boshqalarda ifodalanadi, o'pka, taloq va jigar kabi turli organlarda tarqalgan. Shunisi e'tiborga loyiqki, FPR2 yallig'lanish hujayralari joylashgan buyrak oraliqlarida17 ko'p miqdorda ifodalanadi. FPR2 ning asosiy vazifasi yallig'lanishni bostirish va yo'q qilishda ushbu metabolitlarning faolligiga vositachilik qilish uchun ma'lum ixtisoslashtirilgan parchalanishni rag'batlantiruvchi vositalarni (SPM) birlashtirishdir. Biroq, FPR2 ning AKI yallig'lanishidagi roli va uni dori aralashuvi uchun maqsad sifatida ishlatish mumkinmi yoki yo'qmi hali noma'lum.

Ushbu tadqiqotda biz nefrotoksik preparat - sisplatin bilan qo'zg'atilgan sichqonchaning AKI modeli va LPS tomonidan qo'zg'atilgan yallig'lanish hujayralari modelini qo'lladik, ISL ning AKIda buyraklarning shikastlanishi va yallig'lanishiga ta'sirini, shuningdek, FPR2 ning buyrak yallig'lanishidagi asosiy rolini o'rganish uchun. va AKIni ISL davolash. Ushbu tadqiqot yallig'lanish shikastlanishi mexanizmini va AKI uchun davolash strategiyasini tushunish uchun yangi yo'nalishlarni beradi.

2. Materiallar va usullar

2.1. Giyohvand moddalar

Isoliquiritigenin (purity>98 foiz) qizilmiya ildizidan olingan izoflavon birikmasidir. Uning molekulyar formulasi C15H12O4. Ushbu tadqiqotda Chengdu Bio purify Phytochemicals Ltd. (BP0787) dan 10 foiz DMSO (ST038, Beyotime, Xitoy) da eritilgan izoliquiritigenin sotib olindi va sisplatin qo'zg'atgan sichqonlar 7,5 mg / kg dozada oshqozonga yuborildi va /kg, mos ravishda.

2.2. BMDM izolyatsiyasi

BMDM hujayralarini ajratish uchun yoshi 6e8 hafta bo'lgan C57BL/6 erkak sichqonlari tanlangan. Orqa oyoq suyagini femurdan ehtiyotkorlik bilan ajratib oling va biriktirilgan mushaklarni olib tashlang. Suyaklarning rangi qizildan oqgacha o'zgarmaguncha PBSda suyaklarni ohak bilan maydalang. Keyinchalik, supernatantni to'plang va 70 li süzgeç orqali filtrlang, so'ngra 5 daqiqa davomida 1500 aylanish tezligida santrifüj qiling. Eritrositlar filtrlangan suyuqlikda 10 - PBS bilan sindirildi, so'ngra 40 mm hujayrali filtrda filtrlandi. Olingan hujayralarni 10 sm kultura idishida inkubatsiya qiling va 7 kun davomida 30 foiz L929 supernatant bilan induktsiya qiling. Yallig'lanish hujayralari modelini yaratish uchun BMDM hujayralari 100 ng / ml LPS bilan rag'batlantirildi.

2.3. BMDMda FPR2 ning nokaut va haddan tashqari ifodalanishi

FPR2 Zeta LifeAdvanced Transfection Reagent (AD600050, Zeta life, AQSH) va FPR2 siRNA dan BMDM ga (FPR2 siRNA ning ketma-ketligi: Sense, 5'-GGAGAUGUGUAUUGUACAUTT-3'AGUACAUTT-3''Aense; CAUCUCCTT-3'. Sangon Biotech, Xitoy). Xuddi shunday, pcDNA3.1-FPR2plazmid (Fenxuy Biotech, Xitoy tomonidan yaratilgan) hujayralardagi FPR2 ni ortiqcha ifodalash uchun ZETA bilan BMDM ga transfektsiya qilindi.

2.4. Hayvonlar tajribalari

Hayvonlar ustida o'tkazilgan barcha tajribalar Janubi-G'arbiy Tibbiyot Universitetining Etika qo'mitasi ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi. ChengduDaShuo Animal Co., Ltd kompaniyasidan 32 ta erkak C57BL/6 sichqonlari sotib olindi, ular tasodifiy ravishda 4 guruhga bo'lingan: sham guruhi, model guruhi (Cisplatin tomonidan qo'zg'atilgan AKI guruhi), ISL past dozali guruhi (7,5 mg / kg, L guruhi), va yuqori dozali guruh (30 mg/kg, H guruhi). Model guruhiga birinchi kuni 20 mg/kg sisplatin (P4394, Sigma-Aldrich, AQSH) AOK qilingan, past dozali guruhga 7,5 mg/kg ISL va yuqori guruhga 3 kun davomida 30 mg/kg ISL berilgan. . 3 kundan so'ng, qurbonlik qilingan sichqonlardan sarum va buyraklar yig'ildi.

2.5. Buyrak funktsiyasi testi

Har bir sichqon guruhining sarumini to'plagandan so'ng, sarum kreatinin (C011-2-1, Jiancheng Biotech, Xitoy) va karbamid azot (C013-2-1, Jiancheng Biotech, Xitoy).

2.6. Patologik bo'yash

H&E bo'yash: Bo'limni muntazam dewakslash va regidratatsiya, 5 daqiqa davomida gematoksilin bilan bo'yash, RO suv bilan yuvish, 2 soniya davomida 1 foizli xlorid kislota spirtini ajratish, musluk suvi bilan yuvish, 2 soniya davomida 75 foiz etanolga botirish, 30 foiz davomida spirtda eriydigan eozin , musluk suvi chaying, 100% etanol 1 daqiqa davomida suvsizlang, quruq, ksilen shaffof 10 daqiqa, quruq, neytral balzam o'rnatish vositasi bilan muhrlang (36313ES60, Yepsen, Xitoy).

PAS bo'yash: bo'laklar 5e8 daqiqa davomida xona haroratida davriy kislota eritmasiga joylashtirildi, so'ngra ikki marta RO suv bilan yuvildi. Keyin, bu bo'laklarni Shiff reagentiga 10-20 daqiqaga qo'ying, 10 daqiqa davomida musluk suvi bilan yuvib tashlang, gematoksilinda 1,2 daqiqa davomida bo'yalgan, suvsizlangan va 100% spirtda shaffof, quruq, neytral balzam o'rnatish muhiti bilan yoping.

2.7. Immunofluoresans

Muzlatilgan to'qimalarni PBSga joylashtiring, ikki marta yuving, 10 foizli formaldegid bilan 10 daqiqa davomida mahkamlang. Bo'limlardagi to'qimalar 30 daqiqa davomida 5 foizli echki zardobi bilan bloklandi, so'ngra asosiy sichqonchaga qarshi FPR2 (1:200, sc-57141, Santa Kruz, AQSh) va kalamushlarga qarshi F4/80 bilan inkubatsiya qilindi. antikorlar (1:200, sc-52664, Santa Kruz, AQSH) kechada 4 - C da. Ertasi kuni bo'limlarni ikki marta PBS bilan yuving, xona haroratida 1 soat davomida ikkilamchi antikor (1: 200) bilan inkubatsiya qiling va yadroni DAPI bilan bo'yab tashlang. Rasmlar EVOS tizimi tomonidan olingan.

2.8. Elisa

Sarum va hujayra supernatantidagi IL{0}}b, IL-6, TNF-a kontsentratsiyasi to'plam ko'rsatmalariga muvofiq ELISA to'plamlari (EMC001B, EMC004, EMC102A, Neobioscience, Xitoy) yordamida tahlil qilindi.

2.9. Real vaqtli PCR

Jami RNK ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga rioya qilgan holda RNK ekstraksiya to'plami (Tyangen, Xitoy) yordamida chiqarildi. Ekstraksiya qilingan RNKni cDNKga teskari transkripsiya qilgandan so'ng, uni 1{7}} ml reaktsiya tizimiga qo'shib, Roche LightCycler 480 tizimi va reaksiya tizimi tomonidan real vaqtda PCRni amalga oshirish uchun quyidagicha bo'ladi: Eastep® qPCR MasterMix 2 -, 5 ml; cDNK shabloni, 1 ml; yuqori oqim primeri (10 mM), 0,5 ml; quyi oqim primeri (10 mM), 0,5 ml; Nukleazsiz suv, 3 ml. Ushbu tajribada foydalanilgan primerlar Sangon (Shanxay, Xitoy) tomonidan sintez qilingan va barcha primerlarning ketma-ketligi 1-jadvalda keltirilgan.

2.10. G'arbiy dog'

RIPA lizis buferi buyrak to'qimalari va BMDM hujayralaridan oqsil olish uchun ishlatilgan. Proteinni 10% SDS-PAGEgelda eritib, PVDF membranasiga o'tkazgandan so'ng, membranani 5% BSAda 1 soat davomida blokirovka qiling va 3 marta TBST bilan yuving, so'ngra membranani bir kechada 4 - C da birlamchi antikorlar bilan inkubatsiya qiling (tayyorlangan) 5 foiz BSA bilan, 1: 1000). Keyin membranalar ikkilamchi antikor bilan inkubatsiya qilindi (Peroksidaza bilan konjugatsiyalangan echki sichqonchaga qarshi IgG (ZB-2305, 1:3000), echki quyonga qarshi IgG (ZB-2301, 1:3000)) xona haroratida 1 soat. Tasvirlar jel tasvirlash tizimi (BIORAD, AQSh) tomonidan olingan. Tarmoqlarning kulrang intensivligi Image J dasturi tomonidan hisoblab chiqilgan.

2.11. Statistik tahlil

Natijalar o'rtacha ± standart og'ish sifatida ko'rsatilgan. Ma'lumotlar tahlili bir tomonlama ANOVA testi, so'ngra SPSS 21 dasturiy ta'minotidan foydalangan holda LSD testi bilan ko'p taqqoslash orqali amalga oshirildi.0. P < 0.05="" statistik="" jihatdan="" ahamiyatli="" deb="" topildi.="" har="" bir="" tajriba="" guruhi="" 3="" marta="">

3. Natijalar

3.1. Izolikiritigenin sisplatin tufayli buyrak shikastlanishini yaxshilaydi va buyrak yallig'lanishini inhibe qiladi.

AKIda izoliquiritigeninning renoprotektiv va yallig'lanishga qarshi ta'sirini o'rganish uchun biz har bir guruhning sarum Cre va BUN darajalarini, shuningdek, real vaqt rejimida PCR va Elishay orqali yallig'lanish sitokinini ifodalash va sekretsiyasini aniqladik. Bundan tashqari, buyrak patologiyasi H&E va PAS bo'yash bilan o'lchandi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, normal guruh bilan solishtirganda, AKI modelida sarum Cre va BUN darajalari ko'tarilgan, 7,5 mg / kg yoki 30 mg / kg ISL bilan davolash zardobdagi Cre va BUN darajasini sezilarli darajada kamaytirdi, shu jumladan. , 30 mg/kg dozasi eng yaxshi terapevtik ta'sirga ega (1A va B-rasm). Shunisi e'tiborga loyiqki, 30 mg / kg ISL, baholangan quvurli nekroz foiziga ko'ra, buyrak naychalari shikastlanishini yaxshilashi mumkin (1C-rasm). Elishay va PCR natijalari shuni ko'rsatdiki, IL{10}}b, IL-6 va TNF-a sekretsiyasi ISL (7,5 mg/kg va 30 mg/kg) aralashuvidan keyin va mRNK ifodasi pasaygan. IL-1b, IL-6 va TNF-a ham 30 mg/kg ISL qo‘llash orqali sezilarli darajada kamaydi (1DeI-rasm). Boshqa tomondan, H&E va PAS bo'yash natijalari shuni ko'rsatdiki, AKI guruhidagi buyrak jiddiy buyrak naychalari shikastlanishi, buyrak epiteliyasining to'kilishi, mezangial hujayralar va mezangial interstitsial giperplaziya va yallig'lanish hujayralari infiltratsiyasi, hayratlanarli darajada 30 mg / kg ISL AKIda buyrak shikastlanishini samarali tarzda bartaraf etishi mumkin (1J-rasm). Barcha natijalar shuni ko'rsatdiki, 7,5 mg / kg va 30 mg / kg ISL qo'llash sisplatin bilan bog'liq buyrak shikastlanishini yaxshilashi va buyrak yallig'lanishini inhibe qilishi mumkin, bunda 30 mg / kg ISL eng yaxshi ta'sir ko'rsatadi.

3.2. Isoliqiritigenin AKI sichqonlarining makrofaglarida FPR2 ifodasini kamaytirdi

Oldingi ko'plab hisobotlar FPR2 immun javob va yallig'lanish bilan bog'liq kasalliklarda muhim rol o'ynashini ko'rsatdi. Biroq, FPR2 ning AKI buyraklariga potentsial ta'siri aniqlanmagan. Ushbu tadqiqotda biz FPR2 va makrofaglarni (F4/80, makrofaglar ishlab chiqaruvchisi) birgalikda joylashtirish uchun immunofluoressensiyani amalga oshirdik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, makrofaglar (yashil dog'lar) AKI sichqonlarining buyragiga ko'p miqdorda infiltratsiya qilingan, shu bilan birga, FPR2 (qizil dog'lar) F4/80 bilan birga joylashgan bo'lib, bu FPR2 asosan makrofagda ifodalanganligini va FPR2 darajasi sezilarli darajada ekanligini ko'rsatdi. AKI sichqonlarining buyragida ko'paygan (2A-rasm). Bundan tashqari, biz FPR2 mRNK va yallig'lanish bilan bog'liq oqsillarni real vaqtda PCR va buyrakda g'arbiy blotting orqali ifodalanishini aniqladik va natijalar 30 mg / kg ISL FPR2 ning mRNK va oqsil darajasini samarali ravishda kamaytirishi mumkinligini ko'rsatdi. AKI sichqonlarining buyragi 7,5 mg / kg ISL guruhi bilan solishtirganda (2B, G, H-rasm). Muhimi, western blotting natijalari shuni ko'rsatdiki, 30 mg/kg ISL ham p-65 faollashuvini inhibe qilgan va TNF-a, IL-6 va IL{{28} protein darajasini pasaytirgan. }b AKI sichqonlarining buyragida (2CeF-rasm). Yuqoridagi barcha ma'lumotlar ISL AKI sichqonlarining buyrak yallig'lanishini engillashtiradigan makrofaglarda FPR2 ifodasini kamaytirish bilan bog'liq bo'lishi mumkinligini ko'rsatdi.

3.3. Izoliquiritigenin FPR2 va yallig'lanish sitokinlarining ekspressiyasini va sekretsiyasini LPS tomonidan qo'zg'atilgan BMDM hujayralarida bostirdi.

ISL ning LPS-induktsiyali BMDM hujayralariga ta'sirini qo'shimcha aniqlash uchun biz real vaqtda PCR va Elishay orqali ISL qo'llanilgandan so'ng, FPR2 ning mRNK darajasini, ekspressiyasini va yallig'lanish sitokinlarini LPS bilan induktsiyalangan BMDM hujayralarida sekretsiyasini tekshirdik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, ISL FPR2, IL{5}}b, IL-6 va TNF-a ning mRNK darajasini (3AeD-rasm), shuningdek, IL-1b sekretsiyasini pasaytirgan. , IL{10}} va TNF-a LPS bilan induktsiyalangan BMDM hujayralarida hujayra supernatantida (3EeG-rasm). Yuqoridagi natijalar shuni ko'rsatdiki, ISL ni 40 mM konsentratsiyasi bilan davolash LPS tomonidan qo'zg'atilgan BMDM hujayralarida yallig'lanishni kuchli inhibe qilgan.

3.4. Izolikiritigenin FPR2 oqsil darajasini va LPS tomonidan qo'zg'atilgan BMDM hujayralarida yallig'lanish sitokinlarini pasaytirdi.

Shuningdek, western bloting orqali ISL qo'llanilgandan so'ng LPS tomonidan qo'zg'atilgan BMDM hujayralarida FPR2 va yallig'lanish sitokinlarining protein darajasini aniqladik. Ma'lumotlar shuni ko'rsatdiki, nazorat guruhi bilan solishtirganda, FPR2, p-p65, IL -6 va TNF-a ning protein darajalari LPS tomonidan qo'zg'atilgan BMDM hujayralarida sezilarli darajada oshgan va 40 mM ISL administratsiyasi bilan kuchli pasaygan ( 4AeE-rasm). Ushbu natijalar yana shuni ko'rsatdiki, ISL NF-kB faollashuvini bostirishi va LPS tomonidan qo'zg'atilgan BMDM hujayralarida yallig'lanish sitokinlarining oqsil darajasini pasaytiradi.

3.5. FPR2 ning inhibisyonu BMDM hujayralarida LPS tomonidan qo'zg'atilgan yallig'lanishni bostirdi

FPR2 ning makrofag yallig'lanishidagi rolini o'rganish uchun biz BMDM hujayralarida FPR2 ni yiqitish uchun siRNA dan foydalandik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, siRNK transfeksiyasi LPS tomonidan qo'zg'atilgan makrofagda (5A-rasm) FPR2 ifodasini sezilarli darajada inhibe qilishi va IL{6}}b va TNF-a ifodasini samarali ravishda kamaytirishi mumkin (5B va C-rasm). Bundan tashqari, western blot natijalari shuni ko'rsatdiki, siRNA transfeksiyasidan so'ng, FPR2 ning oqsil darajasi LPS tomonidan rag'batlantirilmaganligidan qat'i nazar, sezilarli darajada inhibe qilingan (5D va E-rasm). Shunisi e'tiborga loyiqki, FPR2 ning ishdan chiqishi yallig'lanish sitokinlarining oqsil darajasini sezilarli darajada kamaytirdi va NF-kB signalizatsiya faolligini inhibe qildi (5FeK-rasm), bu FPR2 ning makrofaglarda yallig'lanish reaktsiyasini rag'batlantirishda muhim rol o'ynashini ko'rsatadi. Bundan tashqari, makrofag yallig'lanishini inhibe qilish uchun ISL ning asosiy maqsadi bo'lishi mumkin.

3.6. FPR2 ning haddan tashqari ko'payishi LPS tomonidan qo'zg'atilgan BMDM hujayralarida izoliquiritigeninning yallig'lanishga qarshi ta'siriga qarshi turdi.

ISL makrofagda FPR2 ni inhibe qilish orqali AKIda yallig'lanishni bostirishini aniqlash uchun biz ISL bilan davolash qilingan yallig'lanishli BMDM hujayralarida FPR2 ifodasini yuqori tartibga solish uchun FPR2 haddan tashqari ekspression plazmididan foydalandik. 6-rasmda ko'rsatilganidek, FPR2 ning oqsil va mRNK darajasi pcDNA3da sezilarli darajada oshdi.1- FPR2 transfektsion guruhi (6A, B, G-rasm) va FPR2 ning haddan tashqari ifodalanishi 40 ning inhibitiv ta'sirini samarali ravishda bekor qildi. p65 faollashuvida mM ISL va LPS tomonidan qo'zg'atilgan BMDM hujayralarida IL-1b, IL-6 va TNF-a protein darajalari (6CeF-rasm). Xuddi shunday, FPR2 ning yuqori tartibga solinishi IL-1b, IL-6 va TNF-a kabi LPS tomonidan qo'zg'atilgan BMDM hujayralarida yallig'lanish sitokinlarining ekspressiyasi va sekretsiyasiga 40 mM ISL ning bostiruvchi ta'sirini olib tashladi. (6HeM-rasm), ISL FPR2 ni inhibe qilish orqali LPS tomonidan qo'zg'atilgan BMDM hujayralarida yallig'lanishni kamaytirishini ko'rsatadi.

4. Munozara

O'tkir buyrak shikastlanishi keng tarqalgan klinik kasalliklardan biridir. Odatda qisqa vaqt ichida bemorlarning immuniteti zaiflashishiga olib keladi. Shikastlanish natijasida qon yo'qotish, organlarning shikastlanishi, shok holatlarida buyrak eng sezgir organ bo'lib, o'tkir shikastlanishga moyil bo'ladi.18e20 Ko'plab tadqiqotlar yallig'lanish OKI rivojlanishida asosiy rol o'ynashini tasdiqladi. OKI davolash uchun potentsial aralashuv maqsadi sifatida. So'nggi yillarda xitoy dori-darmonlari yallig'lanishni, shu jumladan curcumin, quercetin, naringenin va boshqa monomerlarni davolashda katta yutuqlarga erishdi. Iso-liquiritigenin - flavonoid birikma bo'lib, yallig'lanishga qarshi, erkin radikallarga qarshi, o'smaga qarshi va boshqa ta'sirlar kabi ko'plab biologik faollikka ega. II-induktsiyali HK-2 hujayralari.22 Vu Yangping tomonidan olib borilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, ISL psoriaz modelidagi NF-kB faolligini inhibe qilish orqali IL-6 va IL-8 ni pasaytiradi. ISL psoriaz va boshqa otoimmün yallig'lanish kasalliklarini davolash uchun nomzod bo'lishi mumkin.23 Boshqa tomondan, yaqinda o'tkazilgan tadqiqot ISL NF-kB p65 translokatsiyasini bostirish va yallig'lanish reaktsiyalarini inhibe qilish orqali septik OKI ni engillashtirishi mumkinligini ko'rsatdi.24 Ushbu tadqiqotda biz ISL sisplatin bilan qo'zg'atilgan AKI sichqonlarida buyrak funktsiyasini samarali ravishda yaxshilashi, buyrak shikastlanishini kamaytirishi va buyrak yallig'lanishini inhibe qilishi mumkinligini aniqladi. Biroq, yallig'lanishni inhibe qiluvchi ISLning aniq mexanizmi aniq emas.

FPR2 kemotaktik retseptorlar oilasiga mansub bo'lib, 7 marta transmembranning G oqsili bilan bog'langan retseptoridir. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, FPR2 turli xil fiziologik va patologik jarayonlar, jumladan, mudofaa reaktsiyalari, yallig'lanish, neyrodegenerativ kasalliklar, o'smalar, glyukoza va lipid metabolizmi bilan bog'liq buzilishlar.25,26 FPR2 lipopolisakkaridlar, turli yallig'lanish omillari, va yallig'lanish jarayonidagi prostaglandin E2 yallig'lanishga qarshi va yallig'lanishga qarshi rol o'ynashi mumkin.27,28 FPR2 ning yallig'lanishga turli ta'siri atrof-muhitga va turli signal yo'llarini faollashtiradigan ligandlarga bog'liq.29 Ushbu tadqiqotda biz aniqladik. FPR2 asosan buyrak interstitiumidagi makrofaglarda ifodalanadi va sisplatin bilan qo'zg'atilgan AKI sichqonlarining buyragida yuqori darajada ifodalanadi, bu makrofaglardagi FPR2 AKI buyragidagi makrofaglarning yallig'lanish reaktsiyasida ishtirok etishi mumkinligini ko'rsatadi. Ko'payib borayotgan dalillar OKI paydo bo'lganidan keyin bir necha soat ichida ko'p miqdordagi makrofaglar buyrakka infiltratsiyalanganligini va yallig'lanishga javob berish orqali buyrak shikastlanishini kuchaytirganligini tasdiqladi. AKIni yaxshilashning muhim yo'nalishi bo'lishi va FPR2 bu jarayonda ishtirok etishi noma'lum.

Bizning eksperimental natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, sisplatin bilan qo'zg'atilgan AKI sichqonlarida past va yuqori dozali ISL bilan davolash nafaqat buyraklar tuzilishi va faoliyatini yaxshilash, balki yallig'lanish sitokinlari darajasini ham kamaytirishi mumkin. Bundan tashqari, ISL FPR2 ning protein darajasini va p65 faolligini samarali ravishda kamaytirishi mumkin. FPR2 asosan makrofaglarda ifodalanganligi sababli, ISL makrofaglarda FPR2 ni inhibe qilish orqali buyrak yallig'lanishini yaxshilashi mumkinligini ko'rsatadi. Buyrak yallig'lanishida infiltratsiyalangan makrofagning muhim roli tufayli biz ISL ning makrofaglarning yallig'lanishiga va potentsial mexanizmga ta'sirini yaxshilashni in vitro aniqlash uchun birlamchi suyak iligidan olingan makrofaglarni ajratib oldik. Natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, ISL LPS tomonidan qo'zg'atilgan makrofag yallig'lanishini sezilarli darajada inhibe qilishi va yallig'lanish omillari IL-1b, IL-6 va TNF-a ning ifodasi va sekretsiyasini pasaytiradi. Shu bilan birga, ISL makrofagdagi yallig'lanish molekulalarining oqsil darajasini pasaytiradi va LPS tomonidan qo'zg'atilgan mRNK ifodasini va FPR2 protein darajasini inhibe qiladi. FPR2 yallig'lanishni ISL bilan inhibe qilishning asosiy rolini tekshirish uchun biz pcDNA3.1-FPR2 plazmidini FPR2 ni haddan tashqari ifodalash uchun ishlatdik va ISL bilan davolash qilingan yallig'lanish makrofagida FPR2 ning haddan tashqari ifodalanishi ISL ning yallig'lanishga inhibitiv ta'sirini neytrallashini aniqladik. ISL pastga regulyatsiya qilingan makrofaglarning yallig'lanishi asosan FPR2 ni inhibe qilish orqali ekanligini ko'rsatadi. Shunisi e'tiborga loyiqki, biz in vivo sisplatin bilan bog'liq AKI modelidan foydalandik va in vitro LPS tomonidan qo'zg'atilgan yallig'lanish hujayralari modelini tanladik. Ikkala modelning induksion reagentlari bir-biriga mos kelmasa ham, hozirgi vaqtda bu ikki usul mos ravishda in vivo va in vitro yallig'lanish modellarini yaratish uchun tan olingan. Ushbu tadqiqot yallig'lanish reaktsiyalariga qaratilganligini hisobga olsak, bitta tadqiqotda ushbu ikki usuldan foydalanish mumkin.

Ushbu ma'lumotlar ISL in vivo va in vitro yallig'lanish omillarining ifodasini samarali ravishda kamaytirishi mumkinligini isbotladi va FPR2 ifodasini inhibe qilish orqali erishish mumkin. Shunday qilib, ISL AKI uchun potentsial terapevtik dori sifatida xizmat qilishi mumkin.

Minnatdorchilik

Bu ish Luzhou - Janubi-g'arbiy tibbiyot universiteti qo'shma loyihasi (2017LZXNYD-P01 va 2018LZXNYD-PT03), Janubi-g'arbiy tibbiyot universiteti - bog'langan an'anaviy tibbiyot shifoxonasi qo'shma loyihasi (2018XYLH-034), Sichuan provinsial mehnat laboratoriyasining qurilish loyihasi tomonidan qo'llab-quvvatlandi. Tibbiyot (2018-yil #53), Luchjou fan va texnologiya loyihasi (2020-JYJ-56) va Luchjou munitsipal - Janubi-g‘arbiy tibbiyot universitetining yuqori darajadagi iste’dodlarni joriy etish uchun qo‘shma maxsus granti (Lan Hui-Yao jamoasi) ).

Ma'lumotnomalar

1. Soares DB, Mambrini JVM, Botelho GR, Girundi FF, Botoni FA, Martins MAP. Og'ir bemorlarda dori terapiyasi va o'tkir buyrak shikastlanishining rivojlanishi bilan bog'liq boshqa omillar: kesma tadqiqot.PeerJ. 2018;6:e5405. e-pub chop etishdan oldin 2018/08/22.

2. Sato Y, Yanagita M. Immun hujayralari va yallig'lanish AKIda CKD rivojlanishiga.Am J Physiol Ren Physiol. 2018;315(6):F1501eF1512. e-pub chop etishdan oldin 2018/08/30.

3. Ram P, Mezue K, Pressman G, Rangasvami J. Transkateter aorta qopqog'ini almashtirishdan keyingi o'tkir buyrak shikastlanishi.Klin Kardiol. 2017;40(12):1357e1362. e-pub chop etishdan oldin 2017/12/19.

4. YH H, IJ C, YF L, YJ C, YH L, HW C. Laktoferrin buyrakning o'tkir shikastlanishi va buyrak fibrozining erta kasalliklarida renoprotektiv ta'sir ko'rsatadi.Farmatsevtika. 2020;12(5):434.

5. Bonavia A, Singbartl K. O'tkir buyrak shikastlanishida immunitet hujayralarining rolini ko'rib chiqish.Pediatr Nefrol. 2018;33(10):1629e1639. e-pub chop etishdan oldin 2017/08/13.

6. Li J, Tang Y, Tang PMK va boshqalar. Makrofaglar migratsiyasini blokirovka qiluvchi omil sichqonlarda sisplatin ta'sirida o'tkir buyrak shikastlanishidan himoya qiladi.Mol U erda. 2018;26(10):2523e2532. e-pub chop etishdan oldin 2018/08/06.

7. Ferenbach DA, Sheldrake TA, Dhaliwal K va boshqalar. Klodronat tomonidan makrofag/monotsitlarning kamayishi, lekin difteriya toksini emas, sichqonlarda buyrak ishemiyasi/reperfuzion shikastlanishini yaxshilaydi.Buyrak Int. 2012;82(8):928e933. e-pub chop etishdan oldin 2012/06/08.

8. JQ, JC, BM va boshqalar. Izolikiritigenin TRPC5 kanalining ifodalanishini bloklash orqali aterosklerozni inhibe qiladi.Yurak-qon tomir terapevtiklari. 2020;2020:1926249.

9. YG, XL, HY, LP, X C. Isoliqiritigenin KEAP-1/Nrf2 yo'lini faollashtirish va karragenan keltirib chiqaradigan plevritda NF-kB va NLRP3 yo'llarini inhibe qilish orqali antioksidant va yallig'lanishga qarshi ta'sir ko'rsatadi.Ovqat& funktsiyasi. 2020;11(3):2522e2534.

10. LS, XY, XY, YW, Q Z. Isoliquiritigenin siklinga bog'liq kinazga bog'liq bo'lmagan mexanizm orqali inson siydik pufagi saratoni T24 hujayralarining apoptozini keltirib chiqaradi.Onkologiya maktublari. 2017;14(1):241e249.

11. Vang JR, Luo YH, Piao XJ va boshqalar. Inson gepatotsellyulyar karsinoma hujayralarida ROS vositachiligidagi MAPK/STAT3/NF-kappaB yo'llari orqali izoliquiritigenin tomonidan qo'zg'atilgan apoptoz va hujayra siklini to'xtatish mexanizmlari.Drug DevRes. 2019;80(4):461e470. e-pub 2019/01/31 chop etilishidan oldin.

12. AH, CS, YY va boshqalar. Qizilmiya turlarining estrogenik faolligini menopauza belgilari uchun botanikada ishlatiladigan hoplar bilan solishtirganda baholash.PLoSBir. 2013;8(7):e67947.

13. LL L, PM T, CJ L va boshqalar. Shaklni aniqlash retseptorlari Mincle o'tkir buyrak yallig'lanishida M1 makrofag fenotipini saqlab qolish uchun zarurdir.Buyrak Int. 2017;91(3):587e602.

14. Schroder N, Schaffrath A, Welter JA va boshqalar. Formil peptid retseptorlarini inhibe qilish Altsgeymer kasalligining sichqoncha modelidagi natijani yaxshilaydi.JNeyro yallig'lanish. 2020;17(1):131. e-pub 2020/04/26 nashrdan oldin.

15. Neymeyer H, Labels R, Reverte V va boshqalar. Buyrak fibroblastlarida aneksin A1 signalining faollashishi antifibrotik ta'sir ko'rsatadi.Acta Physiol. 2015;215(3):144e158. e-pub chop etishdan oldin 2015/09/04.

16. FC, MP, R A. Turli formil peptid retseptorlari 2 (FPR2) agonistlari tomonidan yaratilgan alohida signal kaskadlari.Int J Mol Sci. 2013;14(4):7193e7230.

17. HW, XP, YG va boshqalar. Ganoderma-A dan olingan birikma formil peptid retseptorlari 2 orqali inhibitiv ta'sir ko'rsatadi.Old farmakol. 2020;11:337.

18. Vang Y, Cai J, Tang C, Dong Z. O'tkir buyrak shikastlanishi va buyrakni ta'mirlashda Mitophagy.Hujayralar. 2020;9(2). e-pub 2020/02/07 chop etilishidan oldin.

19. Sato Y, Takahashi M, Yanagita M. AKI ning CKD rivojlanishiga patofiziologiyasi.Semin Nefrol. 2020;40(2):206e215. e-pub 2020/04/19 chop etilishidan oldin.

20. Ronco C, Bellomo R, Kellum JA. O'tkir buyrak shikastlanishi.Lanset. 2019;394(10212): 1949e1964. e-pub 2019/11/30 chop etilishidan oldin.

21. PZ, HM J, JW Z va boshqalar. NF-kB ni susaytirish orqali septik sichqonlarda miya shikastlanishiga qarshi izoliquiritigeninning himoya ta'siri.Inflammofarmakologiya. 2019;27(4): 809e816.

22. DX, WH, ST Y, YS T. Isoliquiritigenin Nrf2 va NF-kB yo'llari orqali yallig'lanish sitokinlarini va oksidlovchi stressdan kelib chiqadigan apoptozni bostirish orqali Ang II tomonidan qo'zg'atilgan gipertenziv buyrak shikastlanishini engillashtirdi.Biokimyoviy biofizikaRes Commun. 2018;506(1):161e168.

23. YW, XC, XG va boshqalar. Izolikiritigenin NF-kB va proinflamatuar sitokinlarni inhibe qilish orqali psoriazga o'xshash simptomlarning rivojlanishini oldini oladi.J MolMed(Berl). 2016;94(2):195e206.