Abstrharakat

Fon: Tadqiqotlar mezenximal ildiz hujayralari (MSC) dan olingan ekzosomalarning terapevtik ta'sirini ko'paytirmoqda, ular orqali oqsil va miRNK xarakterlanadi. Biroq, inson embrion ildiz hujayralari (hESC) va inson tomonidan qo'zg'atilgan pluripotent ildiz hujayralari (hiPSC) dan olingan ekzosomalarning proteomikasi va miRNK profillari noaniqligicha qolmoqda.

Sistanx glikozidi, shuningdek, yurak va jigar to'qimalarida SOD faolligini oshirishi va har bir to'qimalarda lipofusin va MDA tarkibini sezilarli darajada kamaytirishi, turli xil reaktiv kislorod radikallarini (OH-, H₂O₂ va boshqalar) samarali tozalash va DNKning shikastlanishidan himoya qilishi mumkin. OH-radikallar tomonidan. Cistanche feniletanoid glikozidlari erkin radikallarni kuchli tozalash qobiliyatiga ega, S vitaminiga qaraganda yuqori darajada kamaytirish qobiliyatiga ega, sperma suspenziyasida SOD faolligini yaxshilaydi, MDA tarkibini kamaytiradi va sperma membranasi funktsiyasiga ma'lum bir himoya ta'siriga ega. Cistanche polisaxaridlari D-galaktoza sabab bo'lgan eksperimental qarigan sichqonlarning eritrotsitlari va o'pka to'qimalarida SOD va GSH-Px faolligini oshirishi, shuningdek o'pka va plazmadagi MDA va kollagen miqdorini kamaytirishi va elastin miqdorini oshirishi mumkin. DPPHga yaxshi tozalash ta'siri, qarigan sichqonlarda gipoksiya vaqtini uzaytirish, sarumdagi SOD faolligini yaxshilash va eksperimental qarigan sichqonlarda o'pkaning fiziologik degeneratsiyasini kechiktirish Hujayra morfologik degeneratsiyasi bilan tajribalar Cistanche yaxshi antioksidant qobiliyatiga ega ekanligini ko'rsatdi. va terining qarish kasalliklarini oldini olish va davolash uchun dori bo'lish potentsialiga ega. Shu bilan birga, Cistanchedagi echinacoside DPPH erkin radikallarini tozalashning muhim qobiliyatiga ega va reaktiv kislorod turlarini tozalashi, erkin radikallar keltirib chiqaradigan kollagen degradatsiyasini oldini olishi mumkin, shuningdek, timin erkin radikal anionining shikastlanishiga yaxshi ta'sir ko'rsatadi.

Anti-aging Cistanche Powder Bulk ustiga bosing

【Batafsil ma'lumot uchun:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Usullari: Ushbu tadqiqotda biz klassik ultratsentrifugalash va 0.22-mkm filtr orqali hESC, hiPSC va inson kindik ichakchasidagi mezenximal ildiz hujayralaridan (hUC-MSCs) ekzosomalarni ajratib oldik, so'ngra konservativ identifikatsiyalash orqali. Tandem massa yorlig'i va yorliqsiz nisbiy peptid miqdori birgalikda ularning proteomikasini aniqladi. MiRNK profillarini aniqlash uchun yuqori o'tkazuvchanlik ketma-ketligi amalga oshirildi. Keyin, biz ekzosoma yuklari tomonidan modulyatsiyalangan dominant biologik jarayonlar va yo'llarni aniqlash uchun bioinformatika tahlilini o'tkazdik. Nihoyat, uchta turdagi ekzosomalarda oqsillar va miRNKlarning haqiqiy yuklarini aniqlash uchun western blot va RT-qPCR o'tkazildi.

Natijalar: Bizning tadqiqotimizga asoslanib, uch turdagi ekzosomalarning yuklari murakkab biologik jarayonlarga yordam beradi. Taqqoslash uchun, hESC ekzosomalari (hESC-Exos) rivojlanish, metabolizm va qarishni tartibga solishda ustun edi va hiPSC ekzosomalar (hiPSC-Exos) hESC-Exos kabi biologik funktsiyalarga ega edi, hUC-MSCs ekzosomalar (hUC-MSC-Exos) immunitetni tartibga solishga ko'proq hissa qo'shgan.

Xulosa: Bizning tadqiqotimizda taqdim etilgan ma'lumotlar uchta ekzosomaning oqsil va miRNK landshaftlarini aniqlashga yordam beradi, tizim darajasida tizimli va keng qamrovli tarmoq tahlili orqali ularning biologik funktsiyalarini bashorat qiladi va klinikadan oldingi va klinikada ekzosoma tanlashni optimallashtirish uchun turli sohalarda ularning tegishli potentsial qo'llanilishini ochib beradi. sinovlar.

Kalit so'zlar: Inson embrion ildiz hujayralari, Inson tomonidan qo'zg'atilgan pluripotent ildiz hujayralari, Inson kindik ichakchasidagi mezenxima hujayralari, Ekzosomalar, Proteomika, miRNK

Kirish

Hujayradan tashqari pufakchalar (EV) hujayralar tomonidan faol ravishda ajralib chiqadigan mayda pufakchalar bo'lib, ularda asosan ekzosomalar, mikrovezikullar (MV) va apoptotik tanachalar mavjud [40, 56, 57]. Ular tupurik, ona suti, qon, miya omurilik suyuqligi, safro va siydik kabi ko'plab tana suyuqliklarida keng tarqalgan [57]. Ular orasida ekzosomalar diametri 40-200 nm, sukroz gradientida suzuvchi zichligi 1,13-1,18 g/ml, elektron mikroskop ostida kosasimon koʻrinishga ega boʻlgan ikki qavatli lipid qatlamiga ega [21, 53]. Turli xil bioaktiv birikmalar, jumladan, oqsillar, nuklein kislotalar va lipidlar, hujayralar orasidagi ekzosomalarning hujayralararo aloqa funktsiyasini ta'minlaydi [16, 17]. Lipid ikki qavati nozik to'siq bo'lib, ekzosomalar tarkibini tana suyuqligining fermentativ degeneratsiyasidan himoya qiladi [49]. Barqaror ekzosomalar organ va reproduktiv rivojlanish, antigen taqdimoti, neyron aloqasi, immun javob, qarishni tartibga solish va hujayra proliferatsiyasini o'z ichiga olgan parakrin faollik orqali murakkab fiziologik va patologik jarayonlarga vositachilik qilishi mumkin [57, 62].

Ekzosoma hosil bo'lishi va chiqarilishi to'liq tartibga solinadigan jarayon bo'lib, ekzosomalar bilan qoplangan tarkibni saralash turli xil oqsillarni mobilizatsiya qilish orqali sodir bo'ladi [22, 47]. Ko'p oqsillar ekzosoma hosil bo'lishi uchun juda muhim bo'lib, ular tashish uchun zarur bo'lgan endosoma saralash kompleksi (ESCRT), tetraspaninlar (CD9, CD63 va CD81), apoptoz bilan bog'langan gen 2-o'zaro ta'sir qiluvchi protein X (Aliks) va o'simta sezuvchanligini o'z ichiga oladi. gen 101 (TSG101) [38, 55]. Ekzosomalarning hujayra ichidagi savdosi bir qator oqsillarning, shu jumladan RAB GTP-pazalarining molekulyar almashinuvi va aktin va tubulin kabi sitoskeletal oqsillarning birgalikdagi faolligi bilan ta'minlanadi [24]. Keyinchalik, ekzosoma sekretsiyasi SNARE kompleksi va sinaptotagminlar oilasi bilan to'ldiriladi [22]. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, ekzosomalarning tomurcuklanması va to'kilishi kaltsiy faolligiga va ESCRTni jalb qilishga tayanadi [15]. Xabarchi sifatida ekzozomaning chiqarilishi hujayra fiziologiyasi va faollashuv, pH o'zgarishi, gipoksiya, radiatsiya shikastlanishi yoki hujayra stressi kabi patologik o'zgarishlarga javoban hujayra o'zaro bog'lanishida ishtirok etadi [61].

Ekzosomalarning tarkibiy qismlarini va ularning mumkin bo'lgan fiziologik va patologik funktsiyalarini ochish uchun proteomik, transkriptomik va boshqa usullar ko'pincha turli turlar, to'qimalar va hujayralardagi ekzosoma RNKlari va oqsillarini o'rganish uchun ishlatiladi [44]. Ekzozoma proteomikasi tahlili odatda uch bosqichni o'z ichiga oladi: ekzosomalarni izolyatsiyalash, tozalash va tavsiflash, massa spektrometriya yordamida oqsil komponentlarini aniqlash va xom ma'lumotlarni tahlil qilish [14]. Hujayra holati oqsil tarkibiga va ekzosomalarning ko'pligiga sezilarli ta'sir qiladi. Hozirgi vaqtda ekzosomalar ishlab chiqarish mexanizmini tushuntirish va hujayralardagi ekzosomalarning fiziologik va patologik rollari haqidagi tushunchamizni chuqurlashtirish uchun oqsil xarakteristikasini va ko'pligini tahlil qilishning miqdoriy proteomik usullari qo'llaniladi [39]. Ular orasida massa-spektrometriyaga asoslangan miqdoriy proteomika texnologiyalari keng qo'llaniladi, asosan yorliqsiz va barqaror izotop-yorliqli usullarni o'z ichiga oladi [13, 42]. miRNKlar turli xil hayot faoliyati bilan chambarchas bog'liq bo'lgan kichik bioaktiv molekulalardir. Yuqori o'tkazuvchanlik sekvensiyasi texnikasi yuqori sezuvchanlik va aniqlik bilan ajralib turadi va miRNK ketma-ketligida (18-30 nt) keng qo'llaniladi [6]. Hozirgi texnologiyaning rivojlanishini hisobga olsak, ekzosomalarning oqsil va miRNK profillarini ajratish uchun hech qanday to'siq yo'q.

hESC va hiPSC yuqori differentsiatsiya potentsialiga ega [36]. Biroq, ularni davolashda to'g'ridan-to'g'ri qo'llash malignite xavfi va axloqiy muammolar tufayli cheklangan [31]. Bundan farqli o'laroq, mezenximal ildiz hujayralari (MSC) klinik sharoitlarda bir nechta kasalliklarga aralashuv uchun kengroq qo'llanilishiga ega [8]. Biroq, ulardan to'g'ridan-to'g'ri foydalanish hali ham bir qancha cheklovlarga duch keladi, jumladan past omon qolish darajasi, immunologik rad etish va xavfsizlik muammolari [8, 43]. Hozirgi vaqtda ekzosomalarga ularning bioxavfsizligi, barqarorligi, anevloidiyasizligi va past immunogenligi tufayli katta e'tibor qaratilmoqda [51]. Oldingi tadqiqotlar turli to'qimalardan olingan MSClarning tarkibiy qismlarini va ularning proteomik va miRNK profillarini o'z ichiga olgan ekzosomalarini taqqoslashni hujjatlashtirdi [59]. Gong va boshqalar. proteoma nuqtai nazaridan hESC hujayradan tashqari pufakchalar (EV) ning tartibga soluvchi tarmog'ini ham tasvirladi, lekin boshqalarga e'tibor bermasdan, faqat qarish bilan bog'liq yo'llarda [19]. Questa va boshqalar. inson sunnat terisi fibroblastlaridan (HFFs) olingan hiPSClarning EV proteomik atlasini to'qdi [45]. Ushbu tadqiqotlar qisman EV ning oqsil tarkibiy qismlari haqida xabar bergan bo'lsa-da, ular faqat ekzosomalarga e'tibor qaratmagan va ularning keng qamrovli proteomik tahlili aniq ifodalanmagan. Xususan, miRNK profillari hali tasvirlanmagan. Buni hal qilish uchun ushbu tadqiqotda hESC, hiPSC va hUC-MSC lardan ajratilgan ekzosomalar ularning tadqiqoti va klinik qo'llanilishi uchun yangi tushunchalarga ega bo'lish uchun ularning proteom va miRNK profillariga qaratilgan qo'shimcha tekshirish uchun tanlangan.

Usullari

Ekzozomalarni tayyorlash va tavsiflash

hESC va hiPSC ncTarget muhitida (kat. № RP01020; Nuwacell. Ltd, Xitoy), hUC-MSC ning 3-avlodi esa sarumsiz missiyasi hMSC muhitida (kat. No. RP02010; Nuwacell. Ltd, Xitoy). Keyinchalik, logarifmik o'sish bosqichida (~ 80 foiz qo'shilish) 350 ml hujayra supernatanti ekzosomani tozalash uchun yig'ildi. Ekzosomalar ilgari ta'riflanganidek, bir qator tan olingan santrifüj va ultratsentrifugalash yo'li bilan ekstraksiya qilindi [34, 52]. Qisqacha, shartli muhit (CM) yig'ildi va ajratish uchun gradient santrifüjlashdan o'tkazildi (10 daqiqa davomida 300 × g, 15 daqiqa davomida 2{14}} × g, 10, 000 × g 30 daqiqa). hujayra qoldiqlari. To'plangan supernatantlardan ekzosomalar Ti45 rotori (Bekman Kulter, AQSH) yordamida 70 daqiqa davomida 100, 000×g haroratda pelletlandi. Keyin ular 0.{21}}mkm MF-Millipore™ Membran filtri (Sigma, AQSh) yordamida keyingi filtrlash uchun PBSda qayta suspenziya qilindi. Filtrat 70 daqiqa davomida 100000xg da ultratsentrifugalashdan o'tkazildi. Yakuniy ekzosoma pelleti keyingi tahlil uchun PBS da qayta to'xtatildi. Izolyatsiya qilingan ekzosomalar kontsentratsiyasi va hajmini o'lchash uchun dinamik yorug'lik tarqalishi (DLS) tizimi (Wyatt Technology, AQSH) ishlatilgan.

Transmissiya elektron mikroskopiyasi (TEM)

Yuqorida aytib o'tilganidek, izolyatsiya qilingan ekzosomalarning morfologiyasini tavsiflash uchun TEM skanerlash amalga oshirildi. Qayta tiklangan ekzosomalar (10 ul PBS uchun 1 ug) uglerod bilan qoplangan mis to'rga (200-to'r) ekilgan va 2 daqiqa davomida uning ustiga adsorbsiyalanishiga ruxsat berilgan, so'ngra ikki marta distillangan suv bilan ikki marta yuvilgan. Keyin panjaralar 1 daqiqa davomida 8 mL 2 foizli uranil asetat eritmasi bilan salbiy bo'yalgan. Tabiiy quritishdan so'ng namunalar 120 kV kuchlanishli Tecnai Spirit tizimi (Thermo Fisher, AQSh) yordamida tekshirildi.

Dinamik yorug'lik tarqalishi

Oldin xabar qilinganidek, ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga (271-DPN) muvofiq, dinamik yorug'lik scatterometri (Wyatt Technology, AQSH) yordamida nanozarrachalar kuzatuvi tahlili orqali ekzosomalarning o'lchamlari taqsimoti tasvirlangan[23]. Qisqacha aytganda, ekzozoma pelleti 100 mL PBSda qayta suspenziya qilindi. 1450 mkL PBS ga yuqoridagi o'n, 50 mL ekzosomalar qo'shildi va 30 soniya davomida vortekslandi. Ekzosomalar (1,5 ml) 30 soniya davomida 25 gradusda muvozanatlash uchun bir martalik kyuvetaga o'tkazildi. Dispersantning sinishi indeksi qiymati 1,37 ni tashkil etdi va Z-o'rtacha va polidispersiya (PDI) ekzosoma zarrachalarining hajmini aniqladi. Har bir namuna uchun daraxtdan mustaqil o'lchovlar olingan.

Tandem massa yorlig'i (TMT) yorlig'i va yorliqsiz nisbiy peptid miqdorini aniqlash (LFQ) tahlili

Total protein was extracted from exosomes, and the concentration was quantified using the Bradford method.  The samples were separated by 12.5% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).  The protein suspensions were digested with trypsin (cat.   no. 9002-07-7; Sigma, USA) in 40 μL of tetraethylammonium bromide (TEAB) buffer for 12  h at 37  °C and then labeled with TMTsixplex™ isobaric label reagent set (cat. no. 90061; Thermo Fisher, USA). TMT-labeled peptides were fractionated by reversed-phase chromatography using an Agilent 1260 Infinity II HPLC system  (Agilent Technology, USA). LC-MSC/MS analysis was performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. (Hangzhou,  China). Briefly, the analysis was completed using the combination of a Q Exactive Plus mass spectrometer and Easy nLC (Thermo Fisher, USA). Survey scans were acquired at a resolution of 70,000 at m/z 200. MS/MS   spectra were captured by the MASCOT engine using the built-in software Proteome Discoverer 2.4. Label-free relative peptide quantification analysis was also performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. as previously reported  [27]. Briefly, the digested proteins of exosomes were separated by HPLC and detected by mass spectrometry.  Raw files from technical and biological replicates were filtered, de novo sequenced, and assigned with protein ID   using PEAKS 8.0 by searching against the human SwissProt database. Tree-independent exosome samples were subjected to TMT or label-free assay. The final protein profiles of exosomes were determined by overlapping the data of TMT (mascot score>60, abundance>100 va P<0.05) and label-free (at least two tests results>0 va P<0.05).

Differentially expressed proteins (DEPs) were considered valid after the data were normalized by protein loading and differential p-value false discovery rates (FDR) corrected [30]. In particular, the proteins with log2|fold change|>1 (|log2FC|>1), shuningdek statistik ahamiyatga ega (P<0.05), were classified as enriched in exosomes.

miRNK profilini tahlil qilish

Jami RNK ajratilgan ekzosomalardan mirVana™ miRNK izolyatsiya to'plami (kat. № AM1560; Thermo Fisher, AQSH) yordamida olingan. RNK namunalari LC-Bio Technology Co., Ltd tomonidan amalga oshirilgan miRNK mikroarray tahlili uchun sifat tekshiruvidan o'tkazildi. Xom ma'lumotlar tahlili avval xabar qilinganidek amalga oshirildi [9]. Differentsial ifodalangan miRNKlar p-qiymatida nomzod miRNKlar sifatida tanlangan<0.05 and |log2FC|>2. Data were omitted if they corresponded to questionable miRNAs, according to previous reports or in-house validated miRNAs [12]. The miRNA target genes were determined by the overlap of prediction of Targetscan and miRanda databases under the restriction of threshold value>90 (Targetscan) va maksimal bo'sh energiya<−10 (miRanda).

Bioinformatika tahlili

Xom ma'lumotlar Maxquant dasturiy paketi (v1.6.0) yordamida tahlil qilindi va Swiss-Prot_Inson ma'lumotlari ma'lumotnoma sifatida o'rnatildi (20 600 oqsil) (Proteome ID: UP000005640) . Aniqlangan oqsillar biologik va funktsional xususiyatlarini aniqlash uchun KOBAS tahlili [60] shartlari asosida Gen Ontologiyasi (GO) va Kioto Genlar va Genomlar Ensiklopediyasi (KEGG) bilan xaritaga tushirildi. R dasturiy ta'minotidagi Cytoscape dasturi va igraph to'plami (3.6.1 versiyasi) signalizatsiya yo'llari o'rtasida ekzozoma oqsillari yoki miRNKlarning o'zaro bog'langan tarmog'ini chizish uchun ishlatilgan.

Statistik tahlil

Barcha tajribalar uch nusxada amalga oshirildi. Proteinlar va miRNKlarning miqdoriy takrorlanishi asosiy komponentlar tahlili (PCA), nisbiy standart og'ish va Pearson korrelyatsiya koeffitsienti orqali oshirildi. Natijalar ajratilmagan Student t-testi yordamida tahlil qilindi. Ma'lumotlar o'rtacha standart xato (SEM) sifatida ifodalanadi. P-qiymatlari * P da statistik ahamiyatga ega deb hisoblangan<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001.

Natijalar

Ekzozomalarni ajratish va identifikatsiya qilish

Insonning uchta pluripotent ildiz hujayralarining madaniyati va identifikatsiyasi Qo'shimcha fayl 1da tasvirlangan. Ekzosomalar uch turdagi ildiz hujayralarining shartli muhitidan ajratilgan (Qo'shimcha fayl 1: S1-rasm) va morfologiyasi, zarracha hajmi, konsentratsiyasi, va sirt belgilari [19]. TEM bu ekzosomalarning chashka shaklidagi morfologiyaga ega ekanligini aniqladi (1A-rasm), DLS esa ularning o'lchamlari taqsimoti 50-200 nm ichida ekanligini aniqladi (1B-rasm). Western blotting izolyatsiya qilingan ekzosomalar ijobiy belgilar CD63, TSG101 va HSP70 ni olib yurganini, ammo salbiy marker kalneksinni emasligini ko'rsatdi (1C-rasm). Har bir hESC hiPSC larga o'xshash ekzozoma rentabelligiga ega edi va ikkalasi ham hUC-MSC dan yuqori edi (1D-rasm). Tese natijalari vakili eksozomalar shaklda farqlarsiz hibsga olinganligini ko'rsatadi; ammo uch turdagi ildiz hujayralaridan ajratilgan ekzosomalar konsentratsiyasi o'rtasida farqlar aniqlandi.

Umumiy va yuqori yuklangan oqsillarning bioinformatikasi

The SDS-PAGE and quantitative analyses revealed that while the protein concentrations of hESC-Exos and hiPSC-Exos were not different, they were both higher than those of hUC-MSC-Exos (Additional file 1: Fig.  S2A and B). The PCA plot indicated that exosomes had good uniformity within each group (Additional file 1:  Fig. S2C). The peptide fragments digested via enzymatic hydrolysis passed the quality inspection (Additional file 1: Fig. S2D–G) and then were subjected to the next bioinformatics analysis. Moreover, the proteins of three exosomes were mainly located in the extracellular region,   followed by the cytoplasm (Additional file 1: Fig. S2H).  To describe the protein profiles of the three types of exosomes, we integrated the TMT (Additional file 2) and label-free data (Additional file 3) under the conditions of mascot score>60 and abundance>100 (TMT assay)   and abundance of at least two repetitions>0 (yorliqsiz tahlil). Nihoyat, hESC-Exos, hiPSC-Exos va hUC-MSC-Exos oqsil profillarini tahlil qilish uchun mos ravishda 554, 437 va 911 urug'lar tanlangan (Qo'shimcha fayl 1: S3A-rasm). Keyin bu nomzodlar umumiy oqsillarni tanlash uchun Venn diagrammasi tahlilidan o'tkazildi (Qo'shimcha fayl 1: S3B-rasm). Bioinformatika tahlili shuni ko'rsatdiki, 303 ta umumiy oqsillar aktin sitoskeletini tartibga solish, fokal adezyon, PI3K-AKT, uglerod almashinuvi va boshqalarni o'z ichiga olgan signalizatsiya yo'llaridagi tartibga solishda ustunlik qiladi (Qo'shimcha fayl 1: S3C-rasm). GO tahlili shuni ko'rsatdiki, umumiy oqsillar hujayradan tashqari ekzosoma, membrana, oqsillarni bog'lash va hujayradan tashqari mintaqada boyitilgan (Qo'shimcha fayl 1: S3D-rasm).

Furthermore, the top-loaded proteins were selected from the candidates with high FDR confidence (TMT   assay) and abundance of each repetition>0 (yorliqsiz tahlil) (2A-rasm). Ushbu natijalarga asoslanib, mos ravishda hESC-Exos, hiPSC-Exos va hUC-MSC-Exos da 163, 187 va 451 oqsillar tekshirildi (Qo'shimcha fayl 1: S3E-rasm). Keyin biz uchta turdagi ekzosomalarning ifodali ko'pligi egri chizig'ini tasvirlab berdik va ekzosomalarda yuklangan oqsillarning eng yaxshi o'nta gen belgilarini aniqladik (2B-rasm). The yuqori yuklangan oqsillar KOBAS algoritmi asosida bioinformatikadan o'tkazildi. Uch turdagi ekzosomalarning proteomalari kompleks signalizatsiya yo'lini tartibga solish tarmog'ida ishtirok etgan va keyin eng yaxshi 20 ta yo'l -log10 (P-qiymati) qiymatiga qarab tartiblangan (2C-E-rasm). Barcha proteomalar hujayradan tashqari matritsa (ECM) - retseptorlari o'zaro ta'sirida va PI3K-AKT signalizatsiya yo'llarida boyitilgan. Protein-oqsil o'zaro ta'siri (PPI) tahlili shuni ko'rsatdiki, hESC-Exos va hiPSC-Exosdagi yuqori yuklangan oqsillarhujayra aylanishi va metabolik yo'lda boyitilgan, hUC-MSC-Exosdagi yuqori yuklangan oqsillar esa immunitetni tartibga solish bilan bog'liq yo'llar bilan boyitilgan (2F-H-rasm).

Ekzozoma proteomikasini juftlik bilan taqqoslash

Har ikki ekzosoma proteomalari o'rtasidagi farqni baholash uchun biz noyob va bir-biriga o'xshash oqsil kodlovchi gen klasterlarini tanib olish uchun Venn diagrammasini tuzdik. Umumiy protein kodlovchi genlar keyin vulqon va issiqlik xaritasi tahliliga va GSEAga o'tkazildi va differensial ravishda ifodalangan oqsillar P da filtrlandi.<0.05 and  |log2FC|≥1. Comparison of hESC-Exos and hiPSC-Exos  (Additional file 1: Fig. S4A) revealed that their unique clusters were both enriched in ECM-receptor interaction and complement and coagulation cascades (Additional file 1: Fig. S4B and C) while overlapping clusters participated in multiple signaling pathways, including metabolic, cell cycle, and Hippo pathways (Fig. 3A). Significant differentially expressed protein-coding genes are presented in the volcano plot (Fig. 3 B). Heatmap analysis revealed that Cluster 1 proteins related to developmental biology, TGF-β signaling, and pluripotency regulation were enriched in hESC-Exos. Proteins in Cluster 2,   which were mainly enriched in hiPSC-Exos, were related to taurine and hypotaurine metabolism, RNA transport,   thiamine metabolism, and folate biosynthesis (Fig. 3 C).  GSEA further emphasized the more important role of hESC-Exos in developmental biology and cell cycle compared to hiPSC-Exos (Additional file 1: Fig. S5).

hESC-Exos va hUC-MSC- 1 o'rtasidagi taqqoslash: S4 D-rasm) hESC-Exosning noyob oqsil kodlovchi gen klasterlari asosan EGFR, TGF-, hujayra sikli, pluripotentlik regulyatsiyasi va Wnt bilan bog'liqligini aniqladi. signalizatsiya (Qo'shimcha fayl 1: rasm. S4E). Bundan farqli o'laroq, hUC-MSC-Exos noyob klasterlari komplement tizimi, yallig'lanishni tartibga solish va mikrobial infektsiya kabi immunoregulyatsiya bilan bog'liq ko'plab signalizatsiya yo'llarida boyitilgan (Qo'shimcha fayl 1: S4F-rasm). Bir-biriga o'xshash klasterlar ECM-retseptorlari o'zaro ta'sirida, komplement va koagulyatsiya kaskadlarida va PI3K-AKT signalizatsiyasida yuqori darajada boyitilgan (3D-rasm). Vulqon syujeti hESC-Exos va hUC-MSC-Exos o'rtasidagi farqlarni tasvirlaydi (3E-rasm). HUC-MSC-Exos (1-klaster) dagi yuqori tartibga solingan oqsillar asosan komplement javobida, tabiiy qotil hujayralar faolligida va Rap1 va PPAR signalizatsiyasida ishtirok etgan. Aksincha, hESC-Exos yuqori tartibga solinadigan oqsillar asosan PI3K-AKT, MAPK va AMPK signalizatsiyasida ishtirok etgan (3F-rasm). GSEA hiPSC-Exos ning pluripotentlikda yuqori tartibga solish qobiliyatini tasdiqladi (Qo'shimcha fayl 1: S6A va D-rasm) va hESC-Exosning immunoregulyatsiyada, shu jumladan tabiiy qotil hujayralar vositachiligida sitotoksisite (Qo'shimcha fayl 1: S6B va E-rasm). va COVID19-SARS-CoV2 ni tartibga solish (Qoʻshimcha fayl 1: S6C va F-rasm).

hiPSC-Exos va hUC-MSC-Exos taqqoslash (1-qo'shimcha fayl: S4G-rasm) noyob hiPSCExos oqsil kodlovchi gen to'plami gomologik bo'lmagan so'nggi qo'shilish, TGF- va vitamin B6 metabolizmi bilan sezilarli darajada bog'liqligini aniqladi (Qo'shimcha 1-fayl: S4H-rasm), holbuki hUC-MSC-Exos asosan immunoregulyatsiya bilan bog'liq yo'llarda ishtirok etgan (Qo'shimcha fayl 1: S4I-rasm). Ularning bir-biriga o'xshash oqsillari, shuningdek, ECM-retseptorlari o'zaro ta'sirini, komplement va koagulyatsiya kaskadlarini va PI3K-AKT signalizatsiyasini tartibga solishda ishtirok etdi (3G-rasm). Vulqon syujetida differensial ifodalangan oqsillar ko'rsatilgan (3H-rasm). Issiqlik xaritasidagi 1-klaster oqsillari hUCMSC-Exos asosan immun javobini va AMPK signalizatsiya yo‘lini, hiPSC-Exos esa asosan hujayra siklini va insulin, Hippo va mTOR signalizatsiya yo‘llarini tartibga solishini ko‘rsatdi (3-rasm I). GSEA hiPSC-Exos ning rivojlanish jarayonlarini tartibga solishdagi dominant rolini qo'llab-quvvatladi (1-qo'shimcha fayl: S7A va D-rasm) va pluripotentlikni saqlash (1-qo'shimcha fayl: S7B va E-rasm), hUC-MSC-Exos esa asosan immunoregulyatsiya jarayonida ishtirok etadi (Qo'shimcha fayl 1: S7C va F-rasm).

Bir-biriga yopishgan proteomalarning bioinformatikasi

Keyinchalik, biz uchta eksozoma turining umumiy proteomalarini tekshirdik. Hammasi bo'lib 309 ta protein kodlovchi genlar (4A-rasm) GO va KEGG tahlillaridan o'tkazildi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, uchta ekzozoma turi o'rtasida umumiy protein kodlovchi genlar to'plami asosan hujayradan tashqari faollik va biologik jarayonlarda, shu jumladan hujayra oqsillari almashinuvi jarayonlarida, signalizatsiya retseptorlari bilan bog'lanishda, ATP bilan bog'lanishda, NAD bilan bog'lanishda, yaralarni davolashda va lipid almashinuv jarayonlarida ishtirok etgan (1-rasm). 4B). Shuningdek, ular PI3K-AKT, glikoliz/glyukoneogenez, Hippo, Oksitotsin, HIF-1, hujayra aylanishi va AMPK yo'llari kabi signalizatsiya yo'llarining murakkab tartibga soluvchi tarmoqlarini qurishga hissa qo'shdilar (4C-rasm). Ushbu proteomik va kanonik signalizatsiya yo'llari o'rtasida murakkab tartibga solish munosabatlari mavjud edi (4D-rasm). Pufakcha sxemasi kanonik signalizatsiya yo'lidagi har bir oqsil klasterining turli xil ko'pligini ko'rsatadi. hESC-Exos va hiPSC-Exos hujayra aylanishi va AMPK signalizatsiya yo'llari nuqtai nazaridan hUC-MSC-Exos-ga qaraganda kuchliroq tartibga solish qobiliyatiga ega bo'lishi mumkin bo'lsa-da, hUC-MSC-Exos VEGF va NF-kB signalizatsiya yo'llariga sezilarli tartibga soluvchi ta'sir ko'rsatishi mumkin (Qo'shimcha 1-fayl: S8-rasm).

Issiqlik xaritasi tahlili birgalikda oqsillarni ifodalashdagi farqlarni aniqladi (4E-rasm). A klasterida PI3K-AKT, Hippo, VEGF va B-hujayra retseptorlari signalizatsiya yo'llarida ishtirok etadigan oqsillar hUC-MSCExos va hESC-Exos bilan boyitilgan. B klasteridagi oqsillar asosan PPAR signalizatsiyasi, xolesterin almashinuvi va IgA ishlab chiqarishni tartibga solishda ishtirok etgan va hESC-Exosda kamaygan. HUC-MSC-Exos asosan komplement javobini, mikrobial infektsiyani, HIF{9}} signalizatsiyasini, MAPK signalini, metabolik yo'llarni va NF-KB yo'lini tartibga soluvchi Cluster C oqsillarini o'z ichiga oladi. D klasteridagi hiPSC-Exos bilan boyitilgan oqsillar Ras signalizatsiyasi, oksidlovchi fosforillanish va mTOR signalizatsiyasini tartibga solishda ishtirok etdi. E klasteridagi oqsillar hUC-MSCExosga qaraganda hiPSC-Exos va hESC-Exos-da ko'proq bo'lgan va ular sitrat aylanishi, hujayra aylanishi, insulin signalizatsiyasi, yog' kislotalari almashinuvi va AMPK signalizatsiyasi kabi ko'plab metabolik jarayonlarda ishtirok etgan. . F klasteridagi oqsillar kaltsiyning reabsorbtsiyasini, glikolizni/glyukoneogenezni, adrenergik signalizatsiyani va piruvat metabolizmini tartibga solishda ishtirok etgan va hUC-MSCExos va hiPSC-Exosda kamaygan. Turli klasterlardagi oqsillar 4-qo'shimcha faylda keltirilgan.

uchta eksozoma turining miRNK profillari

Uch ekzosoma turining miRNK profillarini o'rganish uchun umumiy RNK keyingi teskari transkripsiya uchun 5' va 3' uchlarini ulash uchun ekzosomalardan ajratildi. Olingan cDNK kutubxonani qurish va keng sinov uchun ishlatilgan. RNK yaxlitlik raqami (RIN) hESC-Exos, hiPSC-Exos va hUC-MSC-Exos da mos ravishda 2,7, 2,6 va 2,6 edi (Qo'shimcha fayl 1: S9A-rasm). RNK kontsentratsiyasini aniqlash RNK ​​yukida hESC-Exos, undan keyin hiPSC-Exos va hUC-MSCExos ustunlik qilgani aniqlandi (Qo'shimcha fayl 1: S9B-rasm). MiRNKlarning takrorlanuvchanligini miqdoriy jihatdan baholash uchun Pearson korrelyatsiya koeffitsienti (Qo'shimcha fayl 1: S9C-rasm) va PCA (Qo'shimcha fayl 1: rasm. S9D) ishlatilgan. Issiqlik xaritalari differensial ifodalangan miRNKlarni uchta eksozoma turida (Qo'shimcha fayl 1: S9E-rasm) va P da differentsial tarzda ifodalangan miRNKlar sonini ko'rsatish uchun ishlatilgan.<0.05 or 0.01,   was evaluated between each two exosome types (Additional file 1: Fig. S9F). Based on the sequencing results, the top 20 miRNAs in each of the three exosome types were identified (Fig. 5 A–C). In hESC-Exos, has-miR-302 dominated the read counts and comprised has-miR-302b-3p,   has-miR-302a-5p, and has-miR-302d-3p (Fig.  5A). The three miRNAs with the highest read counts were has-miR- 372-3p, has-miR-371a, and has-miR-302a in hiPSC-Exos and has-miR-21-5p (Fig.  5B), has-miR-146a-5p, and hasmiR-320a-3p in hUC-MSC-Exos (Fig. 5C).

Biologik jarayonlarda ishtirok etadigan miRNKlarni tekshirish uchun eng yuqori miRNKlar P da filtrlangan<0.05 and read count>Maqsadli genni keyingi bashorat qilish uchun 1000. Keyin boyitilgan genlar GO va KEGG tahlillaridan o'tkazildi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, hESC-Exos miRNKlari quyidagi jarayonlarga sezilarli ta'sir ko'rsatdi: Rap1, PI3K-AKT, kaltsiy, Hippo, cAMP, ErbB, Foxo, hujayra aylanishi, AMPK signalizatsiya yo'li va boshqalar (KEGG tahlili) (5D-rasm) va hujayra aylanishi, ko'p organizm rivojlanishi, hujayra ichidagi signal uzatish, hujayra farqlanishi, qarish, Wnt signalizatsiyasi va yog 'kislotalari almashinuvi. (biologik jarayon) (5G-rasm). HiPSC-Exos miRNKlarini maqsadli gen bilan boyitish quyidagi jarayonlar sezilarli darajada tartibga solinganligini ko'rsatdi: PI3K-AKT, Rap1, Ras, Kaltsiy, Hippo, cAMP va cGMP-PKG signalizatsiya yo'li va boshqalar (KEGG tahlili) va hujayra aylanishi, ko'p organizm rivojlanishi, fosforlanish, hujayra differentsiatsiyasi, hujayra migratsiyasi va gipoksiyaga javob. (biologik jarayon) (5H-rasm). HUC-MSC-Exos miRNKlarining tartibga soluvchi tarmog'ida eng maqbul biologik jarayonlar: Rap1, Ras, PI3K-AKT, kaltsiy, cAMP, Hippo, hujayra sikli, JAK-STAT va HIF{19}} signalizatsiya yo'li. . (KEGG tahlili) (5F-rasm) va fosforillanish, hujayra ichidagi signalni uzatish, ATP bilan bog'lanish, hujayra bo'linishi, lipid metabolizmi, T hujayralarini birgalikda stimulyatsiya qilish, jarohatni davolash, NF-kB bilan bog'lanish va yallig'lanish reaktsiyasi. (biologik jarayon) (5-rasm I). Eng yaxshi besh miRNK tarmog'i va ularning tartibga solish yo'llari ham tasvirlangan (Qo'shimcha fayl 1: S10-rasm).

【Batafsil ma'lumot uchun:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】