Cistanche Desertikolaning umumiy glikozidlari MCAO/R Rats-Ⅰ da Nrf- 2/Keap{1}} yo'li orqali neyrovaskulyar regeneratsiyani qo'zg'atish orqali nevrologik funktsiyani tiklashga yordam beradi.

KIRISH

Dunyoda insult o'lim va nogironlikning asosiy sababi hisoblanadi. Barcha insult holatlarining qariyb 87% ishemik insult bilan qo'zg'atiladi. Hozirgi vaqtda eng samarali vosita va FDA tomonidan tasdiqlangan yagona doriishemik insultni davolashrekombinant to'qimalarning plazminogen faollashtiruvchisi hisoblanadi. Ammo insult bilan og'rigan bemorlarning ko'p qismi ushbu doriga javob bera olmaydi, chunki uning tor terapevtik vaqt oralig'i va gemorragik asoratlarning jiddiy xavfi mavjud. Trombolitik davolashning asosiy muammosi ishemiya/reperfuziya (I/R) shikastlanishi bo'lib, bu miya shikastlanishi va funktsiya buzilishining asosiy sababi hisoblanadi. Miya ishemiyasidan keyin reperfuziya miya qon ketishi xavfini oshiradi, shu bilan birga neyrovaskulyar shikastlanishga olib keladi va qon-miya to'sig'iga zarar etkazadigan haddan tashqari reaktiv kislorod turlarini (ROS) hosil qiladi. Bir qator tadqiqotlar BBB ning buzilishi ishemik insult patogenezining asosiy sababi ekanligini tasdiqladi.

ISKEMIK INSULTNI DAVOLASH UCHUN TABIY CISTACHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

BBB asosan endotelial hujayralar, peritsitlar, astrositlar, neyronlar va bazal membranalardan iborat. BBB ning asosiy komponentlari miya mikrovaskulyar endotelial hujayralari bo'lib, ular qattiq birikmalar bilan birlashtiriladi va shu bilan ekzogen molekulalarni miyaga cheklaydi. Qattiq birikmalarning patologik o'zgarishlari, xususan, okludin, klaudin-5 va zonula okludens-1 (ZO-1) - ishemik insult paytida BBB funktsiyasiga, ayniqsa to'siq o'tkazuvchanligiga sezilarli ta'sir qiladi. I / R davrlarida ortiqcha ROS miya neyronlarining bevosita shikastlanishiga olib keladigan asosiy omillardan biridir. ROSning ortiqcha ishlab chiqarilishi ma'lum birlashmalarning degradatsiyasiga va BBB buzilishiga olib keladi, bu esa ekzogen molekulalarning BBB orqali miyaga kirib borishiga olib keladi, bu esa miya shikastlanishining kuchayishiga olib keladi. Shuning uchun BBB ni antioksidantlar bilan himoya qilish reperfuziya shikastlanishining oldini olishning potentsial usuli sifatida qaraldi.

BBB parchalanishidan tashqari, I / R neyrovaskulyar shikastlanishga va neyronlarning o'limiga olib kelishi mumkin. Qon tomirlari paytida neyron hujayralarining o'limining kuchayishi oksidlovchi stress tufayli yuzaga kelishi mumkin va ko'plab tadqiqotlar ROS insultning og'irligini va nevrologik zararni kuchaytirganligini ko'rsatdi. Klinik tadkikotlar qoniqarli natijalarga erishmagan bo'lsa-da, neyroproteksiya hali ham o'tkir ishemik insultni davolash uchun istiqbolli strategiya hisoblanadi. Shunday qilib, insultni davolash uchun samarali neyroprotektiv dorilarni topish insult bilan og'rigan bemorlar uchun foydalidir.

An'anaviy xitoy tibbiyoti (TCM) tananing ichki muvozanatiga aralashish uchun choralar ko'radi. Ishemik insultning murakkab patogenezi tufayli TCM va uning faol tarkibiy qismlarining multifaktorial ta'siri insultni davolashda hal qiluvchi rol o'ynaydi.Sitanchedeserticola YC Ma, Mo'g'uliston va Shimoliy-G'arbiy Xitoyning qurg'oqchil yoki yarim qurg'oqchil hududlarida keng tarqalgan bo'lib, Xitoyda 1,000 yildan ortiq vaqtdan beri unutuvchanlik va depressiya kabi turli kasalliklarni davolashda keng qo'llaniladigan TCM o'ti hisoblanadi. Zamonaviy farmakologik tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, C. deserticolaning xom ekstrakti ko'plab farmakologik faollikni ko'rsatdi, masalan.o'rganish va xotira funktsiyasini, neyroproteksiyani, immunitetni, antioksidant, qarishga qarshi va charchoqqa qarshi ta'sirlarni kuchaytirish. C. desertikolaning kimyoviy tahlili shuni ko'rsatdiki, uning asosiy tarkibiy qismlariga kiradifeniletanoid glikozidlar, iridoid glikozidlar, polisakkaridlar va oligosakkaridlar. Biroq, miyani himoya qilish uchun C. deserticolaning faol komponentlari juda aniq emas.

C. deserticola ning neyroprotektiv xususiyati uning insult va depressiya kabi kognitiv kasalliklarda, shuningdek, Altsgeymer kasalligida terapevtik salohiyatini nazarda tutadi. Biroq, C. desertikolaning qon tomirlariga ta'siri, shu jumladan uning faol komponentlari va ta'sir mexanizmlari bo'yicha tadqiqotlar juda cheklangan. Joriy ishda biz C. deserticola dan uchta ekstrakt, jami glikozidlar (TGs, feniletanoid glikozidlar va boshqa glikozidlar), polisakkaridlar (PS) va oligosakkaridlar (OS) miya I / R jarohatlarida himoya ta'sirini o'rganib chiqdik. Bizning topilmalarimiz C. deserticola ning aniq klinik qo'llanilishiga hissa qo'shishi va nomzod agentini taqdim etishi mumkinishemik insultni davolash.

MATERIALLAR VA USULLAR

Kimyoviy moddalar va reagentlar

Cistanche deserticola poyalari Ichki Moʻgʻulistonning Alashan shahridan sotib olingan va mualliflardan biri (P.-F. Tu) tomonidan aniqlangan. TG, PS va operatsion tizimlar bizning avval xabar qilingan usulimizga muvofiq tayyorlangan. TG larning miqdoriy tahlili yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC) yordamida yuqorida tavsiflanganidek amalga oshirildi va uning xromatogrammasi 1-rasmda ko'rsatilgan. TG ning asosiy komponentlari echinacoside, tubuloside A, acteosid, isoacteosid va 2'-asetilacteosid; ularning tarkibi mos ravishda 163,05 mg / g, 4,125 mg / g, 41,66 mg / g, 22,655 mg / g va 12,045 mg / g ni tashkil qiladi. HPLC va fenol-sulfat kislota tahlili bilan aniqlanganidek, PS va OS tarkibi mos ravishda 69,42% va 65,24% ni tashkil qiladi.

ISKEMIK INSURTNI DAVOLASH UCHUN TABIY CISTACHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Echinacoside (A0282), tubuloside A (A0942), acteosid (A0280), isoacteosid (A0281) va 2'-acetylakteosid (A0943) standart havolalari Chengdu Must Biotechnology kompaniyasidan xarid qilingan. Barcha standartlarning tozaligi 98% dan ortiq. Nissl stain H&E to'plamlari Bosterdan sotib olingan. Edaravone (T0407-1) ​​Target Moldan (Shanxay, Xitoy) sotib olindi. Quyonga qarshi kalamush MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) va sichqoncha kalamushlarga qarshi CD31 (ab24590) xarid qilindi Abcam Inc.dan Rabbit anti-rat Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) va Occludin (BS72035) Bioworld Technologydan sotib olindi. Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, AQSH) quyonlarga qarshi kalamush Sinapsin-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T) manbalari edi. GAPDH (HRP-60004) Proteintech Group, Inc.dan xarid qilingan. Ikkilamchi antikorlar Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Pekin, Xitoy) tomonidan yetkazib berilgan. Hoechst 33258 Beyotime'dan olingan.

Hayvonlar

Sprague-Dawley kalamushlari (erkak, og'irligi 250-300 g) Vital River Laboratory Animal Technologydan olingan va 12 soat yorug'lik / qorong'u tsiklda saqlanadigan konditsionerli xonada joylashtirilgan. Hayvonlar bo'yicha barcha tajribalar ARRIVE ko'rsatmalari asosida amalga oshirildi va Pekin universiteti Sog'liqni saqlash fanlari markazining hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish institutsional qo'mitasi tomonidan tasdiqlandi.

Hayvonlar bo'yicha eksperimental protokollar

Sichqonlar, avvalroq ta'riflanganidek, MCAO/R ga duchor qilindi (Vang va boshq., 2018). Qisqacha aytganda, chap umumiy uyqu arteriyasi (CCA), tashqi uyqu arteriyasi (EKA) va ichki uyqu arteriyasi (ICA) ochildi va ECAdan ICAga o'rtasiga yetguncha 3-0 neylon monofilament chok qo'yildi. miya arteriyasi (MCA). MCA okklyuziyasidan 1,5 soat o'tgach, filamentni olib tashlash orqali reperfuziya simulyatsiya qilindi. Jarrohlik amaliyoti davomida barcha kalamushlarning tana harorati 37,0 darajada saqlanib qoldi. Dori

Ma'muriyat

Kalamushlar SPSS dasturining 22-versiyasidan foydalangan holda tasodifiy oltita guruhga ajratildi. 0 tavsiflanganidek: normal guruh (NOR); modellar guruhi (MOD); edaravon guruhi (musbat dori, 6 ml/kg, EDI); TGs guruhi (280 mg/kg, TGs); PSs guruhi (280 mg/kg, PSs) va OSs guruhi (280 mg/kg, OS). TG, PS va OS 14 kun davomida MCAO / R dan keyin kuniga bir marta boshqariladi. NOR va MOD guruhlari oddiy sho'r suv bilan ishlov berildi. Hayvonlarning soni 1-jadvalda keltirilgan.

Og'irlikni o'lchash va o'zgartirilgan nevrologik tanqislik ko'rsatkichlari (mNSS)

Tana vazni 14-kunida ADVENTURE™ Digital Scale (OHAUS, Nyu-Jersi, AQSh) yordamida nazorat qilindi. mNSS FJ Vang (Vang va boshq., 2018) tomonidan tavsiflangan usul bo'yicha, kichik tuzatishlar bilan baholandi.

2, 3, 5-Trifeniltetrazolium xlorid (TTC) boʻyash

Infarkt hajmi yuqorida aytib o'tilganidek o'lchandi. Qisqacha aytganda, miyalar bir xil masofada joylashgan ettita koronal bloklarga (2 mm) bo'lingan. Ushbu bo'limlar 2% TTC bilan 37 daraja 15 daqiqa davomida bo'yalgan. Infarkt hajmi (%)=(ipsilateral ishemik yarim sharning hajmi - kontralateral ishemik yarim sharning hajmi) / kontralateral ishemik yarim sharning hajmi × 100.

Nissl va H&E binoni

Kalamushlar chuqur anesteziya qilindi va keyin butun miya tezda parafin mumi ichiga kiritilgan 4% paraformaldegid yordamida fiksatsiyalangan bosh suyagidan chiqarildi va 7 mikron qalinlikdagi bo'laklarga bo'lindi. Bo'limlar Nissl va H&E bilan bo'yalgan. Ushbu tadqiqotda yorug'lik mikroskopi bilan har bir to'qima namunasida oltita tasodifiy 2{5}}0 × 200 mkm maydon ushlandi. Nissl jasadlari soni IPP dasturiy ta'minotining 6.0 versiyasi bilan hisoblangan.

Evans Blue tahlili

MCAO/R dan keyin kalamushlarga 2% EB AOK qilingan. Ikki soat o'tgach, kalamushlar behushlik qilindi va keyin butun miya tezda olib tashlandi va asetonda homogenlashtirildi. Supernatantlar 620 nm da 800 TS absorbans o'quvchi tomonidan tahlil qilindi.

Katalaza (CAT), superoksid dismutaza (SOD), malondialdegid (MDA) va glutation peroksidaza (GSH-Px) faolligini o'lchash

Barcha sarum namunalari 4,{1}} × rpm da 15 daqiqa davomida 4 darajada santrifüj qilindi va keyin ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga binoan MDA, CAT, SOD va GSH-Px faoliyatini aniqlash uchun tahlil qilindi.

Western Blotting tahlili

Har bir kalamushdan to'plangan miya to'qimalari (100 mg) bir hil holga keltirildi va RIPA lizis buferida lizing qilindi, so'ngra BCA to'plami yordamida protein kontsentratsiyasini aniqlash uchun tahlil qilindi. To'qimalarning umumiy oqsillari 10% SDS-PAGE jellariga yuklangan va nitrotsellyuloza membranasiga o'tkazilgan. Membrana 5% yog'siz sut yordamida to'sib qo'yildi, so'ngra bir kechada 4 daraja haroratda asosiy antikorlar bilan inkubatsiya qilindi. Keyin membrana ikkilamchi antikor bilan inkubatsiya qilindi. Western blot tahlili Kodak Digital Imaging System yordamida tahlil qilindi.

Immunofluoresan tahlil

CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, okludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 va Keap-1 uchun immunofluoresans bo'yash amalga oshirildi. Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, okcludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 va Keap-1 ga qarshi birlamchi antikorlar 1 ga suyultirildi. :20mos ravishda 0 va 1:100. Alexa Flur 488 sichqonchasi quyonga qarshi IgG va rodamin (TRITC) echki quyonga qarshi IgG ning ikkilamchi antikorlari ikkalasi ham 1:200 nisbatda suyultirildi. Yadrolar Hoechst 33258 tomonidan bo'yalgan. Rasmlar Vectra® Polaris™ avtomatlashtirilgan miqdoriy patologiyani tasvirlash tizimi (PerkinElmer, AQSh) yordamida olingan. Protein ifodasi IPP dasturining 6.0 versiyasi yordamida tahlil qilindi. Statistik tahlil

Barcha ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida tasvirlangan. Statistik tahlil uchun SPSS dasturining 22.0 versiyasi bajarildi. Turli guruhlarni taqqoslashda bir tomonlama ANOVA ishlatilgan. P < 0.05 statistik farq deb hisoblandi.

ANTISHEMIK KASALLIK UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

NATIJALAR

TGlar tana vaznini oshiradi va MCAO / R kalamushlarida miya shikastlanishini kamaytiradi

TG, PS, Oss va EDI bilan 14 kunlik davolanishdan so'ng, I / R kalamushlarining tana vazni, nevrologik nuqsonlari va infarkt hajmi baholandi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, MOD guruhidagi tana vaznlari sezilarli darajada kamaydi, TG, PS va EDI guruhlarida pasayish og'irliklari ko'tarildi (2A-rasm). Nevrologik tanqislik ko'rsatkichlari EDI va TGs tomonidan sezilarli darajada kamaydi (2B-rasm). NOR guruhidagi kalamushlarda miya bo'laklari chuqur qizil rangga ega edi va infarktlar bo'lmagan, MOD guruhidagi kalamushlarda esa katta ipsilateral miya infarkti ko'rsatilgan. TGlarni davolashdan so'ng infarkt hajmi sezilarli darajada kamaydi (2C, D-rasm). PS va OS bilan davolash yuqoridagi indekslarga aniq ta'sir ko'rsatmadi. Yuqoridagi ma'lumotlar shuni ko'rsatdiki, TGlar I / R tomonidan qo'zg'atilgan miya shikastlanishini sezilarli darajada engillashtirishi mumkin, ammo PS va OSlar buni qila olmaydi.

TGlar MCAO/R kalamushlarida gistopatologik zararni yaxshilaydi

TG, PS va OS davolashning gistopatologik zararga ta'sirini aniqlash uchun patologik zararni aniqlash uchun H&E bo'yash o'tkazildi. NOR guruhidagi miyalarning histomorfologik tuzilmalari muntazam ravishda tartibga solingan. TGs guruhlaridagi morfologik o'zgarishlar MOD guruhidagiga qaraganda engilroq edi. Biroq, PS va OS davolash guruhlari morfologik o'zgarishlarning sezilarli yaxshilanishini ko'rsatmadi (3-rasm).

TGs I / R-induktsiyali kalamushlardan keyin neyron shikastlanishini susaytiradi

Nissl binoni ishemik hududning penumbrasida neyronlarning gistopatologik o'zgarishlarini ko'rsatdi. 4-rasmda ko'rsatilganidek, oddiy neyronlar aniq yadro va buzilmagan tuzilishga ega edi. MOD guruhida neyronlar hujayralararo bo'shliqlarni kengaytirdi. Nissl jismlari g'oyib bo'ldi, qisqardi va chuqur bo'yaldi. Biroq, bu o'zgarishlar EDI, TGs va PS guruhlarida kamdan-kam kuzatildi. Ushbu natijalar TG va PS larning sezilarli darajada bo'lishi mumkinligini ko'rsatdiishemiya/reperfuziyadan kelib chiqqan neyron shikastlanishini susaytirish.

TGs I / R bilan ishlov berilgan kalamushlardan keyin BBB buzilishini susaytiradi

Evans ko'k tahlili - bu BBB o'tkazuvchanligining o'zgarishini tadqiq qilishning klassik usuli. Tajriba natijalari shuni ko'rsatdiki, MOD guruhida Evans ko'k rangi oshgan, TG va EDI bilan ishlov berilgan kalamushlarda Evans ko'k sezilarli darajada kamaygan. Bundan tashqari, PS va OS terapiya guruhlari o'rtasida sezilarli farq yo'q edi (5-rasm). Ushbu natijalar TGlar BBB buzilishini sezilarli darajada susaytirishi mumkinligini ko'rsatdi.

TGs I/R shikastlangan kalamushlarda angiogenezni rag'batlantiradi

So'nggi tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, angiogenez o'tkir ishemik insultdan keyin nevrologik funktsional tiklanish va prognostik natijalarda hal qiluvchi rol o'ynaydi (Yuen va boshq., 2015). TG, PS va OSlarning angiogenezga ta'sirini baholash uchun kapillyar sonlarni aniqlash uchun CD31 va a-SMA ishlatilgan. Immunofluoressensiya bilan bo'yash MOD guruhi normal kalamushlarga nisbatan I / R kalamushlarining ishemik hududlari penumbrasida CD31 (6A, B rasmlari) va a-SMA (6C, D rasmlari) ifodalarining sezilarli darajada pasayishiga olib kelganligini ko'rsatdi. . Ushbu natija I / R ishemik yarim sharlarning korteks yarim soyasida qon tomirlariga zarar etkazishi mumkinligini ko'rsatdi. Biroq, TG va EDI bilan davolash kapillyar zichlikni, angiogenezni va arteriogenezni sezilarli darajada oshirdi, chunki CD31 va a-SMA ifodalarining ortishi ko'rsatilgan. Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, TGlar I / R kalamushlarining ishemik penumbrasida angiogenezni rag'batlantirishi mumkin, ammo PS va OSlar qila olmaydi.

TGs I / R shikastlangan kalamushlarda qattiq birikma oqsillarining ifodasini oshiradi

BBB buzilishi miyadagi suv miqdorini va to'qimalarning shishishini oshirishi mumkin, bu esa miya shikastlanishiga olib keladi. Qattiq birikma oqsillari BBB ning muhim tarkibiy qismlari hisoblanadi. Insultdan keyin TG, PS va OS davolash BBB yaxlitligiga ta'sir qilishi mumkinligini tekshirish uchun ZO-1, klaudin-5 va okludin ifodalari immunofluoresans tahlili orqali amalga oshirildi. Natijalar MOD guruhida claudin-5, okcludin va ZO-1 ifodalari sezilarli darajada kamayganligini ko'rsatdi. Biroq, ular qabul qilinganidan keyin 14 kundan keyin sezilarli darajada oshdi. PS va OS guruhlari ushbu protein ifodalarida sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatmadi (7-rasm). Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatdiki, TGlar qattiq birikma oqsil ifodalarini tartibga solishi va I / R shikastlanishidan keyin BBB yaxlitligini saqlab qolishi mumkin.

TGs I/R shikastlangan kalamushlarda kapillyarlarda peritsitlar qoplamini oshiradi

Kapillyarlardagi peritsitlarning qoplanishi BBB yaxlitligini saqlashda muhim rol o'ynaydi. Shunday qilib, biz peritsitlar qoplamini TG, PS va OS bilan davolash orqali oshirish mumkinligini sinab ko'rdik. Immunofluoresans intensivligini tahlil qilish natijalari MOD guruhida ham PDGFRb, ham CD31 ifodalari keskin kamayganligini ko'rsatdi. I/R kalamushlariga TGlarni yuborish PDGFRb va CD31 ning ifoda intensivligini sezilarli darajada tikladi yoki hatto oshirdi, ammo PS va OS davolash guruhlarida hech qanday farq kuzatilmadi (8-rasm). Shunday qilib, TG ni davolash peritsit qoplamasini sezilarli darajada oshirishi mumkin. Ushbu topilmalar TGlar I/R dan keyin BBB yaxlitligini saqlab qolishi mumkinligini tasdiqladi.

ISKEMIK INSURTNI OLDINI OLISH UCHUN TABIY CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%