Yashirin neytrofil jelatinaza bilan bog'langan lipokalin sekretsiya qilinmagan shaklga nisbatan ADPKD hujayralarining kist kengayishini inhibe qilish qobiliyatini ko'rsatadi Ⅱ
Jun 24, 2024
3. Natijalar
3.1. M{2}} Yovvoyi tipdagi va 2L3 ADPKD hujayralari o'rtasida NGAL ifodasi va hujayra proliferatsiyasini solishtirish
2L3 hujayra chizig'i Pkd1L3/L3 sichqonlaridan birlamchi buyrak epiteliya hujayralarining SV40 virusini o'tkazish orqali o'rnatildi [17]. Nazorat sifatida BCRC (Xsinchu, Tayvan) dan sotib olingan M-1 hujayralar (sichqonchaning yovvoyi tipidagi buyrak epitelial hujayra liniyasi) ishlatilgan. 2L3 va M{12}} hujayralarining Pkd1 transkriptlarining PCR genotiplanishi maqsadli allelning 30-intronidagi birinchi loxP joyidan oldin va keyin primerlar yordamida genotiplarni tekshirish uchun o'tkazildi (1A-rasm). Genotiplash nazorati sifatida Pkd1+/+, Pkd1L3/+ va Pkd1L3/L3 sichqon to‘qimalari ishlatilgan. M{23}} hujayralaridan olingan PCR mahsulotlari bitta yovvoyi turdagi (WT) Pkd1+/+ diapazoni (473 bp), 2L3 hujayralaridan olingan PCR mahsulotlari esa bitta Pkd1L3/L3 bandini (507 bp) ko‘rsatdi. qo'shimcha loxP segmenti (34 bp) tufayli (1B-rasm).
M-1 va 2L3 xujayralari dan ekanligini tavsiflash uchuno'xshash kelib chiqishi buyrak tubulalari, biz birinchi navbatda 2 hujayra chizig'i orasidagi morfologiyani solishtirdik; M-1 hujayralar va 2L3 hujayralari juda o'xshash morfologiyani ko'rsatdi (1C-rasm). Bundan tashqari, ularning kelib chiqishini tekshirish uchun Lotus tetragonolobus lektin (LTL, differentsiatsiyalangan proksimal tubulalar belgisi, flüoresan bilan belgilangan) va Dolichos biflorus aglutinin (DBA, differentsiatsiyalangan distal kanalchalar va yig'ish kanallari belgisi) bilan lektin bo'yalgan. buyrak kanalchalaridan (1D-rasm). Bo'yash natijalari shuni ko'rsatdiki, M-1 va 2L3 hujayralari LTL- (asosan DAPI bilan birgalikda joylashgan) va DBA-musbat (sitoplazmada lokalizatsiya qilingan) (1D-rasm). Bu natija M-1 va 2L3 hujayralarining kelib chiqishini ko‘rsatdibuyrak kanalchalarikelib chiqishi o'xshash va o'xshash xususiyatlarga ega bo'lishi mumkin. Haqiqiy vaqtda PCR natijalari shuni ko'rsatdiki, 2L3 xujayralari M-1 hujayralariga nisbatan Pkd1 mRNK ifoda darajalari juda kamaygan (1E-rasm), bu Pkd1 proteinini ifodalash darajasi atigi 25% bo'lgan 2L3 sichqonlari ma'lumotlariga mos keladi. yovvoyi turdagi sichqonlarniki [17]. 2L3 sichqonlarining buyraklarida NGAL va NGAL retseptorlari (NGAL-R) oqsillari yovvoyi turdagi sichqonlarga qaraganda yuqoriroq ekanligi isbotlangan [31]. Haqiqiy vaqtda PCR natijalari shuni ko'rsatdiki, Lcn2 mRNK ifoda darajasi M{23}} hujayralardagiga qaraganda 2L396-katta 15 baravar ko'p (1F-rasm), 2L3 sichqonlari [31] uchun xabar qilingan ma'lumotlarga mos keladi. ikki guruh o'rtasida Slc22a17 mRNK ifodasida sezilarli farq yo'q edi (1G-rasm). Western blot natijalari shuni ko'rsatdiki, 2L3 hujayralari M-1 hujayralariga qaraganda yuqori NGAL ifoda darajasiga ega, shu bilan birga ikki guruh o'rtasida NGAL-R ifoda darajasida sezilarli farq yo'q (1H-rasm). M-1 va 2L3 hujayralarining hujayralari va supernatantlari Elishay usuli yordamida hujayra lizatlari va supernatantlardagi NGAL miqdorini aniqlash uchun 48 soat davomida kulturadan keyin yig'ib olindi. Vestern blot natijalariga muvofiq, Elishay 2L3 ning hujayra ichidagi NGAL va supernatantda NGAL sekretsiyasi M-1ga qaraganda ancha yuqori ekanligini ko'rsatdi (1I-rasm).
2L3 sichqonlari yovvoyi turdagi sichqonlarga qaraganda yuqori hujayra proliferatsiyasini ko'rsatishi ko'rsatildi [17]. MTT va BrdU qo'shilish tahlillari 2L3 hujayra chizig'i yovvoyi turdagi hujayralarga qaraganda yaxshiroq yashash va ko'payish qobiliyatini ko'rsatdimi yoki yo'qligini tekshirish uchun o'tkazildi (2A-C-rasm). Vakillik tasvirlari bir xil dastlabki ekish raqamlari bilan 48 soat davomida ekishdan so'ng M-1 hujayralarga qaraganda 2L3 hujayralarining ko'proq birikmasini aniqladi (2A-rasm). MTT tahlillari shuni ko'rsatdiki, 2L3 hujayralari 24 va 48 soat davomida ekilgan M{15}} hujayralarga qaraganda ancha yaxshi hayotiylikka ega (2B-rasm). M-1 va 2L3 hujayralarining ko‘payish qobiliyatini solishtirish uchun hujayralar BrdU qo‘shilish tahlilidan so‘ng 24 soat davomida kulturalandi, bu 2L3 hujayralari M-1 hujayralariga qaraganda ancha yaxshi proliferatsiyaga ega ekanligini ko‘rsatdi (2C-rasm). .
BUYRAK KASALLIKLARIGA YANGI G'OTLAR
3.2. mNGAL qo'shilishining 2L3 hujayralarining hayotiyligi va ko'payishiga ta'siri
Ekzogen NGALni qo'llash in vitroda kist o'sishini kamaytirishi ko'rsatilgan [25]. Bizning oldingi tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, ADPKD sichqonchasi modelida (Pkd1L3 / L3; NGALTg / Tg sichqonlari) NGAL ning haddan tashqari ifodalanishi kistning rivojlanishini kamaytirdi, bu esa bir qator molekulyar yo'llardagi o'zgarishlar bilan birga keladi.hujayra proliferatsiyasi, apoptoz, vafibroz[31]. Shuning uchun biz MTT tahlili yordamida rekombinant mNGAL ning 2L3 hujayra hayotiyligiga ta'sirini tekshirdik (3-rasm). E. coli dan tozalangan rekombinant mNGAL (signal peptidsiz) ning tozaligi birinchi marta SDS-PAGE va Coomassie ko'k bilan bo'yash orqali aniqlandi, bu bitta 20-kD diapazoni va yuqori konsentratsiyalarda juda engil dimer bandini aniqladi ( 3A-rasm). Bundan tashqari, hujayra madaniyati muhitida mNGAL ning barqarorligi g'arbiy blot orqali tahlil qilindi, bu mNGALning muhitda kamida 48 soat davomida barqarorligini ko'rsatdi (3B-rasm). Biz mNGAL 8 soat davomida davolashdan keyin nazorat guruhiga nisbatan 2L3 hujayralarining hayotiyligini sezilarli darajada kamaytirganini payqadik (3C-rasm). Rapamitsin ushbu tajribada mTOR inhibitori sifatida tan olingan va PKD sichqonchasi modelida epitelial hujayralar ko'payishi va kist o'sishini inhibe qilishi ma'lum bo'lgan ijobiy nazorat sifatida ishlatilgan [32]. Bundan tashqari, BrdU inkorporatsiyasi tahlili, shuningdek, 24 soat davomida mNGAL bilan davolash 2L3 hujayralarining ko'payishini sezilarli darajada inhibe qilganligini ko'rsatdi (3D-rasm). Hujayra proliferatsiyasi ADPKD ning asosiy xususiyati bo'lib, mNGAL yordamida 2L3 hujayra proliferatsiyasini kamaytirish mumkinligini aniqlash mNGAL 2L3 hujayralarida kist shakllanishini yanada inhibe qilishi mumkinligini ko'rsatdi.
3.3. 2L3 hujayralariga mNGAL qo'shilishidan ta'sirlangan signalizatsiya yo'llari
NGAL va NGAL-R birikmasi hujayra ichidagi temirni sekvestrlashi va keyinchalik apoptozni keltirib chiqarishi ko'rsatilgan [29]. Bundan tashqari, tadqiqotlar NGAL in vitro va in vivo ADPKD modelida apoptozni keltirib chiqarishi mumkinligini ko'rsatdi [25,31]. mNGAL 2L3 hujayralarining apoptozini keltirib chiqarishi mumkinligini tekshirish uchun biz 2L3 hujayra apoptozini oqim sitometriyasi orqali tahlil qildik. mNGAL 8 soat davomida mNGAL bilan davolashdan so'ng 2L3 hujayralarining ko'payishini inhibe qilganligi haqidagi topilmaga asoslanib (3D-rasm), biz mNGALning 2L3 hujayralariga ta'sirini oldingi (4 soat) va keyinroq (12 soat) vaqt nuqtalarida tahlil qildik.
Oqim sitometriyasini tahlil qilish uchun avval o'tkazilgan MTT tahlillariga qaraganda ancha yuqori hujayralar soni va qisqaroq madaniyat muddati talab qilingan; shuning uchun 2L3 xujayralari 6-quduq plitalariga ekilgan va hujayralarga mNGAL ning yuqori konsentratsiyasi (600-1200 mkg/ml) qo'llangan. Natijalar shuni ko'rsatdiki, 1200 mkg/ml mNGAL 4 va 12 soatlik davolanishdan keyin hujayra hayotiyligini sezilarli darajada inhibe qilgan, 600 mkg/mL mNGAL esa faqat 4 soatlik davolashdan keyin hujayra hayotiyligini inhibe qilgan (3E-rasm). Annexin V-FITC- va PI-bo'yalgan hujayralarni aniqlash uchun apoptoz tahlillari oqim sitometriyasi orqali amalga oshirildi. Annexin V fosfatidilseringa (PS) yuqori yaqinlikka ega va PS ta'siriga uchragan apoptotik hujayralarni aniqlash uchun ishlatiladi [33]. Bo'yash natijalariga ko'ra, hujayralarni normal (AV−/PI−), erta apoptoz (AV+/PI−), kech apoptoz (AV+/PI+) va nekroz (AV−/PI+) deb tasniflash mumkin va ular quyidagilarda ko'rsatilgan. kvadrantal diagrammalar (3F-rasm). Erta apoptotik bosqichdagi hujayralar buzilmagan membranalarni saqlaydi, ular kech apoptotik bosqichdagi hujayralardan parchalanib ketgan membranalardan farq qiladi [34]. Natijalar shuni ko'rsatdiki, 2L3 hujayra apoptoz tezligi (erta AV+/PI− va kech AV+/PI+ apoptozini o'z ichiga oladi) mNGAL bilan 12 soatlik davolashdan so'ng (1200 mkg/ml; shakl 3F, G) nazorat guruhiga nisbatan sezilarli darajada oshgan. ).
rasm 1. M-1 yirtqich turi va 2L3 ADPKD hujayralari o'rtasidagi NGAL ifodasini solishtirish. (A) Pkd1 genining yovvoyi tipdagi tuzilishi va L3 allellari. PCR genotiplash Pkd1 ning 30-introni ichidagi birinchi loxPdan oldin va keyin primerlar yordamida o'tkazildi. To'ldirilgan uchburchaklar: loxP; mc1 promotori tomonidan boshqariladigan neomitsinga qarshilik geni (mc{10}}neo) ikkita loxP joyi bilan yonma-yon joylashgan Pkd1 ning 34-introniga kiritildi.(B) M-1 hujayralarining Pkd1 transkriptlarining PCR genotipi (473 bp) va 2L3 hujayralar (507 bp). Nazorat sifatida yovvoyi turdagi (+/+), heterozigot (L3/+) va homozigot (L3/L3) sichqonlarining Pkd1 transkriptlari ishlatilgan. RT-qPCR 2L3 ning Pkd1 (C) M-1 sezilarli darajada past ekanligini ko'rsatdi va 2L3 hujayralari o'xshash morfologiyani ko'rsatdi. O'lchov paneli: 100 mikron. (D) M-1 va 2L3 hujayralari Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL, Fluorescein bilan belgilangan, yashil) va Dolichos biflorus aglutinin (DBA, Rhoda minasi bilan belgilangan, qizil) va DAPI (ko‘k) bilan bo‘yalgan va konfokal mikroskop. O'lchov paneli: 50 mikron. RT–qPCR shuni ko'rsatdiki, 2L3 yirtqich turdagi M{42}} hujayralarga qaraganda Pkd1 (E) va yuqori Lcn2 (NGAL) (F) ifoda darajalariga ega. (G) M-1 va 2L3 hujayralari o'rtasida Slc22a17 (NGAL-R) ifoda darajalarida sezilarli farq yo'q. RQ: nisbiy miqdor=2 −DDCt; Gapdh har bir namunaning ichki nazorati sifatida ishlatilgan. Qiymatlar M-1 ga normallashtirildi. (H) Western blot natijalari 2L3 ekanligini ko'rsatdi
(AV−/PI−) pastki o‘ng kvadrantda (Q1) ko‘rsatilgan. Erta apoptoz hodisalari (AV + / PI−) pastki o'ng kvadrantda (Q2) ko'rsatilgan. Kech apoptoz hodisalari (AV+/PI+) pastki o'ng kvadrantda (Q3) ko'rsatilgan. Nekroz hodisalari (AV−/PI+) pastki o'ng kvadrantda (Q4) ko'rsatilgan. Gistogrammadagi M -1 va M2 mos ravishda apoptoz (AV−) va apoptozdan (AV+) uchramaydigan hujayralarni ifodalaydi. (G) mos ravishda 4 va 12 soatlik kvadrantal diagramma va gistogramma miqdorini aniqlash. (H) Western blot natijalari 2L3 hujayralarida apoptoz belgilarini 24 soat davomida oshirish uchun mNGAL bilan davolashni ko'rsatdi. Vinkulin ichki nazorat sifatida ishlatilgan. Nazorat guruhi uchun qiymatlar normallashtirildi. Guruhlar orasidagi ahamiyatni aniqlash uchun bir tomonlama ANOVA yoki Student t-testi o'tkazildi (n=3). * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p <0,001 va har bir guruh nazorati.
Bundan tashqari, apoptozning markerlari, kaspaza-3 va poli (ADP-riboza) polimeraza (PARP) ning parchalangan shakllari western bloting orqali tahlil qilindi. Kaspaza-3 apoptozning ikki asosiy, tashqi va ichki yo‘llari orqali faol shaklga (17- va 19-kD fragmentlarga) bo‘linib ketadi [35]. Parchalangan kaspaza{6}} ketma-ket PARPni (89 va 24 kD fragmentlari), PARPni faolsizlantirish va apoptozni qo'zg'atish uchun DNKni tiklashda ishtirok etadigan yadro fermentini ajratadi [35,36]. Western blot natijalari (3H-rasm) oqim sitometriyasi ma'lumotlariga mos keldi (3F-rasm, G). 2L3 hujayralarini mNGAL bilan 24 soat davomida davolash ajraladigan/pro-kaspaza-3 va parchalangan/pro-PARP nisbatini sezilarli darajada oshirdi (3H-rasm).
ADPKD hujayralarida Ras/B-Raf/MEK/ERK [10,11] va AKT/mTOR [37,38] yoʻllari yuqori tartibga solinishi koʻrsatildi, bu esa hujayra proliferatsiyasi va kistaning kengayishiga olib keladi. MEK/ERK va PI3K/AKT signalizatsiya yo'llari cAMP-javob elementini bog'lovchi oqsil (CREB, S133) [39,40] [39,40] fosforillanishining kuchayishiga olib keladi, bu hujayraning omon qolishi va ko'payishi bilan bog'liq genlarni maqsad qilgan transkripsiya omili [41]. mNGAL hujayra proliferatsiyasini inhibe qilish mexanizmini o'rganish uchun mNGAL ning 2L3 hujayralarida ERK va AKT signalizatsiya yo'llariga ta'sirini tahlil qilish uchun western blot amalga oshirildi (4-rasm). Western blot natijalari shuni ko'rsatdiki, 2L3 hujayralarini 24 soat davomida mNGAL (1200 mkg / ml) bilan davolash p-ERK (T202/Y204)/ERK (4A-rasm), p-AKT (S473)/AKT (rasm) nisbatlarini sezilarli darajada kamaytirdi. 4B) va p-CREB (S133)/CREB (4C-rasm). Ushbu natijalar (3 va 4-rasmlar) mNGAL hujayra proliferatsiyasini inhibe qilish va apoptozni qo'zg'atish orqali 2L3 hujayralarining hujayra hayotiyligini kamaytirishi mumkinligini ko'rsatdi. Otofagiya disfunktsiyasi ADPKD zebrafish va sichqon modellarida sodir bo'lishi ko'rsatilgan, shu bilan birga rapamisin va karbamazepin kabi autofagiya faollashtiruvchilari bilan davolash kist shakllanishini sezilarli darajada susaytirishi mumkin [12]. mNGAL ning 2L3 hujayralarida autofagiyaga ta'sirini o'rganish uchun ikkita taniqli autofagiya markerlari, mikrotubula bilan bog'langan oqsillar 1A / 1B engil zanjiri 3 (LC3B) va p62, g'arbiy blot bilan tahlil qilindi (5-rasm). LC3B II miqdori avtofagosoma shakllanishi bilan bog'liq va odatda autofagiya belgisi sifatida ishlatiladi [42]. P62 oqsili to'g'ridan-to'g'ri ubiquitin-belgilangan substratlar va LC3B II ni bog'laydi va oxir-oqibat degradatsiyaga uchraydi, shuning uchun p62 degradatsiyasi keng qo'llaniladigan autofagiya belgisidir [43]. Western blot natijalariga ko'ra, 2L3 hujayralarini 24 soat davomida mNGAL bilan davolash LC3B II / LC3B I nisbatini sezilarli darajada oshirdi (5A-rasm) va p62 darajasini (5B-rasm) nazorat guruhiga nisbatan kamaytirdi. Ushbu topilma mNGAL 2L3 hujayralarida autofagiyani faollashtirganini ko'rsatdi.
Wecistanche-ning qo'llab-quvvatlovchi xizmati - Xitoydagi eng yirik cistanche eksportchisi:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Batafsil texnik xususiyatlar uchun xarid qiling:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
BUYRAK FONKSIYASI UCHUN 25% EKINAKOSID VA 9% AKTEOSID BILAN TABIY ORGANIK SİSTANCHE EKSTRAKTINI OLISH UCHUN SHU YERGA BOSING
