Mitoxondriyal oqsillar gipoksik ishemik ensefalopatiyada jismoniy mashqlar xotira, o'rganish va motor faolligini yaxshilaydigan mexanizmni ochib beradi, kalamush modeli 3-qism
Apr 07, 2024
4. Materiallar va usullar
4.1. Hayvonlar va eksperimental guruhlar
Ushbu tadqiqot uchun o'ttiz oltita Sprague-Dawley kalamushlari ishlatilgan. Hayvonlar 22 ± 1◦C haroratda 12 soatlik yorugʻlik/qorongʻu davrlarda saqlangan va oziq-ovqat va suvdan erkin foydalanish imkoniga ega boʻlgan. Eksperimental protseduralar Zhengzhou universitetining hayvonlarni parvarish qilish va tadqiqotlari boʻyicha axloqiy institutsional qoʻmitasining roziligi bilan oʻtkazildi.
Qorong'u tsikl odamlarning tungi uyqu davrini anglatadi va u xotira bilan chambarchas bog'liq. Ko'pchilik uchun yaxshi tungi uyqu jismoniy salomatlik va miya faoliyatini yaxshilaydi. Shu bilan birga, uyqu miyaning xotira jarayoni bilan ham bog'liq.
Biz uxlayotganimizda, tanamiz uyquning turli bosqichlariga kiradi, jumladan tez ko'z harakati (REM) uyqusi va tez bo'lmagan ko'z harakati (NREM) uyqusi. Bu bosqichlar miyaning axborot integratsiyasi va xotira konsolidatsiyasini tartibga solishda muhim rol o'ynaydi.
Aksariyat odamlar uyquning diqqatni jamlash va xotiraga ijobiy ta'sirini his qilishadi. Tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, uyqu xotiralarimizni mustahkamlash va mustahkamlashga yordam beradi va hatto o'rganish qobiliyatimizni yaxshilaydi. Uyqu paytida miya yangi ma'lumotlarni mavjud bilimlar bilan birlashtiradi va shu bilan xotirani saqlash va undan foydalanish qobiliyatini oshiradi.
Aksincha, etarli uyqu etishmasligi xotirani yo'qotish va o'rganishda qiyinchiliklarga olib kelishi mumkin. Uzoq muddatli uyqusizlik tanada va miyada turli muammolarni keltirib chiqarishi mumkin, bu kundalik hayotga va ish qobiliyatiga ta'sir qiladi. Shuning uchun, to'g'ri uyqu strategiyasi va oqilona turmush tarzi yaxshi xotirani saqlash uchun juda muhimdir.
Umuman olganda, qorong'u davrlar va xotira o'rtasida bog'liqlik mavjud. To'g'ri uyqu miya ma'lumotlarini birlashtirish va xotirani mustahkamlashga yordam beradi, uzoq muddatli uyqu buzilishlari esa miya faoliyati va xotirasiga ta'sir qilishi mumkin. Shuning uchun biz kundalik hayotimizda uyqu sifatiga e'tibor qaratishimiz va sog'lom turmush tarzini saqlashimiz, xotiramiz va o'rganish qobiliyatimizni samarali qo'llab-quvvatlashimiz va yaxshilashimiz kerak. Ko'rinib turibdiki, biz xotirani yaxshilashimiz kerak va Cistanche deserticola xotirani sezilarli darajada yaxshilashi mumkin, chunki Cistanche deserticola neyrotransmitterlar muvozanatini ham tartibga solishi mumkin, masalan, atsetilxolin va o'sish omillari darajasini oshirish. Ushbu moddalar xotira va o'rganish uchun juda muhimdir. Bundan tashqari, Cistanche deserticola qon oqimini yaxshilaydi va kislorod yetkazib berishni rag'batlantiradi, bu esa miyaning etarli miqdorda ozuqa va energiya olishini ta'minlaydi va shu bilan miya hayotiyligi va chidamliligini oshiradi.
Xotirani yaxshilashning 10 ta usulini bilish tugmasini bosing
Tajribalar davomida hayvonlar sonini kamaytirish va hayvonlarning azoblanishini minimallashtirish uchun barcha choralar ko'rildi. Hayvonlar tasodifiy to'rtta guruhga bo'lingan (8-rasm). (1) HIE, NT (jismoniy mashqlar o'tkazmasdan gipoksiya-ishemiya-ensefalopatiya guruhi) tug'ruqdan keyingi 7-kuni gipoksik-ishemik ensefalopatiya uchun modellashtirilgan hayvonlardan iborat bo'lib, kuchukchalarni izofluran bilan behushlik qilish (5% induksiya, 1,5% parvarishlash).
Chap umumiy uyqu arteriyasi doimiy ravishda bog'lab qo'yildi va kuchukchalar 92% N2 va 8% O2 gipoksik gaz aralashmasining doimiy oqimi bilan 90 daqiqa davomida gipoksik kameraga o'tkazilgunga qadar 30 daqiqa davomida iliq tiklanish divaniga yotqizildi va keyin 10-haftaga qadar suzish mashqlariga duchor bo'lmasdan qafaslarga qaytdi. (2) HIE, T (jismoniy mashqlar bilan mashg'ul bo'lgan gipoksiya-ishemiya ensefalopatiya guruhi) (1) dagi kabi gipoksik-ishemik ensefalopatiya uchun modellashtirilgan va hayotning 6-haftasigacha qafaslarga qaytarilgan va keyin 90 minutgacha bo'lgan hayvonlardan iborat edi. 4 hafta davomida haftasiga 2 kun dam olish bilan besh kun davomida har kuni suzish mashqlari, (3) SHAM, NT (nazorat guruhi) hech qanday davolanishga duchor bo'lmagan, ammo tug'ruqdan keyingi 1 kundan 10 haftagacha kataklarda normal hayot kechirgan hayvonlarni o'z ichiga oladi. jismoniy mashqlar bo'yicha mashg'ulotlar va (4) SHAM, T hech qanday davolanishga duchor bo'lmagan hayvonlardan iborat edi, lekin tug'ruqdan keyingi kun 1 dan 6 haftagacha qafaslarda normal hayot kechirgan, shundan so'ng ular 4 hafta davomida suzish mashqlarini bajarishgan.
Keyin turli guruhlardagi hayvonlarning miyalari yig'ilib, g'arbiy blot (gippokamp va miya yarim korteksi) va immunofluoresans (motor korteks) uchun tayyorlandi.
4.2. Mashq paradigmasi
Hayvonlar ad libitum oziq-ovqat va suv bilan joylashtirildi va 12-yorug'lik/qorong'i tsiklda saqlanadi. Ular ikki guruhga bo'lingan: harakatsiz hayvonlar (HIE, NT va SHAM, NT) va mashq qiluvchi hayvonlar (HIE, T va SHAM, T). Mashq qiluvchi hayvonlar tug'ruqdan keyingi 6-haftadan so'ng 4 hafta davomida suzish bo'yicha mashg'ulotlardan o'tkazildi; ular haftada 5 kun 2 kun dam olish bilan suzish mashqlarini bajarishdi. Har bir suzish mashg'uloti 90 daqiqa davom etdi. Hayvonlar tank tubiga tegmasligi uchun hovuz 50 sm chuqurlikda to'ldirilgan.
Hayvonlarga hech qanday qo'shimcha yuklamasdan erkin suzishga ruxsat berildi va suzish vaqtida muloyimlik bilan rag'batlantirildi.Mashqdan keyin kalamushlar ehtiyotkorlik bilan quritilgan va kataklarga qaytarilgan.
4.3. Vertica! Qutbli motor sinovi
Har bir guruhdagi hayvonlar birin-ketin yuzlari yuqoriga qarab mato lenta bilan qoplangan ustunga (diametri 3,{3}} sm va uzunligi 150 sm) joylashtirildi, u gorizontal holatda ushlab turildi, so'ngra asta-sekin yuqoriga ko'tarildi. vertikal holatda va kalamushning ustunda qolgan vaqti maksimal 2 minut (120 s) qayd etilgan. Ushbu testda harakatni muvofiqlashtirish va muvozanatda nuqsoni bo'lgan hayvon qutbdan tushadi.
4.4. Morris suv labirint testi (MWM)
Kalamushlar (10 haftalik) 4 haftalik mashqlar o'rgatish protokolidan (SHAM, 'T va HlE, T) o'tgandan so'ng MWMga duchor bo'lishdi. Barcha suv labirintlari ma'lumotlari Panjab SMART video kuzatuv tizimi (Panlab Howo Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.) (Shanxay, Xitoy) yordamida qayd etilgan. MWM l32 tomonidan tasvirlanganidek ishlatilgan. Qisqacha aytganda, kalamushlar yashirin platformaga etib borish va suvdan qochish uchun suzish havzasi chegaralariga joylashtirilgan vizual belgilardan foydalanganlar. O'rganish 7 kun davomida baholandi. O'rganishni baholashdan oldin, kalamushlar toza suv va ko'rinadigan platformaga ega hovuzga kiritildi. Trening davomida kalamushlarga topshiriq bilan tanishish uchun sinov suzish mashqlari berildi.
O'rganish bosqichida kalamushlar videoni kuzatishni osonlashtirish uchun qora bo'yoq bilan bo'yalgan va platforma suvga botgan. Har bir kalamush turli boshlang'ich nuqtalardan (kvadrantlar) to'rtta sinovdan o'tkazildi. Kechikish yoki platformaga kirish uchun zarur bo'lgan vaqt har kuni Panlab SMART video kuzatuv tizimi tomonidan qayd etilgan. Tajribaning so'nggi kunida platforma olib tashlandi va har bir kalamush suvga qayta kiritildi, hayvonlarning platformani (nishon kvadrantini) o'z ichiga olgan kvadrantdagi yashirin platforma joyini necha marta kesib o'tganligi qayd etildi.
4.5. Western Blotting
Protein darajasidagi tajriba uchun har bir guruhdan oltita kalamush tasodifiy tanlangan. Proteinlar gipokampus va korteksdan ekstraksiya qilindi va RIPA reaktivida (CW2333S, CoWin Biosciences, Kembrij, MA, AQSh) gomogenlashtirildi va sitoplazmik va yadro oqsillariga ajratildi. Protein kontsentratsiyasi bicinchoninicacid assay (BCA) (CW0014S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, AQSH) yordamida aniqlandi va jami 20 g oqsil universal SDS-PAGE jellarida (CFAS AnyKD PAGE) № PE008 elektroforez orqali ajratildi, Zhonghui Hecai Bio-farmatsevtika texnologiyasi Co., Ltd., Shaanxi, Xitoy.
Keyin oqsillar poliviniliden ftorid membranalariga (PVDF) (R1CB12934, Merck Millipore Ltd., (Burlington, MA, AQSh)) 5% sigir zardobi albumini (BSA) (#A8020, Solarbio Life Sciences) bilan membranalar 2 soat davomida bloklandi. , Pekin, Xitoy) xona haroratida va Cell Signaling Technology (Danvers, MA, AQSH) dan quyidagi asosiy antikorlar bilan inkubatsiya qilingan: AIF (D39D2, 1:1000), Sitokrom C (136F3, 1:1000), parchalangan kaspaza{{ 13}} (Asp175, 1:1000), Smac/Diablo (D553R, 1:1000) va OPA1 (D7C1A,1:1000).
GAPDH, Servicebio, Wuhan, Xitoy (GB11002, 1:2000) va H3 Proteintechdan (17168-1-AP, 1:1000) tunda 4 ◦C da, keyin esa Proteintectdan HRP-konjugatsiyalangan ikkinchi antikor SA00001-2 (1:5000) xona haroratida 2 soat davomida inkubatsiya. Protein chiziqlari Affinity Biosciences dan #KF005 takomillashtirilgan xemiluminesans to'plami bilan tasvirlangan va Bio-Image Analysis tizimi (Chjenchjou universiteti, Chjenchjou, Xitoy) bilan tasvirlangan. Protein tasmasi intensivligining GAPDH (sitoplazmik oqsillar) va H3 (yadro oqsillari) ga nisbati ichki havolalar sifatida ImageJ yordamida aniqlandi.
4.6. Immunofluoresans
Miya to'qimalarining {0}} mkm koronal bo'laklari immunofluoresans uchun muzlatish mikrotomi (Leica, Germaniya) yordamida olingan. Slaydlar 2 soat davomida 10% xomilalik sigir zardobi bilan PBS bilan bloklandi (#A8020, Solarbio Life Sciences, Pekin, Xitoy) va 0,3% Triton ×-100, Amresco 0694, Biosharp, Estoniya xona haroratida va keyin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, AQSh) birlamchi antikorlari bilan inkubatsiya qilingan: anti-AIF, D39D2 (1:400 suyultirish), anti-sitoxrom C, 136F3 (1:200 suyultirish), parchalanishga qarshi kaspaza-3 , Asp175 (suyultirish 1:400), anti-Smac/Diablo, D553R (1:200 suyultirish) va anti-OPA1, D7C1A (1:400 suyultirish) kechada 4 ◦C da.
Keyin slaydlar har biri 10 daqiqa davom etadigan PBS da 3 marta yuvildi va keyin ikkilamchi antikorlar (ab150077, Abcam, Kembrij biotibbiyot kampusi, Kembrij, Buyuk Britaniya) bilan qorong'uda xona haroratida 2 soat davomida inkubatsiya qilindi.DAPI, #C0065 Solarbio Life'dan Sciences, Pekin, Xitoy (1:100PBS) 5 daqiqaga qo'shildi va to'kildi, har biri 5 daqiqa davomida PBSda 3 marta yuvildi, quritildi, söndürmega qarshi vosita qo'shildi (#P0126, Beyotime Biotechnology, Shanxay, Xitoy), shisha sliplar slaydlarga o'rnatildi va namunalar 2 soat davomida -20 ◦C da saqlangan va mikroskopik ko'rish uchun olingan. To'qimalar tasvirlari konfokal floresan mikroskop (Ni-U942877, Nikon, Tokio, Yaponiya) va tasvirlarni ifodalovchi tasvirlar yordamida olingan. motor korteksidagi oqsillar keyinchalik [33] da tasvirlanganidek FIJI-ImageJ yordamida miqdori aniqlandi.
4.7. Statistik tahlil
Barcha tahlillar uchun Windows uchun GraphPad Prism 8.0.0 versiyasi (GraphPad Software, San-Diego, CA, AQSH) ishlatilgan. Statistik ahamiyatlilikni o'lchash uchun mos ravishda bir tomonlama ANOVA va Dunnettning post hoc testlari ishlatilgan. Natijalar o'rtacha ± SEM sifatida taqdim etilgan va p < 0.05 statistik jihatdan ahamiyatli deb hisoblanadi.
5. Xulosalar
Ushbu tadqiqot shuni ko'rsatadiki, suzish mashqlari Cyto.C/cleaved kaspaza-3 va AIF signalizatsiya yo'llari orqali mitoxondriyal apoptozni bostirish orqali HIE bilan bog'liq bo'lgan vosita faolligini, xotirani va o'rganishni yaxshilagan. Bundan tashqari, suzish mashqlari aralashuvi HIE bo'lgan kalamushlarda Smac/Diablo va OPA1 ning teskari o'zgarishi bilan tasvirlangan mitoxondriyal kristallar va membrana potentsialini barqarorlashtirishi ko'rsatilgan. Natijada, bu HIE va natijada paydo bo'lgan kamchiliklarni samarali boshqarish uchun manipulyatsiya qilinishi mumkin bo'lgan ko'proq molekulyar yo'llarni ochish uchun qo'shimcha tadqiqotlar uchun jozibali va hayotiy asosdir. Bu tadqiqot mitoxondriyadagi tarkibiy va funktsional nuqsonlarni bartaraf etishda mashqlarning rolini muvaffaqiyatli ko'rsatdi. HIE tomonidan u mitoxondriyal kristallarning barqarorlashuvini aniqlash uchun barcha mumkin bo'lgan usullarni ishlatmadi; Bu ushbu mavzu bo'yicha kelajakdagi tadqiqotlar uchun juda muhimdir.
Muallif hissalari: kontseptsiya, FG, FP, YW va CC; ma'lumotlar kuratsiyasi, FG, FP, YW,HL va JF; rasmiy tahlil, FG, HL va CC; moliyalashtirishni sotib olish, CC; tergov, FG, FP, YW, HL va JF; metodologiya, FG, FP, YW va CC; loyiha boshqaruvi, FG, YW va CC; resurslar, CC; dasturiy ta'minot, FG, FP, JF va CC; nazorat, CC; tekshirish, FG, FP, YW, HL va CC; vizualizatsiya, FG, FP, YW, HL va JF; yozish – asl qoralama, FG va YW;yozma – ko‘rib chiqish va tahrirlash FG va HL.
Moliyalashtirish: Ushbu tadqiqot Henan viloyati Fan va Texnologiya Departamentining Ilmiy va texnologik tadqiqot loyihasi (Grant № 212102310217) va Xitoy Milliy Tabiiy Fanlar Jamg'armasi (Grant № 81401015) granti tomonidan qo'llab-quvvatlanadi.
Tashkilotlarni ko'rib chiqish kengashi bayonoti: Tadqiqot Zhengzhou universiteti tadqiqot hayvonlarini parvarish qilish qo'mitasining ko'rsatmalariga muvofiq o'tkazildi; ZZUIRB2022-32.
Axborotlangan rozilik bayonoti: qo'llanilmaydi.
Ma'lumotlar mavjudligi to'g'risidagi bayonot: qo'llanilmaydi.
Manfaatlar to'qnashuvi: Mualliflar manfaatlar to'qnashuvi yo'qligini e'lon qilmaydi.
Ma'lumotnomalar
1. Li, B.; Konseptsion, K.; Meng, X.; Zhang, L. Perinatal hipoksik-ishemik miya shikastlanishida miya-immun o'zaro ta'siri. Prog. Neurobiol.2017, 159, 50-68. [CrossRef]
2. Duglas-Eskobar, M.; Vayss, MD Gipoksik-ishemik ensefalopatiya: Klinisyen uchun sharh. JAMA Pediatr. 2015, 169, 397–403.[CrossRef] [PubMed]
3. Qora, RE; Cousens, S.; Jonson, HL; Lawn, J.; Rudan, I.; Bassani, D.; Ja, P.; Kempbell, H.; Walker, CF; Cibulskis, R.; va boshqalar. 2008 yilda bolalar o'limining global, mintaqaviy va milliy sabablari: tizimli tahlil. Lancet 2010, 375, 1969–1987. [CrossRef]
4. Juul, SE; Ferriero, DM Neonatal miya shikastlanishida farmakologik neyroprotektiv strategiyalar. Klin. Perinatol. 2014, 41, 119–131.[CrossRef]
5. Chju, C.; Rodriges, JI; Li, T.; Syu, Y.; Sun, Y. Perinatal hipoksik-ishemik miya shikastlanishida apoptoz qo'zg'atuvchi omilning roli. NeuralRegen. Res. 2021, 16, 205–213. [CrossRef] [PubMed]
6. Song, S.-H.; Ji, Y.-S.; Ko, I.-G.; Li, S.-V.; Sim, Y.-J.; Kim, D.-Y.; Li, S.-J.; Cho, YS Treadmill mashqlari va g'ildirak mashqlari miya yallig'lanishi kalamushlarida apoptotik neyron hujayralari o'limini bostirish orqali motor funktsiyasini yaxshilaydi. J. Mashq. Reabilitatsiya. 2018, 14, 911–919.[CrossRef]
7. Kelli, M.; Darrah, J. Miya falajli bolalar uchun suv mashqlari. Dev. Med. Bola. Neyrol. 2005, 47, 838–842. [CrossRef]
8. Myuller, P.; Dudershtadt, Y.; Lessmann, V.; Myuller, NG Laktat va BDNF: Jismoniy mashqlar natijasida kelib chiqqan nevroplastiklikning asosiy vositachilari? Klin. Med. 2020, 9, 1136. [CrossRef]
9. Intlekofer, KA; Cotman, CW mashqlari qarish va Altsgeymer kasalligida hipokampal funktsiyaning pasayishiga qarshi turadi. Neurobiol.Dis. 2013 yil; matbuotda. [CrossRef]
10. Real, C.; Ferreyra, A.; Chaves-Kirsten, G.; Torrao, A.; Pires, R.; Britto, L. BDNF retseptorlari blokadasi Parkinson kasalligining kalamush modelida mashq qilishning foydali ta'siriga to'sqinlik qiladi. Neuroscience 2013, 237, 118–129. [CrossRef]
For more information:1950477648nn@gmail.com
