Odamning normal buyrak rivojlanishi va kasalliklarida -tubulin, inversin va uning maqsadli tarqoq-1 va birlamchi kipriklarning morfologiyasi ifodasi
Mar 10, 2022
Annotatsiya:Wnt-signal yo'li bilan bog'liq bo'lgan -tubulin, inversiya va tarqoq -1 (DVL-1) oqsillarning fazoviy-zamoniy ifodasi va birlamchi siliya morfologiyasi ishlab chiqishda tahlil qilindi.buyraklar(Rivojlanishning 14-38 xaftalari), tug'ruqdan keyingi sog'lom (1.5- va 7- yosh) va patologik o'zgargan odambuyraklar,shu jumladan multikistik displastikbuyraklar(MCDK), fokal segmental glomeruloskleroz (FSGS) va Finlyandiya tipidagi nefrotik sindrom (CNF). Tahlil er-xotin immunofluoresans, elektron mikroskop, yarim kantitativ va statistik usullar bilan amalga oshirildi. -tubulin, inversiya va DVL-1 ning sitoplazmatik birgalikda ifodalanishi tahlil qilingan to'qimalarning proksimal burmalangan kanalchalarida (pct), distal burama kanalchalarda (dct) va glomerullarda (g) kuzatildi. davomidabuyrakrivojlanishi, -tubulin, inversiya va DVL-1umumiy ifodasi pasaygan, tug'ruqdan keyingi davrda esa biroz ortgan. -tubulin va inversiyaning eng yuqori ifodalari dct va g ni, yuqori DVL-1 esa pctni xarakterlaydi. -MCDK, FSGS va CNFda tubulin, inversiya va DVL-1 ifoda naqshlaribuyraklarsog'lom nazoratdan sezilarli darajada farq qiladi. Sog'lom bilan solishtirgandabuyraklar, patologik jihatdan o'zgarganbuyraklardismorfik birlamchi kiprikchalari bor edi. -tubulin, inversiya va DVL-1 ning turli ifoda dinamikasibuyrakishlanma, kanonik va kanonik bo'lmagan Wnt-signallari o'rtasidagi o'tish normal holat uchun zarur ekanligini ko'rsatishi mumkinbuyrakmorfogenez. Bundan farqli o'laroq, ularning patologik jihatdan bezovta qilingan ifodasibuyraklaranormal birlamchi siliya bilan bog'liq bo'lishi mumkin, bu esa surunkali holatga olib keladibuyrak kasalliklari.
Kalit so‘zlar:inson buyragi rivojlanishi; -tubulin; inversin; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; buyrak, buyrak
CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK KASALLIKLARINI SOZLADI
Kirish
Aniq yoki metanefrikning rivojlanishibuyraklarhomiladorlikning beshinchi haftasida (GW) boshlanadi, keyinchalik doimiy buyraklarni hosil qilish uchun doimiy ravishda farqlanadi [1,2]. Metanefrik mezenxima va siydik pufagi o'rtasidagi signalizatsiya o'zaro ta'siri to'g'riligini ta'minlaydibuyraknefrogenez davrida rivojlanish. Qisqacha aytganda, siydik pufagi metanefrik mezenximada mezenximadan epiteliyaga o'tishni (MET) qo'zg'atadi, u kondensatsiyalanadi va hosil bo'ladi.buyrakpufakchalar, keyin vergul shaklidagi va S shaklidagi jismlar va nihoyat glomeruli shakllanishiga olib keladi [3]. Buning evaziga mezenxima siydik pufagining keyingi shoxlanishini keltirib chiqaradi. Metanefrik buyraklar inson rivojlanishining 11-haftasida ishlab chiqarish birliklariga aylanadi. Biroq, nefrogenez homila rivojlanishining 34-36 xaftaligida, ko'plab shoxlanish hodisalari tugaganda tugaydi, ammo buyraklarning keyingi differentsiatsiyasi postnatal davrda davom etadi [4,5]. Ushbu murakkab o'zaro ta'sirlarning buzilishi buyrak va siydik yo'llarining turli xil tug'ma anomaliyalariga olib keladi (CAKUT), shu jumladan displaziya, polikistik buyrak kasalligi, multikistik displastikbuyrak kasalligi(MCDK), natijada surunkali holatga olib keladibuyrak kasalligi(CKD) [6].
Ushbu tadqiqotda biz birlamchi siliya ko'rinishiga va oddiy nefrogenezda muhim rol o'ynaydigan Wnt-signal yo'liga e'tibor qaratdik.buyrako'tkir yoki surunkali keyingi ta'mirlash jarayonibuyrak kasalligi[7]. Nefrogenez davrida birlamchi kiprikchalarning mavjudligi va rivojlanishining ko'pligibuyraksiliyer kasalligi bilan og'rigan bemorlarda yuzaga keladigan nuqsonlar, kiprikchalarning normal ishlashi uchun haqiqiy asosiy funktsiya zarurligini ko'rsatadi.buyrakorganogenez [8,9]. Birlamchi siliy to'qima gomeostazi uchun muhim bo'lgan mikrotubulaga asoslangan organella bo'lib, bu erda -tubulin asosiy komponentdir [10]. O'lmas hujayralardagi -tubulin atsetilatsiyasining yo'qolishi epiteliyadan mezenximaga o'tishni (EMT) qo'zg'atadi, bu esa atsetillangan -tubulinning mikronaychalarni barqarorlashtirishda muhimligini anglatadi [11]. Inson rivojlanishi davomida birlamchi siliya vositachiligidagi Wnt yo'li hujayra proliferatsiyasi, differentsiatsiyasi va to'qimalar morfogenezini ta'minlaydi [12]. Birlamchi siliya funktsiyasi buzilgan va Wnt-signalizatsiya yo'li buzilgan bolalarning ko'pchiligida konjenital KBB rivojlanadi.buyrakkasalliklar deyarli yarmi uchun javobgardir [13]. Bolalarda eng ko'p uchraydigan konjenital kist kasalligi multikistik displastik hisoblanadibuyrak kasalligi(MCDK) [14]. Aloqa qilmaydigan bir nechta kistalar [15] va normal bo'lmaydibuyrakparenxima MCDK uchun xarakterli mikroskopik topilmalardir. Fokal segmental glomeruloskleroz (FSGS) oxirgi bosqichga olib keladigan eng keng tarqalgan glomerulyar kasalliklardan biridir.buyrak kasalligi[16]. Dastlab, FSGS o'ziga xos xususiyatga ega bo'lib, faqat glomerulyarlarning ozchilik qismini va segmentarni o'z ichiga oladi, glomerulyar doiraning faqat segmentidagi o'zgarishlarni o'z ichiga oladi [17]. Fin tipidagi konjenital nefrotik sindrom (KNF) kam uchraydigan avtosomal retsessiv meros bo'lib o'tadigan kasallikdir.buyrak kasalligiProksimal kanalchalarning sistogenezi bilan bog'liq bo'lgan protein yo'qotilishining prenatal epidemiyasi [18] bilan ifodalanadi [19]. Birlamchi glomerulyar kasalliklarning ko'p shakllari buzilgan glomerulyar filtratsiya to'sig'i natijasida proteinuriyani rivojlantiradi [20]. Ko'pgina tadqiqotlar podotsitlarning shikastlanishi va disfunktsiyasi CKD proteinuriyasining patogenezida o'ziga xos rolga ega ekanligini ko'rsatadi [21]. Vukojevich va boshqalar tomonidan o'tkazilgan tadqiqot. CNFda kiprikli va yomon tabaqalangan podotsitlar sonining ko'payishini ko'rsatadi [22]. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Wnt / -katenin signalizatsiya yo'li podotsitlar disfunktsiyasini proteinuriya bilan tartibga solishda asosiy rol o'ynaydi [23]. Ikkita asosiy Wnt signalizatsiya yo'llari mavjud, ulardan biri kanonik -kateninga bog'liq va boshqa kanonik bo'lmagan, -kateninga bog'liq emas. Sichqoncha paytidabuyrakRivojlanish jarayonida kanonik Wnt-signalizatsiya siydik yo'llarining kurtaklari uchlarida va S shaklidagi jismlarda faoldir [24]. Bundan tashqari, kanonik signalizatsiya orqali Wnt nefrogenez paytida METni saqlashda muhim ahamiyatga ega [25]. Ya'ni, Dvl ni o'z ichiga olgan oqsil kompleksining membrana retseptorlari bilan bog'lanishi Wnt yo'lining faollashishi uchun majburiydir, bu yo'lning asosiy komponentlarini o'chirib qo'yishda nefrogen zonaning yo'qligi tufayli erta perinatal o'limga olib keladi.buyrak[25].
Kanonik va kanonik bo'lmagan Wnt signalizatsiya yo'llari o'rtasida molekulyar kalit sifatida muhim protein inversiya ekanligi aniqlandi [26]. Turli oqsillarning inversiya bilan o'zaro ta'siri aniqlangan bo'lsa-da, uning aniq funktsiyasi hali to'liq oydinlashmagan. Inbuyrakepiteliy hujayralari, inversiya birlamchi kiprikchada joylashgan bo'lib, siliyer oqsil vazifasini bajaradi [27]. Bundan tashqari, inversiya kulturalarida tubulin bilan barqaror kompleks hosil qiladibuyrakhujayralar va ular in vivo kolokalizatsiyalanadi [27,28]. Inversiya pronefrik tizimning erta morfogenezida va rivojlanish jarayonida chap-o'ng simmetriyani aniqlashda muhim rol o'ynaydi [29,30]. Hujayra membranasiga sitoplazmatik Dvlni jalb qilishda kanonik va kanonik bo'lmagan Wnt-signal yo'llari uchun muhim voqea. Oldingi topilmalar inversiya va Dvl buyrak epitelial hujayralarida kolokalizatsiya qilishini ko'rsatganligi sababli, inversiyaning kanonik bo'lmagan signalizatsiyada ham roli bo'lishi mumkinligini taxmin qilish mumkin. Inversiya vositasida Wnt-signalining disregulyatsiyasi tubulalarda aberrant proliferatsiyani keltirib chiqaradi [31]. Genetik testlar avtosomal-dominant Robinow sindromi bo'lgan bemorlarda DVL{8}} mutatsiyasini aniqladi, bu urogenital va ba'zi bemorlarda heterojen kasalliklarni ko'rsatadi.buyrakanomaliyalar [32].
CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK DIALIZINI YANGILAYDI
Turli hayvonlar modellarida -tubulin, inversiya va DVL-1 ning rivojlanish ifoda namunasi tekshirilgan. Shunday qilib, ularning Xenopus laevis pronefrlarida ifodalanishi intravital mikroskopiya [31] yordamida tasdiqlangan bo'lsa, ular konfokal mikroskopiya va mass-spektrometriya [33] yordamida murin proksimal naycha hujayralaridan olingan hujayra chiziqlarida topilgan. Bundan tashqari, yorug'lik mikroskopiyasi va ikki tomonlama immunofluoresans sichqonlarning bo'limlarida ularning mavjudligini aniqladibuyraklar[34]. Inversion nokautli sichqonlar ustida olib borilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, kattalashgan, tarqoq kistalarbuyrakmedulla va korteks situs visseral inversiya bilan bog'liq [35]. Odamlarda inversiya mutatsiyasi homiladorlikning to'xtashiga olib keladigan infantil nefronoftiza bilan namoyon bo'ldi [36]. Ko'plab tadqiqotlarga qaramaybuyrak-tubulin, inversiya va DVL-1 ifoda shakli va funktsiyasi, bizning ma'lumotlarimiz bo'yicha, inson homila va tug'ruqdan keyingi inson to'qimalarida bu oqsillarning ekspression naqshlari hali o'rganilmagan va korrelyatsiyaga erishilgan. Bundan tashqari, inson rivojlanishining dastlabki davridagi inversiya va DVL-1 ifodasini hisobga olgan holda dalillar haqida xabar berilmagan. Shu sababli, ushbu tadqiqot sog'lom odamning homila va postnatal bosqichlarida -tubulin, inversiya va DVL-1 ning fazoviy va vaqtinchalik ifoda modelini tahlil qilishga qaratilgan.buyraklar, shuningdek, ichidabuyrakMCDK, FSGS va CNF to'qimalaribuyraklarushbu ob'ektlar o'rtasida mumkin bo'lgan etishmayotgan aloqani o'rnatish uchun. Ya'ni, biz -tubulin, inversiya va DVL{1}} oqsillarining buzilgan ifoda naqshlari asosiy sistogenez jarayoni va birlamchi siliyaning anormal funktsiyasi bo'lishi mumkinligini taklif qilamiz, bu esa surunkali shaklga olib keladi.buyrak kasalliklari.
Natijalar
Rivojlanish va tug'ruqdan keyingi davrni tahlil qilishbuyrakto'qimalarning aniq farqlangan tuzilmalarida amalga oshirildibuyrak:proksimal o'ralgan tubulalar (pct), distal burama tubulalar (dct) va glomeruli (g). Tahlil qilingan rivojlanish bosqichlarida va tug'ruqdan keyingi davrdabuyrakto'qimalar, -tubulin, inversiya va DVL-1 ijobiy ifoda namunalarini ko'rsatdi, ammo intensivlik, taqsimot va miqdor jihatidan farqlar bilan. Patologik tahlilbuyrak to'qimasiMCDK, FSGS va CNF sog'lom buyrak to'qimasini nazorat qilish bilan solishtirganda ijobiy hujayralarning to'liq tasviri bo'yicha amalga oshirildi.
2.1. Sog'lom va patologik o'zgargan inson buyrak to'qimalarining yorug'lik mikroskopiyasi, elektron mikroskopiyasi va immunogistokimyosi (-tubulin)
2.1.1. Sog'lom postnatal buyrak nuri
Postnatal mikroskopbuyrakto'qimalar yaxshi aniqlanganligini ko'rsatadibuyraktuzilmalar, medulla va korteks o'rtasidagi aniq farq va kortikal mintaqada pct, dct va g ning shakllanishi. -tubulinning immunogistokimyoviy bo'yalishi har bir quvurli hujayraning apikal hujayra yuzasi markazida va 0da bitta asosiy kiprik borligini aniqlaydi.0 glomerulyar hujayralar yuzasida 18% ± 0,00014% SD. Elektron mikroskop tubulaning apikal hujayra yuzasida bazal tanadan kelib chiqadigan faqat bitta asosiy siliy mavjudligini ko'rsatadi (1a-rasm).
2.1.2. CNF
Tahlil qilingan g larning aksariyati kichikroq va lobulatsiyalangan (80 foiz), ozchilik esa normal o'lchamda yoki gipertrofik (20 foiz, n=100). g ning segmental yoki global sklerozi aniqlanadi, pct va dct qisman kengaygan va atrofik epiteliy bilan qoplangan. Ultrastrukturada mikrovilli yo'qolishi va yadrolarning multifragmentatsiyasi bilan hujayra balandligining pasayishi kuzatiladi. Podositlarda oyoq jarayonlari diffuz tarzda yo'qoladi. Naychali birlamchi kiprikchalar, ayniqsa proksimal kanalchalarning kistalarida tartibsiz bo'lib, uzunligi va sitoplazmatik holatida o'zgarishlarni ko'rsatadi (1b-rasm).
2.1.3. MCDK
Buyrak to'qimalarida sporadik yetilmagan va etuk g ni topish mumkin.Buyrakto'qimalar ko'plab oval kistalar bilan to'ldirilgan. Ustunli epiteliya hujayralari kistalarni qoplaydi va bo'shashgan biriktiruvchi to'qima bilan o'ralgan. -tubulinning immunogistokimyoviy bo'yalishi epiteliy hujayralari yuzasida bir nechta uzun va tartibsiz birlamchi kiprikchalarni ko'rsatadi (1c-rasm).
2.1.4. FSGS
G ning 90 foizida keng segmentar skleroz (n=100) topiladi, bu interstitsial fibroz va quvurli shikastlanish belgilari bilan bog'liq. Mikrovilli yo'qolgan epiteliya hujayralarining balandligining pasayishi elektron mikroskopda, endotelial hujayralar va mezangial hududlarda esa muntazam ultrastruktura mavjud. Elektron mikroskopda distal naychali hujayra yuzasida nihoyatda uzun va dislokatsiyalangan (markazlashtirilmagan) kiprikcha kuzatiladi (1e-rasm). Podositlar keng mikrovillus to'qimalari bilan oyoq jarayonlarining diffuz yo'qolishini ko'rsatadi. A-tubulinning immunogistokimyoviy bo'yalishi epiteliya hujayralari yuzasida bir nechta uzun va tartibsiz birlamchi siliyalarni ko'rsatadi (1c-rasm).
2.2. Tubulin, inversiya va DVL-1- ni immunohistokimyoviy bo'yash va tug'ruqdan keyingi tug'ruqdan keyingi rivojlanish va sog'lom inson buyraklarining statistik tahlili
14, 15 va 16 homiladorlik haftalaridabuyrakto'qimalarda nefron shakllanishining turli rivojlanish bosqichlari mavjud: metanefrik chashkalardan,buyrakpufakchalar S shaklidagi nefronlarni boshqarish uchun bosqichlarni o'tkazadi va shu bilan tashqi qobiqda nefrogen zonani hosil qiladi (2-rasm). Differentsial pct, dct va g ga yaqinroq kortikal hududlarda kuzatilishi mumkinbuyrakmedulla. 22-GVt davrida medulla va korteks qismlari aniq ajralib turdi, 38-GWda esa,buyraktuzilmalar pct, dct va g ning etuk shakllarini o'z ichiga olgan yuqori darajada farqlangan ko'rinadi
2.2.1. a-tubulin
Rivojlanish jarayonida a-tubulin barcha rivojlanayotganlarda kuchli namoyon bo'ladibuyraktuzilmalar, birinchi navbatda, Bowman kapsulasi, g, pct va dct parietal epitelial hujayralari yuzalarida birlamchi siliya shaklini ko'rish. Ichidabuyrakto'qimalarda, pct hujayralarining 82-97 foizi a-tubulinni ifodalaydi, dctda esa 38-GWda 99 foizdan 72 foizga tushadi (3-rasm, 1-jadvalga qarang). Rivojlanishning turli bosqichlari orasida a-tubulinning eng kuchli ifodasi 16-GW g da topiladi.buyraklar, ijobiy hujayralarning 93 foizini o'z ichiga oladi. 14, 15 va 22-GVt (3a,b, 1-jadvalga qarang), g hujayralarining taxminan 7{9}} foizi a-tubulinni ifodalaydi, eng kam ifoda esa 38-GVda kuzatiladi (p <0,01) ijobiy="" hujayralarning="" 34="" foizi="" bilan="" (3c-rasm).="" postnatal="">buyraktoʻqima (1.5-yosh va 7-yoshbuyraklar), a-tubulinga nisbatan eng kuchli immunoreaktivlik pct va dct ning apikal hujayra yuzasida kuzatiladi (3d-f-rasm). a-tubulin ifodasi dct perinuklear sitoplazmasida va Bowman kapsulasi parietal epitelial hujayralarida ham mavjud. a-tubulin hammasini bo'yadibuyrakmusbat hujayralarning o'rtacha 50% pct, 94% dct va 85% g bo'lgan tuzilmalar (3f-rasm). Dct bo'yoqlari pct dan sezilarli darajada farq qiladi (p <0,0001). barcha="" tekshirilgan="" tuzilmalar="" a-tubulinga="" ijobiy="" bo'yadi,="" musbat="" hujayralarning="" 77="" foizi="" pct,="" 72="" foizi="" dct="" va="" 58="" foizi="" g="">
Shakl 3. Rivojlanayotgan va tug'ruqdan keyingi inson buyrak to'qimalarida -tubulin va DAPI ning immunofluoresans bo'yalishi (a-e). 14, 15/16, 38 GW (a-c) buyraklari;buyraklar1.5- va 7- yoshli bolalar (d,e). -tubulinning ijobiy bo'yalishi (strelkalar) korteksdagi har bir tuzilishda rivojlanish va tug'ruqdan keyingi fazalar (a-e), proksimal konvolutsiyalangan kanalchalar (pct), distal burama kanalchalar (dct) va glomeruli (g) orqali ko'rsatiladi. Pct (d) va dct (a-c,e) da birlamchi kiprikchalar tafsilotlari kattalashtirish ko'rsatkichlari (oq quti) sifatida ko'rsatilgan. Kattalashtirish ×40, masshtab paneli 100 mkm. Tubulin musbat hujayralarning har bir tuzilishda rivojlanishning turli bosqichlarida va tug'ruqdan keyingi davrda taqsimlanishi (f) grafikda ko'rsatilgan. Grafik (g) (kuzatilgan tuzilmalardagi oqsil-musbat hujayralarning umumiy soni) rivojlanish vaqtiga (chiziqli regressiya) va -Tubulinning DVLga-1 o'zaro bog'liqligiga bog'liq bo'lgan protein ifodasini ko'rsatadi (ikki tomonlama ANOVA, keyin esa) SIDAKning posthoc testi). Ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida ko'rsatilgan.
Rivojlanishning turli bosqichlarida va tug'ruqdan keyingi davrda -tubulin-musbat hujayralarning tuzilishi bo'yicha taqsimlanishi (f) grafikda ko'rsatilgan. Grafik (g) (kuzatilgan tuzilmalardagi oqsil-musbat hujayralarning umumiy soni) rivojlanish vaqti (chiziqli regressiya) va -tubulinning DVL-1 bilan rivojlanish va kamolotga (ikki tomonlama ANOVA keyin) o'zaro bog'liqligiga bog'liq protein ifodasini ko'rsatadi. Sidakning post hoc testi). Ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida ko'rsatilgan.
2.2.2. Rivojlanayotgan va sog'lom postnatal buyraklardagi inversiya va DVL-1 va DAPI yadroviy bo'yoqlari uchun ikki marta immunofluoresans bilan bo'yash. Rivojlanayotgan va tug'ruqdan keyingi buyrak to'qimalarida inversiya ifodasi
14, 15 va 16 GW da inversiya kuchli granulyar ifodani va pct va dct sitoplazmasida engil granüler ifodani ko'rsatadi (4a, b-rasm), 22 va 38 GWda (4c-rasmga qarang), kuchli g da ijobiy ifoda kuzatiladi (1-jadval). 14 va 22 GVt oralig'ida hujayralarning taxminan 50 foizi versiyani ifodalaydi. 16-GWda pct hujayralari hujayralarning 73 foizida inversiyani ifodalaydi, 38-GWda esa hujayralarning 29 foiziga (p <0.05) kamayadi="" (4f-rasmga="" qarang).="" inversiyaning="" ijobiy="" ifodasi="" homiladagi="" dct="" va="" g="" hujayralarining="" taxminan="" 80-90="" foizida="">buyrak14 va 16-GW to'qimalari, 38-GW (p < 0.05,="" p="">< 0,0001,="" mos="" ravishda),="" hujayralarning="" 66="" foizi="" ijobiy="" bo'lgan="" dctdagi="" eng="" past="" ifoda="" bilan.="" postnatal="">buyraklar, pct apikal hujayra membranasida kuchli bo'yaladi, dct esa asosan bazal hujayra membranasida va perinuklear sitoplazmada bo'yaladi (4d,e-rasm). O'sha bosqichda biz o'rganilgan barcha narsalarda inversiya ifodasini topdikbuyraktuzilmalar, shu jumladan pct, dct va g, musbat hujayralarning o'rtacha ifodasi bilan pct uchun 92 foiz, dct uchun 88 foiz va g uchun 90 foiz (4f-rasm). Biz tuzilmalar orasidagi inversiya ifodasining signal kuchida sezilarli farqni kuzatmadik. Inversiyaning eng yuqori ifodasi g da topiladi, ijobiy hujayralarning o'rtacha 94 foizi (4f-rasm). G ning bo'yalishini (bu erda hujayralarning 94 foizi ijobiy bo'yalgan) pct bilan, hujayralarning 58 foizi ijobiy bo'yalgan (p < 0.01)="" va="" hujayralarning="" 49="" foizi="" bo'yalgan="" dct="" bilan="" solishtirganda="" sezilarli="" farq="" bor.="" ijobiy="" (p=""><0,0001,>
DVL{0}} Rivojlanayotgan va tug'ruqdan keyingi buyrak to'qimalarida ifodasi
Homila davrida pct, dct va g sitoplazmasida DVL{0}} ning engil va kuchli ifodalanishi kuzatiladi (4a-c-rasm, 1-jadvalga qarang). Pctda hujayralarning 76-{4}} foizi 14-22-GVtda DVL-1 ni ifodalaydi, 38-GWda esa musbat hujayralarning 57 foizi mavjud (4g-rasm). 14- va 15-GVt larda hujayralarning 68–7{31}} foizi DVL-1 ni ifodalaydi, 16 va 22-GVtda musbat hujayralar soni 42–5 tagacha kamayadi{{41} } foiz , 38-GW ifodasida esa (p <0,001), dct="" hujayralarining="" 19="" foizida="" kuzatiladi.="" dvl-1="" ifodasi="" homila="" fazalarida="" g="" ga="" oshadi:="" 14-gwda="" u="" 6="" foizni="" tashkil="" etadi,="" 15,="" 16="" va="" 22-gvda="" esa="" 10="" foizgacha="" oshadi="" (p=""><0,01). 38="" gvt="" quvvatda="" g="" hujayralarining="" 14="" foizi="" dvl-1="" ni="" ifodalaydi="" (4="" g-rasm).="" postnatal="" davrda="" dvl{37}}="" immunoreaktivligi="" pct="" va="" dct="" sitoplazmasida="" tarqaladi="" (1-jadval)="" (4d,e-rasm).="" signal="" barcha="" tekshirilgan="" tuzilmalarda,="" lekin="" asosan="" perinuklear="" sitoplazmada="" uchraydi.="" dvl{40}}="" ifodasining="" intensivligi="" dct="" va="" g="" ga="" nisbatan="" pctda="" sezilarli="" darajada="" yuqori="" (p=""><0,01). pct="" va="" dct="" dagi="" hujayralarning="" 39-45="" foizi="" dvl-1="" ni="" ifodalaydi,="" g="" da="" hujayralarning="" 21="" foizi="" ijobiydir="" (4-rasm="" g).="" turli="" xil="" immunoreaktiv="" hujayralar="" ulushi="" o'rtasida="" sezilarli="" farq="">buyraktuzilmalar. DVL{0}} immunoreaktiv hujayralar ulushi mos ravishda %34%, dct 36% va g da 27% ni tashkil qiladi (4g-rasm).
Shakl 4. Rivojlanayotgan va tug'ruqdan keyingi buyrak to'qimalarida inversiya (yashil), DVL-1 (qizil) va DAPI (ko'k) ning ikki marta immunofluoresans bilan bo'yalishi (14-38-chi GW, 1.5- va {{6). }} yoshli buyrak to'qimalari). Ijobiy binoni (strelkalar) har bir strukturada rivojlanishning barcha bosqichlarida (a-c) va tug'ruqdan keyingi davrda (d, e) ko'rsatiladi. Korteksga qiziqish tuzilmalari bilan birlashtirilgan mikrofonlar: proksimal konvolutsiyali tubulalar (pct), distal burama tubulalar (dct) va glomeruli (g). Inversiya/DVL-1 (strelka boshi) kolokalizatsiyasi birlashtirilgan mikrofotosuratlarda ko'rsatilgan. Salbiy nazorat bo'yoqlari inversiya va DVL-1 (a) da qo'shimchalar sifatida ko'rsatilgan. Eritrositlarni dct yaqinida kuchli bo'yalgan hujayralar sifatida ko'rish mumkin. Tafsilotlar kattalashtirish ko'rsatkichlari sifatida ko'rsatilgan. Kattalashtirish ×40, masshtab paneli 100 mkm. Rivojlanish va tug'ruqdan keyingi bosqichlarda buyrak tuzilmalarida (pct, dct, g) inversiya va DVL-1 ning hujayralardagi dinamik ijobiy taqsimoti (f,g) grafiklarda ko'rsatilgan. Grafik (h) rivojlanish vaqtiga (chiziqli regressiya) va rivojlanish va yetilish orqali DVLga inversiyaning oʻzaro bogʻliqligiga bogʻliq (tuzilmalardagi musbat hujayralarning umumiy soni) (ikki tomonlama ANOVA, keyin Sidakning post hoc testi) koʻrsatilgan. ). Ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida ko'rsatilgan.
Rivojlanish jarayonida buyrak g, dct va pct sitoplazmasida inversiya va DVL-1ning birgalikda ifodalanishi kuzatiladi (4a-c, birlashishga qarang). Postnatal davrda inversiya va DVL-1 ning birgalikda ifodalanishi pct va dct dagi quvurli hujayralarning turli hujayrali bo'linmalarini xarakterlaydi, g dagi birgalikda ifoda esa inversiya ifodasining kuchli tarqalishi bilan tavsiflanadi (4d-rasmga qarang, birlashma). ). Postnatal buyraklardagi 7-yilda inversiya va DVL-1ning birgalikda ifodalanishi dct va pct ning quvurli hujayralarida va DVL bilan solishtirganda inversiya ifodasi biroz ustunlik qiladigan g da kuzatiladi-1 (4e-rasm, birlashtirish).
2.2.3. Turli xil rivojlanish bosqichlari va postnatal buyraklar o'rtasidagi Tubulin, Inversiya va DVL-1 ifodasidagi farqlar
Xomilalik buyrak to'qimalarining pct qismidagi -tubulin-musbat hujayralar soni 7- yoshli bolalarning buyrak to'qimalariga (13-chi (p < 0.0)="" nisbatan="" statistik="" jihatdan="" sezilarli="" darajada="" yuqori="" edi.="" {11}}1),="" 15-chi="" (p="">< 0.0001)="" va="" 16-chi="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" erta="" xomilalik="" davrlardagi="" dct="" (13,="" 15,="" 16="" va="" 22-gv)="" 38-gw="" va="" 1.{19}}bolalarning="" buyrak="" to'qimalariga="" nisbatan="" ko'proq="" ijobiy="" hujayralarga="" ega="" (mos="" ravishda="" p=""><0,0001, 3f-rasm).="" rivojlanishning="" turli="" bosqichlari="" solishtirilganda,="" biz="" 13-chi="" (p=""><0.0001), 15-chi="" (p=""><0.00001), 22-chi="" (p=""><0.001) va="" 38-chi="" (p=""><0.0001) gw="" bilan="" solishtirganda,="" biz="" inversiya="" ifodasining="" past="" darajalarini="" topdik.="">buyrak1.5-yoshli bolaning toʻqimasi. Dctda 16-GW dan 38-GW buyrak to'qimalariga nisbatan statistik jihatdan sezilarli darajada pastroq inversiya ifodasi aniqlandi (p < 0.0001).="" bundan="" tashqari,="" 7-="" yoshli="" bolaning="" buyrak="" to'qimalarida="" dctda="" inversiyaning="" pastroq="" ifodalanishi="" kuzatildi;="" 13,="" 15="" (p="">< 0,001,="" ikkalasi),="" 16="" va="" 1.5-yoshli="" buyrak="" to'qimasini="" 7-="" yoshli="" buyrak="" to'qimalarining="" dct="" bilan="" solishtirish="" (p=""><0,00001, mos="" ravishda,="" 4f-rasm).="" dvl{22}}="" ifodasining="" turli="" bosqichlarda="" kuzatilgan="" signali="" shuni="" ko'rsatdiki,="" 13-chi="" (p=""><0,01), 15-chi,="" 16-chi="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">
2.2.4. Rivojlanayotgan va tug'ruqdan keyingi buyrak to'qimalarida -tubulin ifodasi va DVL-1 ga inversiya o'rtasidagi bog'liqlik
- Tubulin va inversiya ifodalari butun rivojlanish bosqichlarida va tug'ruqdan keyingi buyrak to'qimalarida DVL{1}} ifodasi bilan taqqoslandi. -tubulin barcha kuzatilgan bosqichlarda DVL-1 ifodasi bilan solishtirganda statistik jihatdan yuqori ifodaga ega edi (p < 0.001,="" 3g-rasm).="" kuzatilgan="" barcha="" bosqichlarda="" inversiya="" dvl-1="" bilan="" solishtirganda="" yuqoriroq="" ifodaga="" ega="" bo'ldi="" (p=""><0,0001,>
2.2.5. Immunogistokimyoviy bo'yashni -tubulin, versiya va DVL-1- bilan solishtirish va patologik o'zgargan buyrak to'qimasini statistik tahlil qilish (MCDK, CNF, FSGS) -tubulin. nazorat guruhi sifatida sog'lom postnatal buyrak to'qimalariga (mos ravishda p < 0.0001).="" displastik="" buyrak="" to'qimalari="" nazorat="" guruhiga="" nisbatan="" sezilarli="" darajada="" yuqori="" ifodalangan,="" fsgs="" va="" cnf="" sog'lom="" nazorat="" bilan="" solishtirganda="" -tubulinning="" sezilarli="" darajada="" past="" ifodasini="" ko'rsatdi="">
Inversiya
Inversiya MCDK ning tartibsiz epiteliy hujayralari va tubulalari sitoplazmasida ifodalanadi (5a-rasm). CNFda inversiya ifodasi g va dct ni xarakterlaydi, pct kistalarida esa kamroq intensiv namoyon bo'ladi (5b-rasm). FSGSda inversiya g va dctda kuchli ifodalanadi, lekin pct kistalarida kamroq intensivlik bilan ifodalanadi (5c-rasm). Inversiyaning fazoviy ifodasi MCDK, FSGS va CNF (mos ravishda p < 0.0001)="" bilan="" solishtirganda="" sog'lom="" buyrak="" to'qimalarida="" (5g-rasm)="" statistik="" jihatdan="" sezilarli="" yuqori="" bo'yash="" tezligini="">
Shakl 5. MCDK (a), CNF (b) va FSGS (c) da patologik buyrak to'qimalarida inversiya (yashil), DVL-1 (qizil) va DAPI (ko'k) ning ikki marta immunofluoresans bilan bo'yalishi: tubulalar (t) , glomeruli (g), pct kistasi (c), pct epiteliya hujayralarining balandligi (*). Inversiya va DVL-1 (strelka boshlari) tuzilishi va hujayraning birgalikda lokalizatsiyasi birlashtirilgan boʻlimlarda koʻrsatilgan. Salbiy nazorat bo'yoqlari inversiya va DVL-1 (a) da qo'shimchalar sifatida ko'rsatilgan. Kattalashtirish ×40, masshtab paneli 10{{20}} mkm. MCDK, FSGS va CNFda -tubulin (d) va inversiya (e) ning DVL-1 ifodasiga aloqasi (ikki tomonlama ANOVA, keyin SIDAKning post hoc testi). Sog'lom nazorat bilan solishtirganda FSGS, CNF va MCDK pct epitelial hujayra balandligidagi farq (f) (bir tomonlama ANOVA, keyin Tukeyning post hoc testi, n=50). MCDK, CNF va FSGSda -tubulin, inversiya va DVL-1 ning umumiy ijobiy hujayralar foizidagi farq, sog'lom nazorat (g-i), bir tomonlama ANOVA, keyin Tukeyning post hoc testi). Ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida ko'rsatilgan. Muhim farqlar p-qiymati bilan ko'rsatilgan (* p <0,05, **="" p=""><0,01, ****="" p=""><0,0001). dvl-1="" dvl-1="" faqat="" mcdk="" ning="" tartibsiz="" kanalchalarida="" juda="" yumshoq="" ifodalanadi,="" cnfda="" esa="" uning="" ifodasi="" dct="" va="" g="" ni="" xarakterlaydi="" (5a,b-rasm).="" fsgsda="" dvl{25}}="" g,="" dct="" va="" pctda="" engil="" reaktivlik="" sifatida="" kuzatiladi="" (5c-rasm).="" dvl{27}}="" ga="" bo'yalgan="" sog'lom="" buyrak="" to'qimalari="" mcdk="" va="" fsgs="" dan="" farqli="" o'laroq="" (5-rasm)="" sezilarli="" darajada="" yuqori="" bo'yash="" tezligini="" ko'rsatdi="" (p=""><0,0001, ikkalasi),="" cnf="" uchun="" sezilarli="" farq="">
2.2.6. Patologik o'zgargan buyrak to'qimasida (MCDK, CNF, FSGS) -tubulin ifodasi va DVL-1 ga inversiya o'rtasidagi bog'liqlikMCDK, FSGS va CNF da -tubulin DVL-1 dan sezilarli darajada yuqori bo'yalgan (p < 0.0001,="" mos="" ravishda,="" 5d-rasm).="" mdck="" (p=""><0.0001) va="" fsgs="" (p=""><0.01, 5e-rasm)="" da="" dvl="" -1="" bilan="" solishtirganda="" inversiya="" sezilarli="" darajada="" yuqori="">
2.2.7. Sog'lom nazorat va patologik o'zgargan buyrak to'qimalari (MCDK, CNF, FSGS) o'rtasidagi proksimal konvolyutsiyalangan tubulalarning epitelial hujayra balandligidagi farqlarPct epiteliy hujayralarining balandligi (guruhda n {0}}) sog'lom buyrak to'qimalaridagi tubula hujayralari va patologik o'zgargan buyrak to'qimalari o'rtasida taqqoslandi (5b,c,f-rasm). HCda epiteliya hujayralarining o'rtacha balandligi 12,91 mkm ± 1,847 mkmni tashkil etdi va CNF va FSGS bilan solishtirganda sezilarli darajada yuqori edi (mos ravishda p < 0.0001).="" cnf="" pct="" da="" o'rtacha="" hujayra="" balandligi="" 9,011="" µm="" ±="" 1,453="" µm,="" fsgsda="" esa="" 8,114="" µm="" ±="" 0,9248="" µm="" edi.="" mcdk="" ning="" pct="" epitelial="" hujayralari="" hc="" bilan="" solishtirganda="" balandlikda="" (12,17="" mkm="" ±="" 1,476="" mkm)="" sezilarli="" o'zgarishlarni="">
2.2.8. Sog'lom nazorat va patologik o'zgargan buyrak to'qimalari (MCDK, CNF, FSGS) o'rtasidagi birlamchi siliya uzunligidagi farqlar
Birlamchi siliy uzunligi (har bir guruh uchun n= 50) HC va patologik o'zgargan buyrak to'qimalari o'rtasida taqqoslandi (6c-rasm). Sog'lom buyrak to'qimalari va MCDK -tubulin bilan bo'yalgan -tubulin silium bo'yashining o'ziga xosligini ta'minlash uchun (6a,b-rasm). Sog'lom buyrak to'qimalarida birlamchi siliy uzunligi 5,065 mkm ± 1,229 mkm, MCDK, CNF va FSGSda esa sezilarli darajada uzunroq edi (p).<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>
Munozara
Tadqiqotimizning maqsadi homilada a-tubulin, inversiya va DVL-1 ning immunohistokimyoviy ifodasini tekshirish edi.buyrakto'qima va postnatal buyrak to'qimalari. Bundan tashqari, sog'lom nazorat bilan solishtirganda, turli xil buyrak kasalliklarida a-tubulin, inversiya va DVL-1 ning ifodasi va bo'yalishi buzilgan yoki yo'qligini o'rganmoqchi edik. Ya'ni, boshqa tadqiqotchilarning buyrak rivojlanishida a-tubulin, inversiya va DVL-1 roliga katta qiziqishlariga qaramay, oldingi tadqiqotlarning aksariyatida hayvonlar yoki in vitro eksperimental modellar ishlatilgan. Bizga ma'lumki, bu homila va tug'ruqdan keyingi inson buyraklarida a-tubulinning inversiya va DVL-1 bilan ifodalanishi va lokalizatsiyasini ko'rsatgan va buyrakda qayd etilgan oqsillarning ekspressiyasini o'rgangan birinchi tadqiqotdir. MCDK, FSGS va CNF kabi kasalliklar. Bundan tashqari, yorug'lik va elektron mikroskopiya yordamida siliya uzunligi va tashqi ko'rinishidagi o'zgarishlarni tahlil qildik, chunki bizning oldingi tadqiqotimiz siliyer buzilishlar FSGF va CNF [19] da sistogenez bilan bog'liq bo'lishi mumkinligini ko'rsatdi.
Kanonik Wnt-signal yo'lida Wnt ligandlarining retseptorlari bilan bog'lanishi Dvl ni jalb qiladi [37]. Buyrak morfogenezining dastlabki bosqichlarida MET jarayonlari va hujayraning planar qutblanish yo'li Wnt signalizatsiyasi bilan boshqariladi. Wnt yo'lida vositachilik qilib, birlamchi siliya hujayra sitoskeletini va hujayra yo'nalishini, shuningdek, quvurli tuzilmaning uzayishini tashkil qilish orqali hujayra proliferatsiyasini, differentsiatsiyasini va to'qimalar morfogenezini [12] nazorat qiladi. Bizning tadqiqotimizda -tubulin, inversiya va DVL-1 buyrak tuzilmalarida mavjud bo'lib, ularning barchasi nafaqat xomilalik buyrak rivojlanishi davrida, balki 1.5- va {{9} buyrak to'qimalarida ham kolokalizatsiya qilingan. }} yoshli bolalar. Ushbu topilmalar tubulogenez jarayonida allaqachon isbotlangan Wnt-signal yo'lining faollashuvi bilan mos keladi [39]. Bundan tashqari, bizning natijalarimiz -tubulin va inversiya ifodasi DVL-1 bilan o'zaro bog'liqligini va ular ifoda naqshlari o'rtasida statistik jihatdan muhim farqni ko'rsatishini aniqladi. Bu eksperimental modellar bilan bog'liq, chunki sichqonlarda to'liq Dvl oqsillari oilasining mutatsiyasi gastrulyatsiya jarayonining etishmasligiga olib keladi, butun oqsillar oilasini o'z ichiga olmaydigan mutatsiyalar organ nuqsonlari bilan birga tugun kiprikchalarining joylashishidagi nuqsonlarni ko'rsatadi [40] . Oldingi topilmalar Xenopus pronephrosda inversiya hujayra migratsiyasida rol o'ynashini ko'rsatdi. Ushbu segment sutemizuvchilarning Henle halqasi va distal tubulalar bilan bog'liq bo'lganligi sababli, bu odamlarda buyrak rivojlanishida inversiyaning muhimligini ko'rsatishi mumkin [41]. Ushbu asosga muvofiq, oldingi tadqiqotlar inversiya genining mutatsiyasi anormal DVL-1 ifodasi vositasida 2-toifa nefronoftizaga olib kelishi mumkinligini aniqladi [42]. Wnt-signalizatsiya yo'lini tartibga solishda birlamchi siliyning roli munozarali bo'lishiga qaramay, tahlil qilingan buyrak namunalarida -tubulin inversiya va DVL-1 bilan kolokalizatsiyalanganligini aniqladik. Bundan tashqari, oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, birlamchi silium inversiya bilan birga Wnt-signal yo'liga ta'sir qilish orqali Dvl degradatsiyasini tartibga soladi [43]. Kistlarning rivojlanishi bilan bog'liq bo'lgan odamning buyrak kasalliklarida birlamchi siliyaning anormal lokalizatsiyasi va funktsiyasi kuzatilgan [19]. Xuddi shunday, ushbu tadqiqot CNF, FSGS va MCDK kabi patologik sharoitlarda birlamchi siliya shakllanishining morfologik o'zgarishlarini ham tasdiqladi. Oldingi topilmalar buyrakning shikastlanishidan keyin kanonik Wnt yo'lining haddan tashqari faollashishi buyrak to'qimalarining tuzilmaviy o'zgarishlariga olib kelishini tan oldi [44]. Aksincha, birlamchi siliyga yordam berishda kanonikdan nokanonik Wnt yo'liga o'tish roli berildi.buyrakta'mirlash. Bundan tashqari, transplantatsiya qilingan buyrak to'qimalarida kanonik Wnt yo'lining haddan tashqari faollashuvi buyrak fibroziga nisbatan ijobiy prognozli qiymatga ega ekanligi aniqlandi [45]. Agar kanonik Wnt yo'li kanonik bo'lmaganlar hisobiga ustunlik qilsa, natijada buyrak fibrozi nazariyasini qo'llab-quvvatlaydi. CNF va FSGSdagi pasaytirilgan -tubulin va inversiya ifodasi haqidagi topilmalarimiz kanonik bo'lmagan Wnt yo'lining harakatsizligini anglatadi, ayniqsa ikkala shart ham oxirgi bosqichga olib keladi.buyrak kasalligi.Ya'ni, birlamchi siliyning normal joylashishi va funktsiyasi muntazam Wnt yo'lini saqlab turish omili va shuning uchun normal rivojlanish uchun zaruriy shart bo'lishi mumkin, deb ishoniladi. Aksincha, agar Wnt yo'li kuchaytirilsa, bu hujayralar proliferatsiyasi va differentsiatsiyasining tartibga solinishiga olib kelishi mumkin, bu esa kanserogenezga olib keladi [46]. Yuqorida ta'riflanganidek, kanonik Wnt yo'li METning boshlanishi va nefronning shakllanishi uchun majburiydir, shu bilan birga uning buzilishi sabab bo'lishi mumkin.buyrakgipoplaziya [47]. Natijalarimiz sog'lom nazorat bilan solishtirganda MCDKda -tubulinning eng yuqori ifodasi bilan DVL-1 ning eng past ifodasini aniqlash orqali ushbu fikrni qo'llab-quvvatlaydi. Ushbu natijalar kanonik Wnt yo'lining eng past faollashuvini anglatishi mumkin, bu nefron shakllanishining yo'qligi uchun asosiy sabab bo'lishi mumkin. Aksincha, eng past DVL-1 ifodasi bilan eng yuqori -tubulin ifodasi bir nechta kistlarning topilmalarini tushuntirishi mumkin, chunki kanonik bo'lmagan Wnt yo'li bilan boshqariladigan uyushgan cho'zilish va hujayra polarizatsiyasi mavjud emas. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, inversiya Dvl ni degradatsiyaga yo'naltirish orqali kanonik Wnt signalizatsiya yo'lini inhibe qiladi [26]. Ularning o'zaro ta'siridagi bu qadam normal quvur cho'zilishi va joylashishni saqlashda kanonik Wnt-signalini inhibe qilish uchun zarur deb topildi. Inversiya mutatsiyasi kanonik Wnt signalizatsiyasining yuqori regulyatsiyasiga olib keladi, bu esa keyinchalik quvurli hujayralarda g'ayritabiiy proliferatsiyani keltirib chiqaradi. Bu bosqich sistogenezda hal qiluvchi ahamiyatga ega ekanligi isbotlangan [42], sichqonlarda inversiyaning nokauti polikistik buyrak kasalligiga olib keladi [48]. ning nazariyasiga ko'rabuyraksistogenez, inversiya "mikoprotein" deb hisoblanadi, chunki u birlamchi siliyaga joylashadi.buyrakquvurli hujayralar. Bizning tadqiqotimizda tahlil qilingan barcha bosqichlarda quvurli hujayralarning apikal hujayra yuzasida birlamchi siliya mavjud bo'lib, xomilalik bosqichlarda -tubulinning ifodasi postnatal davrga qaraganda kuchliroq bo'lgan.
CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK OG'RIG'INI YANGILAYDI
Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, birlamchi siliya funktsiyasi rivojlanish jarayonida -tubulinning disregulyatsiyasi bilan ta'sir qilishi mumkin, bu esa sistogenezga, buyraklarning anormal rivojlanishiga va bolalik davrida mumkin bo'lgan surunkali buyrak kasalligiga olib kelishi mumkin [31,49]. Bu MCDKda kuzatilgan qisqartirilgan va dismorfik birlamchi kiprikchalar yoki sog'lom nazorat bilan solishtirganda CNF va FSGS kengaygan kanalchalarida topilgan ko'p va o'ta cho'zilgan yoki joyidan siliya topilmalarimiz bilan mos keladi. Birlamchi siliya bilan tartibga solinadigan kanonik va nokanonik Wnt-signal yo'llari buyrakning normal rivojlanishi uchun majburiy deb hisoblanishini tasdiqlash uchun biz sog'lom nazorat bilan solishtirganda MCDKda inversiya va DVL{4}}ning sezilarli darajada past bo'yalganligini aniqladik. [31,49]. Buyrak rivojlanishining turli bosqichlarida -tubulin, inversiya va DVL-1 ning turli xil ifoda dinamikasi normal buyrak morfogenezi davomida kanonik va nokanonik Wnt-signal yo'llari o'rtasida almashinishini ko'rsatishi mumkin. Biz ularning almashinuvi kanonik yo'ldagi transkripsiyani yoki hujayralar migratsiyasi va polarizatsiyasi tartibini, kanonik bo'lmagan signalizatsiya yo'lida buyrak rivojlanishida aniqlashni taklif qilamiz. Ularning muvozanati va barcha tekshirilgan buyrak tuzilmalarida namoyon bo'lishi ularning buyrakning normal rivojlanishidagi muhim rolini anglatadi. Buyrakning normal rivojlanishi davrida (13-GW dan 38-GV gacha) -tubulin, inversiya va DVL-1 ning umumiy ifodasi buyrak toʻqimalari etuk morfologiyaga ega boʻlishi bilan kamayadi. 1.5- va 7- yoshli buyrak toʻqimalarida -tubulin va inversiya ifodasining biroz oʻsishini koʻrsatdi, bu esa kanonik boʻlmagan Wnt yoʻli tugʻilgandan keyin ham faol boʻlib qolishini tasdiqlaydi. Aksincha, DVL{19}} kamaygan ifoda namunasi bilan davom etadi, bu esa kanonik Wnt yo'li sog'lom buyrak to'qimalarida o'chirilgan degan xulosaga kelishi mumkin. Buyrakning patologik sharoitlari natijasida buyrakning epitelial hujayralari kanonik Wnt yo'lining qayta faollashishi bilan bog'liq EMT va fibrozning [50] qayta paydo bo'lishi bilan reaksiyaga kirishishi mumkin [44]. Shuning uchun kasallangan buyraklarda topilgan -tubulin, inversiya va DVL-1 buzilishi asosiy patologik mexanizm bo'lishi mumkin va rivojlanayotgan buyrakda kanonik bo'lmagan Wnt yo'liga o'tish natijasi bo'lishi mumkin, bu esa qaytariladigan buyraklar o'rtasidagi o'tishni nazarda tutadi. zarar. Bundan tashqari, ularning prenatal va postnatal holatidagi o'zgarishlarbuyrakekspressiya shakli kattalarda buyrak funktsiyasining buzilishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin, bu tug'ma kasalliklarga va surunkali buyrak etishmovchiligiga olib keladi.
4. Materiallar va usullar
4.1. Inson namunalari
Homila buyrak to'qimalarining namunalari homiladorlikni yo'qotishdan keyin 14, 15, 16, 22 va 38-GW da Universitet kasalxonasi markazining ginekologiya va akusherlik bo'limida to'plangan. Barcha olingan xomilalik materiallar patolog tomonidan tekshirildi va tadqiqot uchun faqat anormallik, maseratsiya yoki intrauterin o'lim belgilari bo'lmagan va normal kariogrammaga ega bo'lgan to'qimalar ishlatilgan. Namuna olishdan oldin onalarning tibbiy yozuvlari tekshirildi va homiladorlik natijalariga ta'sir qilishi mumkin bo'lgan sog'liq muammolari bo'lsa, buyrak to'qimalari tadqiqotdan chiqarildi. Yetuklik bemorlarning hayz ko'rish kalendarlari bilan bog'liq holda bosh atrofi, qorin atrofi va son suyagi uzunligi [51] bilan aniqlandi. Tasodifiy o'limdan keyin 1.5- va 7- yoshli buyrak to'qimalarining namunalari to'plangan. Namunalar Split universiteti kasalxonasi markazining patologiya bo'limida olingan. Ko'p kistli displastik buyrak to'qimalarining (MCDK) namunalari homiladorlikning yo'qolishidan so'ng, nefrektomiya tufayli fokal segmental glomeruloskleroz (FSGS) va Fin tipidagi nefrotik sindrom (CNF) olingan. Olingan barcha materiallar patolog tomonidan tekshirildi va baholandi, u tashxislarni tasnifladi. Tadqiqot protokoli Xelsinki deklaratsiyasi va uning yangilanishlariga muvofiq Split tibbiyot maktabi universitetining Etika qo‘mitasi tomonidan tasdiqlangan (2016-yil 20-may) (klassifikatsiya raqami: 003-08/16-03/0001, ro'yxatga olish raqami: 2181-198-03-04-16-0024, 2016 yil 20 may) [52].
4.2. Immunogistokimyo
Yig'ilgan to'qimalar namunasi fiksatsiyasi 22 ◦C da 24 soat davomida fosfat tamponlangan sho'r suvda (PBS) 4 foizli paraformaldegid bilan ishlangan. 100% etanolda suvsizlangandan so'ng, namunalar yuqorida aytib o'tilganidek, kerosinga solingan [53]. Namunalar mikrotom yordamida 5 mkm qalinlikdagi bo'laklarga bo'lingan va keyinchalik mikroskop slaydlariga o'rnatilgan. To'qimalarning saqlanishini tekshirish uchun har 10-bo'lim gematoksilin va eozin bilan bo'yalgan [54]. Bo'lim feminizatsiya va immunohistokimyo ilgari tasvirlanganidek amalga oshirildi [2,55,56]. PBS da yuvilgandan so'ng, mikroskop slaydlari bir kechada birlamchi antikorlar bilan nam kamerada 22 ◦C da inkubatsiya qilindi (StainTray slaydni bo'yash tizimi; Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh). Birlamchi antikorlar quyon monoklonal antialfa tubulin antikori (suyultirish 1:1000; ab179484, Abcam, Kembrij, Buyuk Britaniya), quyon poliklonal inversiyaga qarshi antikor (suyultirish 1:100; ab65187, Abcam, Kembrij, Buyuk Britaniya), sichqoncha monoklonal antikorlari edi. -1 antikor (1:150 suyultirish; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, AQSH) va quyon poliklonal anti-gamma tubulin antikori (birlamchi siliyaga xos alfa-bo'yashni tekshirish uchun) tubulin, 1:500 suyultirish; ab11321, Abcam, Kembrij, Buyuk Britaniya). PBSda yuvilgandan so'ng, ikkilamchi antikorlar sanab o'tilgandek bir soat davomida qo'llanildi: eshaklarga quyonga qarshi IgG H&L, Alexa Fluor 488 (suyultirish 1:400; ab150073, Abcam, Kembrij, Buyuk Britaniya) va echkiga qarshi IgG H&L, TRITC (suyultirish). 1:400; ab6786, Abcam, Kembrij, Buyuk Britaniya) 4',6-diamidino-2-fenilindol dihidroxlorid (DAPI) yadrolarni bo'yash uchun ishlatilgan va 2-daqiqa inkubatsiyadan so'ng slaydlar PBS da yuvilgan va o'rnatish muhiti va qoplamalar bilan qoplangan. Birlamchi antikor qo'llashdan oldin protein bloki (ab64226; Abcam, Kembrij, Buyuk Britaniya) yordamida nospetsifik bo'yashning oldi olindi. Salbiy nazorat sifatida adsorbsiyadan oldingi test o'tkazildi, shu bilan birga ikkilamchi antikorlarning o'ziga xosligi birlamchi antikorlarni bo'yash jarayonlaridan chiqarib tashlash orqali tekshirildi.
4.3. Elektron mikroskopiya
Fiksatsiyabuyrakto'qimalar 24 soat davomida 4 foizli paraformaldegidda amalga oshirildi, so'ngra 1 soat davomida 1 foizli osmiy tetroksidda post-fiksatsiya qilindi. Dehidratsiya jarayoni etanol seriyasi bilan amalga oshirildi va LX 112 qatroniga qo'shilishi bilan yakunlandi [22]. Bir mikrometrli yupqa bo'laklar toluidin ko'k yordamida bo'yalgan va ultra yupqa qismlarni tanlash uchun o'rganilgan. Qalinligi 0,05 mikrometr boʻlgan ultra yupqa boʻlaklar uranil asetat va qoʻrgʻoshin sitrat bilan boʻyalgandan keyin tekshirildi. Mikrofotosuratlarni olish uchun JEOL 1200 EX mikroskopi ishlatilgan.
4.4. Genetik tahlil
Oldin ta'riflanganidek [19], periferik qondan leykotsitlar yordamida genomik DNK ajratildi. NPHS1 genida homozigot noto'g'ri mutatsiya topildi (c.1096A > C; p.Ser366Arg), bu Fin tipidagi konjenital nefrotik sindrom (CNF) tashxisini tasdiqladi [57].
CISTANCHE BUYRAK/BUYRAK INFEKTSIONINI YAXSHILADI
4.5. Ma'lumotlarni tahlil qilish
Bo'lim tahlili FL floresan mikroskopida 3 ta FL floresan kanallari (Olympus BX51, Tokio, Yaponiya) yordamida amalga oshirildi. Tasvirlar DP71 raqamli kamerasi (Olimp, Tokio, Yaponiya) tomonidan yuqori quvvatli (×40) kattalashtirishda olingan. Faqatbuyrakproksimal o'ralgan tubulalar (pct), distal burama tubulalar (dct) va glomeruli (g) o'z ichiga olgan korteks qiziqish uyg'otdi. Keyin tasvirlar ImageJ dasturiy taʼminoti (Rasband, WS, ImageJ, AQSh Milliy Sogʻliqni saqlash institutlari, Bethesda, MD, AQSH, https://imagej.nih.gov/ij/ (2018-yil 15-oktabrda kirish), 1997–2021) tomonidan qayta ishlandi. ) va Adobe Photoshop (Adobe Inc., San-Xose, Kaliforniya, AQSh) keyingi baholash uchun. Hujayralarni hisoblashdan oldin, ajratilgan kanallar ImageJ vositasi ishlatilgan. Keyinchalik, signal oqishini oldini olish uchun ImageJ tasvir kalkulyatoridan foydalangan holda, asl immunofluoressensiya mikroskopik fotosurati qizil yoki yashil kanal bilan (asl kanal nima bo'lganiga qarab) olib tashlandi. 50 chegara ostidagi qiymatlar salbiy deb hisoblanadi. Biz har bir bosqichda kamida 20 ta tuzilmali (pct, dct yoki g) hujayralardagi immunoreaktiv signallarni yoki multikistik displastik mikrofotosuratda hujayralarning umumiy ijobiy sonini hisobladik.buyrakto'qimalar, FSGS va CNF. Immunofluoresans signali membrana, sitoplazma yoki yadroning istalgan darajasida to'plangan bo'lsa, ImageJ dasturida pol buyrug'i yordamida o'lchangan 50 qiymatidan yuqori bo'lsa, biz hujayralarni ijobiy deb tasnifladik. Salbiy hujayralar immunoreaktivligi bo'lmagan hujayralar sifatida tasniflangan. Ikki mustaqil tergovchi ma'lumotlarni tahlil qildi.
4.6. Yarim kantitativ tahlil
-tubulin, inversiya va DVL{1}} binoni signalining intensivligi ImageJ dasturidan foydalangan holda ikki mustaqil tadqiqotchi tomonidan baholandi. Signalning umumiy intensivligi tasvir 8-bit turida oʻrnatilgandan soʻng oʻlchandi; keyin markerni bo'yash intensivligi strukturaning belgilangan maydonini o'lchash yo'li bilan 20 pct, dct va g larda baholandi. Agar baholovchilar o'rtasidagi natijalar boshqacha bo'lsa, uchinchi mustaqil tadqiqotchi shubhani aniqladi. -tubulin uchun maksimal signal intensivligi 84,125 ± 3,214 SD, inversiya uchun 71,50 ± 2,715 SD va DVL-1 80,916 ± 1,875 SD edi. Mikroskop fotosuratlarida signal rangining eng yuqori to'yinganligi 3 (signal tasvirining umumiy intensivligining 66,66–99,99 foizi), keyin signalning oraliq intensivligi uchun 2 (33,33–66,66 foiz) va 1 (0,33 foiz -33,33 foiz) bilan belgilandi. past signal intensivligi uchun (1-jadval).
4.7. Statistik tahlil
Bosqichlar va tuzilmalar o'rtasidagi farqlarni aniqlash uchun Kruskal-Uollis testi o'tkazildi, so'ngra GraphPad Prism dasturiy ta'minotidan foydalangan holda Dann post hoc testi o'tkazildi (Graphpad Software Inc., San-Diego Kaliforniya, AQSh, www.graphpad.com (kirish 15 oktyabrda) 2018.)). Ijobiy hujayralar soni o'rtacha qiymat ± standart og'ish (SD) sifatida foizda ifodalangan, statistik ahamiyat esa p <0,05 da="" tan="" olingan.="" tahlil="" qilingan="" tuzilmalar="" soni="" 35="" ta="" namunada="" 4200="" ta="" bo'lib,="" umumiy="" soni="" 135="" 256="" ta="" hujayra="" hisoblangan.="" turli="" rivojlanish="" bosqichlarida="" -tubulin,="" inversiya="" va="" dvl-1="" ifodasidagi="" farqlarni="" sinash="" uchun="" biz="" 2-sidakning="" post="" hoc="" testi="" bilan="" anova="" usulidan="" foydalandik.="" rivojlanish="" vaqtiga="" oid="" protein="" ifodasini="" o'rganish="" uchun="" biz="" chiziqli="" regressiyadan="" foydalandik.="" sog'lom="" odamda="" -tubulin,="" inversiya="" va="" dvl-1="" ifodasidagi="" farqlarni="" o'rganish="" uchun="" bir="" tomonlama="" anova="" va="" keyin="" tukeyning="" post="" hoc="" testi="">buyrakMCDK, FSGS va CNF to'qimalariga nisbatan to'qimalar. MCDK, FSGS va CNF o'rtasidagi oqsillarni ifodalashdagi farqlar 2-ANOVA usuli va keyin Sidakning post hoc testi bilan tekshirildi. Bir tomonlama ANOVA va undan keyin Tukeyning post hoc testi sog'lom nazorat va patologik tekshiruv o'rtasidagi pct siliya uzunligi va epitelial hujayra balandligidagi farqlarni baholash uchun ishlatilgan.buyrakto'qimalar. Ma'lumotlar o'rtacha qiymat ± standart og'ish (SD) sifatida ko'rsatilgan, statistik farq p < 0.05="" da="" tan="">
